下調(diào)基因PTTG1對人膠質(zhì)瘤細胞SHG44增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響

崔立山，林 婷，徐嵐溪，王冠玲，林建斌，馮三平，曹 洋，曹 穎，宋正茂，金 鑫

1.廈門市第五醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 廈門 361101；

2.廈門大學醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學部，福建 廈門 361102

腦膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占成人顱內(nèi)腫瘤的35%～60%，其中惡性膠質(zhì)瘤約占60%。其在臨床上具有預后差、病死率高等特點[1]。在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中存在多種基因的連鎖改變，這些改變最終使得膠質(zhì)瘤細胞獲得無限增殖的生長優(yōu)勢，從而促進腫瘤發(fā)生。

垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1（pituitary tumor-transforming gene 1，PTTG1）首先由Pei等[2]在小鼠垂體腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，是一種致癌基因。PTTG1高表達于幾乎所有已經(jīng)研究過的腫瘤細胞（包括肝癌、肺癌、白血病、乳腺癌及結(jié)腸癌等）[3]。其在腫瘤發(fā)生中的作用機制主要涉及細胞轉(zhuǎn)化、非整倍體細胞分裂、細胞凋亡和影響腫瘤微環(huán)境的形成[4]。研究發(fā)現(xiàn)，PTTG1的表達與膠質(zhì)瘤的病理學分級、腫瘤微血管密度呈正態(tài)分布[5]。目前國內(nèi)外關(guān)于PTTG1基因表達與多種臨床常見惡性腫瘤的病理學類型、癌細胞的增殖活性及生物學特性等方面的研究已較為完善[6]。但是有關(guān)PTTG1是否影響惡性膠質(zhì)瘤細胞的多種生物學特性，如增殖、凋亡、遷移和侵襲等的研究較少，且作用機制尚不明確。

無限增殖、遷移和侵襲是腫瘤細胞特有的惡性生物學行為。研究發(fā)現(xiàn)，惡性膠質(zhì)瘤細胞在獲得無限增殖能力的同時，在轉(zhuǎn)移過程中依靠其極強的侵襲能力，侵入淋巴管、血管，從而侵入其他組織與器官，形成腫瘤的轉(zhuǎn)移病灶，使其惡性程度加深[7]。大量研究表明，PTTG1 mRNA在多種腫瘤細胞中呈現(xiàn)高表達趨勢，并且與腫瘤細胞的惡性生物學行為緊密相關(guān)[7]。本研究使用PTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染SHG44細胞，旨在研究下調(diào)PTTG1表達對惡性膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，從而探索治療膠質(zhì)瘤的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

SHG44細胞株購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及DMEM高糖培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；PTTG1 siRNA、陰性對照siRNA及轉(zhuǎn)染試劑均購自廣州市銳博生物科技有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)試劑均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）相關(guān)試劑均購自德國Millipore公司；PTTG1抗體購自美國Sigma公司；細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Transwell小室（直徑6.5 mm，孔徑8 μm）和基底膜基質(zhì)膠購自美國Corning公司。

1.2 儀器

PCR儀購自德國Biometra公司；實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）儀購自美國ABI公司；電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；全自動圖像工作站購自美國Kodak公司；多功能酶標儀購自美國Thermo Scientific公司；流式細胞儀購自美國Beckman公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 RTFQ-PCR

使用TRIzol從SHG44細胞提取總RNA，根據(jù)說明書將1 μg總RNA加入20 μL混合體系中進行反轉(zhuǎn)錄。用于PCR擴增的寡核苷酸引物：PTTG1的正義鏈為5’-ACCCGTGTGGTTGCTAAGG-3’，反義鏈為5’-ACGTGGTGTTGAAACTTGAGAT-3’；GAPDH的正義鏈為5’-CTGGGCTACACTG AGCACC-3’，反義鏈為5’-AAGTGGTCGTTG AGGGCAATG-3’。PCR反應(yīng)體系擴增條件：94 ℃變性45 s，退火45 s，循環(huán)40次，最后72 ℃延伸45 s。按照RTFQ-PCR檢測試劑盒(TaqMan?2×Universal PCR Master Mix，No Amp Erase?UNGb)的說明進行實驗，整個操作在冰上進行，注意避光。PCR結(jié)束后得到擴增曲線和Ct值，基因差異表達水平用2-ΔΔCt方法計算：ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組

1.4 Western blot

提取SHG44細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃冰箱溫育過夜，洗膜，室溫溫育二抗，ECL試劑盒顯影。使用Image Station 4000R軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖能力

