益氣化瘀化痰方對(duì)肺纖維化大鼠的干預(yù)作用及其機(jī)制*

田 晟，曹文富，張永越，吳 慶

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥研究室，重慶 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是以肺組織成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)聚集并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的呼吸系統(tǒng)疾病[1]，即ECM(主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原)過(guò)度沉積為特征的肺間質(zhì)疾病。異常增多的肺間質(zhì)逐漸占據(jù)肺泡腔,并取代肺泡上皮細(xì)胞。嚴(yán)重的肺換氣功能障礙最終導(dǎo)致呼吸衰竭[2]。目前肺纖維化治療手段較為有限，中藥治療肺纖維化有一定的優(yōu)勢(shì)，但中醫(yī)學(xué)中并沒(méi)有“肺纖維化”的病名，只能根據(jù)臨床癥狀認(rèn)為屬于“肺萎”和“肺痹”的范疇。肺纖維化屬本虛標(biāo)實(shí)之證，病因主要為正氣虛弱、痰瘀互結(jié)所致，故其基本病機(jī)為“氣虛-痰瘀互結(jié)-阻滯肺絡(luò)”，故以中醫(yī)的益氣化瘀化痰為治則的中藥來(lái)治療肺纖維化。國(guó)內(nèi)外研究表明，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在PF的發(fā)生發(fā)展中重要過(guò)程。鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(Snail)通路的激活在肺泡上皮細(xì)胞EMT中起到重要作用，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是Snail信號(hào)通路激活的重要因素[3]。TGF-β1是公認(rèn)的致纖維化因子，可通過(guò)調(diào)控TGF-β1和Snail1來(lái)調(diào)控TGF-β/Snail信號(hào)通路從而干預(yù)EMT的發(fā)生。故在前期研究和已知療效的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以參與纖維化進(jìn)程的TGF-β1、Snail1及EMT生物標(biāo)志物E-cadherin、Fibronectin等作為主要觀察指標(biāo)；以曹文富教授治療肺纖維化及相關(guān)疾病的基礎(chǔ)方——益氣化瘀化痰方為研究對(duì)象；以博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維為模型，探討益氣化瘀化痰方改善大鼠肺纖維的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

同批次健康SPF級(jí)SD大鼠62只，雌雄不限，7周齡，體重180～220 g。購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證：SCXK(渝)2012-001。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室，房間通風(fēng)良好，SPF清潔級(jí)，溫度20℃，空氣濕度70%，大鼠自由飲水，飲食。

1.2 主要試劑

中藥飲片黃芪、白術(shù)、川芎、姜黃、瓜蔞、海藻(購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，由重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥研究室曹文富教授鑒定合格)；醋酸氫化可的松片(上海上藥信誼藥廠有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31021270，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院西藥房)；一抗：TGF-β1抗體(購(gòu)于Servicebio，GB11179)、Snail1抗體(購(gòu)于Servicebio，GB11260)、E-cadherin抗體(購(gòu)于Servicebio，GB11082)、Fibronectin抗體(購(gòu)于Servicebio，GB11091)和β-actin(購(gòu)于Servicebio，GB12001)；二抗：HRP標(biāo)記山羊抗兔(購(gòu)于Servicebio，GB23303)HRP標(biāo)記山羊抗小鼠(購(gòu)于Servicebio，GB23301)；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白Marker(購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司)；PCR引物(購(gòu)于Servicebio)。

1.3 肺纖維化大鼠模型的建立

同批次健康SD大鼠62只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取52只，用10%的水合氯醛行腹腔注射麻醉大鼠，無(wú)菌條件下，沿頸正中切開大鼠皮膚，逐層鈍性分離暴露氣管，使用留置針經(jīng)氣管環(huán)狀軟骨間隙一次性灌注博來(lái)霉素(BLM)5 mg/kg，直立旋轉(zhuǎn)，使BLM在肺內(nèi)均勻分布，建立大鼠肺纖維化模型。剩余10只大鼠氣管內(nèi)一次性灌注等體積生理鹽水，作為正常對(duì)照組(N組)。待造模4周后，隨機(jī)選取經(jīng)BLM處理過(guò)的大鼠2只處死，取肺組織行HE及Masson染色，參照Szapiel[4]等的方法觀察，確定肺纖維化模型復(fù)制成功。

1.4 藥物制備

益氣化瘀化痰方中藥飲片均按《中國(guó)藥典》(2015版)規(guī)定的臨床常用量使用，黃芪30 g、白術(shù)10 g、姜黃10 g、川芎10 g、海藻10 g、瓜蔞10 g等中藥飲片混合水提，按1∶2∶4的濃度比例熬制低、中、高濃度制劑，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，低濃度組含1 g/ml生藥，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩浠傻乃芍苿簹浠傻乃捎蒙睇}水配成6.95 mg/ml的制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 給藥及分組

將剩余成模的50只大鼠，隨機(jī)分成5組，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組各10只。根據(jù)《藥理試驗(yàn)方法學(xué)》體表面積折算法計(jì)算大鼠用藥劑量，成人體重以70 kg計(jì)算，大鼠等效劑量為成人約6.3倍。以此為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各組大鼠給予的灌胃劑量：陽(yáng)性組大鼠給予醋酸氫化可的松灌胃；低濃度組給予低濃度制劑灌胃；中濃度組給予中濃度制劑灌胃；高濃度組給予高濃度制劑灌胃；模型組和正常組等體積的純水灌胃，各組大鼠均按 3.6 ml/kg灌胃；實(shí)驗(yàn)期間每日灌胃1次，連續(xù)灌胃觀察12周。分籠飼養(yǎng)，自由飲水、飲食。

