肺腺癌中ALK基因重排的檢測(cè)*

倪瑾瑤，陳曉湖，繆成鋒，徐菲菲，陳國(guó)榮，蔡國(guó)平

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000)

肺癌是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤,每年新發(fā)病例約182萬[1]。在男性和女性中，發(fā)病率分別居于前列腺癌和乳腺癌之后,位列各類腫瘤第二位，而死亡率則排第一[2]。肺癌中，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占絕大多數(shù)，約為85%[3]。肺腺癌約占NSCLC的一半，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[4]。肺腺癌的傳統(tǒng)治療方法有手術(shù)治療和化療等。近年來，靶向治療在臨床上取得不錯(cuò)的療效而受到廣泛關(guān)注。靶向治療是指在細(xì)胞分子水平上，針對(duì)已經(jīng)明確的致癌位點(diǎn)來設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，藥物進(jìn)入體內(nèi)特異性地殺傷癌細(xì)胞[5]。目前，已知約有20多種靶向治療的靶點(diǎn)，即發(fā)生突變的癌基因或者抑癌基因，比如表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)[6]、間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase,ALK)[7]和鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,Kras)[8]等。

ALK基因是一個(gè)重要靶點(diǎn)，獨(dú)立于EGFR和KRAS等基因[9]。ALK屬于胰島素受體家族成員，由1620個(gè)氨基酸組成，包括細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4(echinoderm microtubule-ass℃iated protein like 4,EML4)，主要有3部分，包括N末端堿基區(qū)、棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白區(qū)以及WD重復(fù)區(qū)。EML4-ALK是ALK基因重排最常見的一種形式,是由于2號(hào)染色體短臂發(fā)生倒位所致，N-末端的EML4與胞內(nèi)ALK激酶相融合，促進(jìn)了嵌合酪氨酸激酶的表達(dá)。小分子藥物克唑替尼為ALK基因靶向藥物，能夠特異性靶向抑制ALK基因，也能夠抑制c-MET基因，已被批準(zhǔn)用于ALK基因陽性的肺癌患者的治療。針對(duì)ALK基因抑制劑的應(yīng)用，ALK基因重排的檢出具有重大意義，如何選擇一種簡(jiǎn)便、迅速、經(jīng)濟(jì)的方法成為困擾臨床的問題。

目前，ALK基因重排檢測(cè)常用的方法有熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、免疫組化(immunohistochemistry，IHC)等[10]。FISH是國(guó)際上公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，該技術(shù)相對(duì)快速、標(biāo)準(zhǔn)化，但比較昂貴，并且專業(yè)化要求較高。相對(duì)來說，IHC是一種快速、相對(duì)經(jīng)濟(jì)的方法，而在IHC基礎(chǔ)上發(fā)展起來的Ventana IHC相對(duì)來說更方便、快捷。Ventana IHC的實(shí)驗(yàn)成本較低，目前國(guó)內(nèi)收費(fèi)大約是FISH的1/4,而且，Ventana IHC操作簡(jiǎn)便，染色時(shí)間短(約4 h)，判斷標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一。本實(shí)驗(yàn)以肺腺癌患者為研究對(duì)象，分別采用FISH和Ventana IHC檢測(cè)ALK基因的表達(dá)，比較兩者檢出率，旨在探討Ventana IHC是否能成為首選初篩手段，降低患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2013年1月至2015年6月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科診斷的肺腺癌病例，隨機(jī)選取手術(shù)切除標(biāo)本，總共200例(年齡38～80歲，平均63.33歲)，在手術(shù)治療前均未經(jīng)化療。將選擇的石蠟組織制備成組織芯片。通過病案系統(tǒng)查詢患者的臨床信息，包括年齡、性別、吸煙史等，同時(shí)查閱病理取材記錄及病理報(bào)告，記錄腫瘤大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。肺腺癌的分期根據(jù)TNM分期。肺腺癌的病理分級(jí)根據(jù)2015年WHO和2011年IASLC/ATS/ERS肺癌分類。

1.2 主要試劑

ALK基因重組檢測(cè)試劑盒(Abbott公司，美國(guó))、Ventana ALK IHC試劑盒(Roche Diagnostics Gmbh，德國(guó))

1.3 Ventana IHC

組織芯片切片(4 μm厚)，并將其裝載于帶正電的玻璃載玻片上，烤片后，配合Ventana ALK IHC試劑盒，使用羅氏公司Benchmark XT全自動(dòng)免疫組化染色儀進(jìn)行染色，染色方法參照廠家試劑盒說明書。檢測(cè)結(jié)果由兩名資深病理醫(yī)生獨(dú)立觀察和評(píng)定，判斷標(biāo)準(zhǔn)按照說明書采取二元法判讀：異常ALK蛋白表達(dá)位置在細(xì)胞漿，腫瘤胞漿表現(xiàn)出很強(qiáng)的顆粒狀胞漿信號(hào)(任何百分比)，即ALK陽性；腫瘤細(xì)胞胞漿無染色，則為ALK陰性。