為了評估基因PTTG1對細胞增殖的影響，根據(jù)試劑說明書使用CCK-8測定。將SHG44細胞接種到96孔板中，24 h后換100 μL新鮮培養(yǎng)基。PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細胞。分別于轉(zhuǎn)染后的0、24、48和72 h向細胞培養(yǎng)液中加入10 μL的CCK-8，再溫育3 h，在450 nm處檢測吸光度（D）值，計算細胞活力。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將細胞接種至12孔板中，PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細胞。24 h后收集細胞，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，使用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。

1.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

用無血清培養(yǎng)基將細胞接種至6孔板中，PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細胞。24 h后用10 μL移液管尖端刮擦細胞，并在劃痕0、6、12和24 h后，用倒置顯微鏡進行拍攝，觀察劃痕中細胞的覆蓋情況，即細胞的遷移能力，用Image J軟件測量統(tǒng)計。

1.8 Transwell檢測細胞侵襲能力

PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染SHG44細胞24 h，然后將SHG44細胞用無血清培養(yǎng)基重懸，并在鋪有基底膜基質(zhì)膠的Transwell上室中接種。在下室中加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h后，用棉簽刮下未遷移的膜上表面的細胞，用4%多聚甲醛溶液固定遷移到下表面的細胞，用結(jié)晶紫試劑染色。將小室翻轉(zhuǎn)后置于倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)；實驗重復3次，取其均數(shù)作為這個小室的侵襲細胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用Graphpad Prism 5.0軟件進行分析。實驗結(jié)果以±s表示，多組間比較采用one-way ANOVA，兩組間比較采用非配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA可以顯著抑制PTTG1基因和蛋白的表達

為了證實siRNA能否抑制SHG44細胞PTTG1基因和蛋白的表達，我們將PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染SHG44細胞，24 h后通過RTFQ-PCR和Western blot檢測PTTG1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達，確認沉默效果。同時設(shè)立了未轉(zhuǎn)染細胞組（blank組）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，blank組與陰性對照siRNA組蛋白和mRNA水平均無顯著差異；PTTG1 siRNA能夠明顯抑制PTTG1 mRNA的表達（圖1A），同時明顯降低PTTG1蛋白水平（圖1B、C）。沉默效率約為37%。

圖1 PTTG1 siRNA的沉默效率Fig.1 PTTG1 siRNA silencing efficiency

2.2 下調(diào)PTTG1的表達能夠明顯抑制SHG44細胞增殖能力

無限增殖是惡性膠質(zhì)瘤細胞特征性生物學行為之一，根據(jù)CCK-8說明書進行操作，在450 nm處測量D值，計算細胞活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于陰性對照組，PTTG1 siRNA組在24、48和72 h處的細胞活力明顯下降（圖2）。這說明下調(diào)PTTG1的表達可明顯抑制SHG44細胞增殖能力。

圖2 下調(diào)PTTG1能夠明顯抑制SHG44細胞增殖能力Fig.2 Inhibition of PTTG1 can suppress the proliferative ability of SHG44 cells

2.3 下調(diào)PTTG1的表達能夠明顯促進SHG44細胞凋亡

用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡情況。雙色散點圖中綠色熒光FITC為橫坐標，紅色熒光PI為縱坐標?；罴毎麅H有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色（圖3A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對照組的活細胞比例為（88.430±1.486）%，PTTG1 siRNA組的活細胞比例為（80.700±1.966）%，與陰性對照組相比顯著下降（圖3B）；陰性對照組早期凋亡細胞比例為（2.103±0.743）%，PTTG1 siRNA組早期凋亡細胞比例為（6.707±2.448）%，有所上升（圖3C）；陰性對照組晚期凋亡細胞比例為（5.205±0.956）%，PTTG1 siRNA組晚期凋亡細胞比例為（8.987±0.665）%，明顯上升（圖3D）。這說明下調(diào)PTTG1的表達能夠明顯促進SHG44細胞凋亡。

圖3 下調(diào)PTTG1的表達能夠明顯促進SHG44細胞凋亡Fig.3 Inhibition of PTTG1 can increase the apoptosis of SHG44 cells