1.4 熒光原位免疫雜交(FISH)

組織芯片切片(4 μm厚)，60℃烤片2 h，二甲苯脫蠟、酒精脫水，空氣干燥。預(yù)處理液硫氰酸鈉80℃處理(12±3)min，室溫純水3 min，擦干切片，預(yù)溫酶溶液至37℃，預(yù)溫1 h后使用，浸沒組織切片(20±2)min，室溫純水3 min，經(jīng)70%、85%、100%乙醇脫水各1 min，吸水紙擦干，空氣干燥，在樣本區(qū)域加入10 μl，添加蓋玻片，以封片膠固定，在原位雜交儀(STATSPIN公司)中經(jīng)過73℃變性3 min，37℃雜交18 h，雜交后于洗液Ⅰ和洗液Ⅱ中洗脫，風(fēng)干后加入10 μl DAPI，蓋好蓋玻片。由兩名病理醫(yī)師在熒光顯微鏡油鏡下用橙綠雙通濾光片獨(dú)立觀察。在正常細(xì)胞核中，ALK雙色分離探針雜交后，會(huì)產(chǎn)生1個(gè)橙色、綠色融合信號(hào)或者相鄰的橙綠信號(hào)，為細(xì)胞陰性；當(dāng)細(xì)胞核中存在ALK基因斷裂異位時(shí)，會(huì)表現(xiàn)為一組橙色和綠色熒光信號(hào)分離的距離超出兩個(gè)信號(hào)半徑大小，或者表現(xiàn)為單獨(dú)存在的一個(gè)橙色熒光信號(hào)且不伴有相應(yīng)的綠色熒光信號(hào)，為細(xì)胞陽性。標(biāo)本FISH判斷標(biāo)準(zhǔn)：至少觀察50個(gè)腫瘤細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)目<10%為陰性，>50%為陽性，10%～50%換人重新計(jì)算，前后陽性細(xì)胞相加算百分比，<15%為陰性，≥15%陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。存在ALK融合基因的病例與臨床病理因素的關(guān)系，采用t檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。

2 結(jié)果

200例肺腺癌病例中，Ventana IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5.5%(11/200)的患者發(fā)生ALK基因重排(圖1),FISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4.5%(9/200)的患者發(fā)生ALK基因重排(圖2)。其中，2例患者表現(xiàn)為FISH(-)、Ventana IHC(+)，1例經(jīng)外院基因檢測(cè)，為EGFR陽性，服用凱美鈉，效果良好，另1例未做過基因檢測(cè)，我們進(jìn)一步予RT-PCR檢驗(yàn)，結(jié)果為ALK陰性，因此最終判定這兩例病例未發(fā)生ALK基因重排。根據(jù)最終的FISH檢測(cè)結(jié)果，ALK陽性總計(jì)9例，陽性率為4.5%(9/200)，則Ventana IHC的敏感性和特異性分別為100%和98.95%，F(xiàn)ISH 和Ventana IHC之間的一致性為99%。

200例病例中，ALK 陽性病例與ALK 陰性病例相比，在年齡、性別、腫瘤大小、吸煙史、病理分期等方面，均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。9個(gè)ALK陽性病人中，以腺泡為主型腺癌5例，伴粘液的實(shí)體為主型腺癌2例，乳頭狀為主型腺癌1例，浸潤(rùn)性粘液腺癌1例。其中有6例病例伴有印戒細(xì)胞，3例病例不伴有印戒細(xì)胞(圖3)。

3 討論

肺癌分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和NSCLC，NSCLC占絕大多數(shù)，約為85%[3]。肺腺癌約占NSCLC的一半，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[4]。近年來，EGFR等驅(qū)動(dòng)基因突變?yōu)榘悬c(diǎn)的新型酪氨酸激酶抑制劑在肺腺癌的治療中取得了重大突破，為患者帶來新的曙光。繼EGFR后，研究者又發(fā)現(xiàn)另一靶點(diǎn)：EML4-ALK[9]。雖然ALK基因突變率非常低，大約是3%～6.7%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肺癌中EGFR突變率，但是，ALK抑制劑(克唑替尼)在ALK基因突變的患者中取得良好的療效[11]。第50屆美國(guó)ASCO年會(huì)中研究人員報(bào)告，在ALK基因突變的肺腺癌治療中，克唑替尼對(duì)比含鉑化療藥的療效顯示：接受克唑替尼或者含鉑化療藥物治療的343例ALK基因突變患者中，克唑替尼治療組和含鉑化療藥物治療組對(duì)比結(jié)果為ORR 74%vs49%，PFS 10.9vs7.0，驗(yàn)證了克唑替尼靶向治療的有效性。在臨床中，肺癌晚期病人使用克唑替尼之前，大多需要FISH技術(shù)檢測(cè)ALK基因是否突變。然而，F(xiàn)ISH技術(shù)要求高、價(jià)格昂貴以及耗時(shí)。相反地，Ventana IHC 染色時(shí)間短，鏡下組織結(jié)構(gòu)清晰，對(duì)比明顯，二元判讀，敏感性高，檢測(cè)花費(fèi)低，實(shí)用性更強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ventana IHC共有11例陽性，而FISH 有9例，有兩例結(jié)果不一致。1例病例查閱資料發(fā)現(xiàn)患者已經(jīng)做過基因檢測(cè)，為ALK陰性，EGFR陽性，目前服用凱美鈉，效果良好。另1例未做過檢測(cè)，遂我們進(jìn)一步做了RT-PCR，結(jié)果顯示為ALK陰性，因此最后確認(rèn)ALK陽性有9例。ALK基因突變率非常低，為3%～6.7%[9]，本實(shí)驗(yàn)中ALK陽性率為4.5%，也是比較接近的。