2.4 下調(diào)PTTG1的表達能夠明顯抑制SHG44細胞遷移能力

用劃痕實驗測定細胞遷移能力。結(jié)果顯示，0 h時陰性對照組劃痕面積為（83.680±5.740）mm2，PTTG1 siRNA組劃痕面積為（85.710±2.624）mm2。24 h后陰性對照組劃痕出現(xiàn)愈合（圖4A），面積為（65.690±2.784）mm2；PTTG1 siRNA組劃痕面積為（79.130±2.797）mm2，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（圖4B）。這表明下調(diào)PTTG1的表達能抑制SHG44細胞遷移能力。

圖4 下調(diào)PTTG1的表達能夠明顯抑制SHG44細胞遷移能力Fig.4 Inhibition of PTTG1 can suppress the migration ability of SHG44 cell

2.5 下調(diào)PTTG1的表達能夠明顯抑制SHG44細胞侵襲能力

腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移過程中通過其極強的侵襲能力，侵入淋巴管、血管、其他組織及器官，形成腫瘤的轉(zhuǎn)移病灶，使得其惡性程度加深。為了觀察抑制PTTG1的表達能否降低SHG44細胞侵襲能力，利用Transwell小室測定細胞侵襲能力。結(jié)果顯示，陰性對照組細胞穿膜數(shù)量為67.500±4.372，PTTG1 siRNA組細胞穿膜數(shù)量為26.330±1.406（圖5A、B）。這說明下調(diào)PTTG1的表達能夠明顯抑制SHG44細胞侵襲能力。

圖5 下調(diào)PTTG1表達能夠明顯抑制SHG44細胞侵襲能力Fig.5 Inhibition of PTTG1 can suppress the invasion ability of SHG44 cells

3 討 論

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤[8]，兒童和中年人為患病的高危人群[9]。臨床上較常見的治療方法是手術(shù)切除和輔助化療，然而這些治療方法對于惡性膠質(zhì)瘤而言效果不佳[10]。因此尋找更好的治療方法勢在必行。隨著現(xiàn)代生命科學的發(fā)展，膠質(zhì)瘤中涉及重要基因的功能及癌變過程中激活的信號通路為揭示膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的本質(zhì)，以及腫瘤的治療帶來新思路[11]。

PTTG1是一種細胞轉(zhuǎn)化因子[12]，在細胞轉(zhuǎn)化、增殖和腫瘤形成中起著重要作用。在正常人體內(nèi)，PTTG1在睪丸和胸腺組織中表達最高，但在其他組織（如脾臟、腦組織、胰腺、心臟及肝臟等）中低表達或無表達。但當這些組織發(fā)生癌變時，PTTG1呈現(xiàn)高表達趨勢[13]。在腫瘤形成過程中，PTTG1可以在以下方面發(fā)揮作用：① 在細胞轉(zhuǎn)化過程中，PTTG1可以在缺乏相關(guān)輔助刺激因子的情況下獨立誘導細胞轉(zhuǎn)化，促進增殖；②PTTG1導致細胞染色體以非整倍體方式分裂，誘導腫瘤形成；③PTTG1的高表達可以刺激成纖維細胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子分泌，促進血管生成[5，14]。

研究發(fā)現(xiàn)PTTG1過表達可以誘導裸鼠細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤形成，并且與惡性腫瘤的高侵襲性密切相關(guān)[15]；下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中PTTG1的表達，不僅能有效地降低其侵襲性，還能提高惡性膠質(zhì)瘤患者的生存率。因此我們推測PTTG1是與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要標記基因。

本研究采用CCK-8進行細胞增殖活力的測定，結(jié)果表明，PTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞SHG44在24、48和72 h的增殖活力顯著低于對照組，表明PTTG1低表達抑制了SHG44細胞增殖能力。進一步通過劃痕實驗和Transwell小室實驗證實，降低PTTG1的表達可顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲能力。此外，為了進一步證實PTTG1對惡性膠質(zhì)瘤細胞生物學特性的影響，我們采用流式細胞術(shù)檢測了SHG44細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，PTTG1沉默后早期凋亡和晚期凋亡細胞數(shù)均有所增加，活細胞數(shù)量顯著減少。以上結(jié)果均提示，PTTG1作為有效靶點參與了膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲過程，但相關(guān)機制仍需進一步研究。

綜上所述，我們使用siRNA干擾技術(shù)沉默SHG44細胞中PTTG1基因，抑制其表達，觀察其對膠質(zhì)瘤細胞SHG44增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTTG1 siRNA能夠明顯抑制PTTG1 mRNA和蛋白的表達，并且顯著降低細胞的增殖、遷移及侵襲能力，增加細胞凋亡。因此，下調(diào)PTTG1的表達可以降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡化程度，有望為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供了新的思路。