本次研究中，以FISH檢測(cè)結(jié)果作為對(duì)比，Ventana IHC相對(duì)于FISH 的敏感性和特異性分別是100%和98.95%，總體一致性為99%，這與許多人的研究結(jié)果相同。Paik J.H等通過對(duì)640個(gè)病例分析，采用5A4抗體對(duì)肺癌患者進(jìn)行Ventana IHC檢測(cè)，同F(xiàn)ISH相比，Ventana IHC的敏感性和特異性分別是100%和98%，其中，有10例表現(xiàn)為FISH陰性而Ventana IHC陽性[12]。Mahe E分別用ALK1抗體、5A4抗體、D5F3抗體對(duì)594例肺癌手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，同時(shí)予以FISH檢測(cè)，結(jié)果顯示FISH 陽性有7例，而ALK1、5A4、D5F3陽性分別有13、18、13例，與FISH相比較，這三種抗體的敏感性均為100%，特異性分別是99%、98%、99%[13]。Harold C等對(duì)110例非小細(xì)胞肺癌病例分別進(jìn)行FISH和IHC檢測(cè)，其中FISH陽性有7例，而IHC則有11例，有4例結(jié)果與FISH不符，遂進(jìn)一步采用RT-PCR，其中1例結(jié)果為陽性，另外3例仍為陰性，IHC的敏感性和特異性分別是100%和96%[14]。上述研究都表明，Ventana IHC敏感性非常高，陰性預(yù)測(cè)價(jià)值大。

通過查閱入組病人的臨床資料發(fā)現(xiàn)，在11例Ventanna IHC檢測(cè)陽性的病人中，有5例是做過基因檢測(cè)的，其中有4例FISH陽性的病例EGFR均為陰性，發(fā)現(xiàn)ALK突變與EGFR突變不同時(shí)存在，與文獻(xiàn)所報(bào)道的一致[15]。其中有1例病例EGFR基因檢測(cè)為陽性，ALK為陰性，此次實(shí)驗(yàn)中，ALK免疫組化為陽性、FISH為陰性，該結(jié)果可能是EGFR突變引起這兩種酶蛋白的互相作用最終導(dǎo)致ALK蛋白的表達(dá)，在肺癌細(xì)胞系中ALK與EGFR的同時(shí)激活已經(jīng)有相關(guān)介紹[16]。

研究表明，EML4-ALK陽性多見于年輕、不吸煙或者吸煙較少的肺腺癌患者[17]。本次研究中，我們通過比較得出，ALK突變與臨床及病理特征無關(guān)，這可能與我們有限的標(biāo)本數(shù)量有關(guān)。但是根據(jù)本研究中陽性病例的構(gòu)成比來看，有7例病例的年齡小于總體病例的平均年齡，2例病例的年齡大于總體病例的平均年齡，說明ALK陽性可能多見于年輕患者。9例病例中，5例為腺泡為主型，2例為伴有黏液的實(shí)性為主型，1例為乳頭狀為主型，1例為浸潤(rùn)性黏液腺癌，并且，其中6例可看到印戒細(xì)胞，3例未見，說明ALK陽性與印戒細(xì)胞有關(guān)聯(lián)。Shaw在分析141例肺癌后得到19例ALK陽性病例，其中有18例為腺癌，并且大多數(shù)病例可見印戒細(xì)胞。而這在ALK陰性中非常少見[18]。由此猜想，ALK陽性與印戒細(xì)胞有關(guān)，具體待進(jìn)一步研究。

經(jīng)本次研究，我們發(fā)現(xiàn)Ventana IHC檢測(cè)EML4-ALK的的敏感性和特異性很高，與FISH高度一致。該技術(shù)成本較低，技術(shù)要求不高，檢驗(yàn)流程標(biāo)準(zhǔn)化，是一種能進(jìn)行大規(guī)模ALK基因篩查的方法。在臨床上，Ventana IHC可以作為一個(gè)高效、便捷、經(jīng)濟(jì)的初篩工具，為減輕病人及全社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的可行性提供了數(shù)據(jù)上的支持。