1.6 標(biāo)本采集

連續(xù)給藥12周后，禁食不禁水12 h，各組大鼠用2%戊巴比妥鈉以0.25 ml/100 g劑量腹腔注射麻醉后解剖分離肺組織，取全肺稱濕重。冰生理鹽水沖洗，濾紙濾干后，取右肺組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，待做HE和Masson染色后光鏡觀察。取左肺組織放入凍存管內(nèi)，液氮冷凍后放入-80℃冰箱保存，待做Western blot和qRT-PCR檢測(cè)。

1.7 肺組織形態(tài)學(xué)觀察

(1)肺組織固定后，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、制成3 μm厚切片；按試劑說(shuō)明進(jìn)行HE染色、Masson染色后，脫水，透明，中性樹膠封片。(2)肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化分級(jí)判斷標(biāo)準(zhǔn)。在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察肺泡炎及肺纖維化程度。按Szapiel法進(jìn)行評(píng)分，確定肺泡炎(0—+++級(jí))及肺纖維化(0—+++級(jí))的程度。

無(wú)肺泡炎評(píng)級(jí)—記0分；輕度肺泡炎表現(xiàn)為單核細(xì)胞清潤(rùn)，肺泡間隔增寬，病變范圍局限于全肺20%以下評(píng)級(jí)+記1分；中度肺泡炎表現(xiàn)為病變范圍占全肺21%～50%評(píng)級(jí)++記2分；重度肺泡炎表現(xiàn)為呈彌漫性肺泡炎，病變范圍大于51%評(píng)級(jí)+++記3分。

無(wú)肺纖維化評(píng)級(jí)—記0分；輕度肺纖維化表現(xiàn)為病變范圍占全肺20%以下評(píng)級(jí)+記1分；中度肺纖維化表現(xiàn)為病變范圍占全肺21%～50%，肺泡機(jī)構(gòu)紊亂評(píng)級(jí)++記2分；重度肺纖維化表現(xiàn)為病變范圍大于51%，肺泡融合，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)明顯紊亂評(píng)級(jí)+++記3分。

顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)其炎癥程度及纖維化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

Tab. 1 Pulmonary alveolitis and pulmonary interstitial fibrosis classification and integral criteria

1.8 蛋白免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

用蛋白裂解液來(lái)提取蛋白質(zhì)，然后樣品中加入適量 5 × SDS 上樣緩沖液和 10% β-巰基乙醇，100℃ 煮 10 min，10% SDS-PAGE 電泳電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上后，麗春紅染色觀察蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況。室溫下5% 脫脂牛奶封閉 4 h，分別加入1∶1 000 TGF-β1、Snail1、E-cadherin、Fibronectin一抗，4℃ 反應(yīng)過(guò)夜，用TBST 洗滌 3 次，每次 10 min，加入用TBST稀釋3 000倍的二抗，室溫孵育 1 h，TBST 洗滌 3 次，每次 10 min，Western blot熒光檢測(cè)。結(jié)果用 Labwork 凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描，以對(duì)照組的面積灰度值為100% 與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較和半定量分析。

1.9 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

采用Trizol法提取總mRNA，在37℃ 15 min，85℃ 5 s條件下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按如下條件進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性：95℃ 30 s；PCR反應(yīng)：95℃變性 5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次。采用RT-PCR相對(duì)定量方法(ΔΔCt值比較法)進(jìn)行分析:ΔΔCt=(干預(yù)組Ct -內(nèi)參Ct)-(假手術(shù)組Ct-內(nèi)參Ct)，平均相對(duì)含量=2-averageΔΔCt× 100%。qRT-PCR引物信息見表2。

Tab. 2 Sequences for primers

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺系數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)公式：肺系數(shù)=肺濕重(g)/體重(kg)×100%計(jì)算。與空白組比較，模型組肺系數(shù)顯著升高(P<0.01)，與模型組比較，陽(yáng)性組肺系數(shù)降低(P<0.05)，中藥治療組肺系數(shù)顯著下降(P<0.01)，與中濃度組比較，中濃度組肺系數(shù)下降程度較低、高濃度組顯著(P<0.05)，與陽(yáng)性組比較，中藥治療組肺系數(shù)下降程度較陽(yáng)性組顯著(P<0.05，表3)。肺系數(shù)結(jié)果說(shuō)明中濃度組較其他各治療組能更有效的降低肺系數(shù)。

Tab. 3 The results of the lung coefficients of the n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel；△P<0.05vsmedium concentration;▲P<0.05vspositive

2.2 各組肺組織形態(tài)學(xué)觀察

HE染色顯示：正常組肺組織結(jié)構(gòu)清楚，肺泡間隔正常，無(wú)充血水腫、炎癥及纖維化表現(xiàn)；模型組肺內(nèi)肺泡炎不明顯，肺泡間隔顯著增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔縮小，肺泡塌陷或融合，肺間質(zhì)內(nèi)有大量膠原纖維；中藥治療各組纖維化程度較模型組輕，肺泡壁結(jié)構(gòu)基本正常，肺泡間隔纖維增生灶較少，肺泡內(nèi)未見明顯滲出物淤積(圖1)。

Masson染色顯示：正常組肺內(nèi)結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔存在較少膠原纖維；模型組肺組織纖維化明顯，大量藍(lán)染膠原纖維呈片狀積聚，肺泡組織結(jié)構(gòu)破壞；中藥治療各組肺組織纖維化程度較模型組明顯減輕，藍(lán)染膠原沉積明顯減少，肺泡間隔寬帶較M組小(圖2)。

按Szapiel法進(jìn)行評(píng)分，確定肺泡炎(0—+++級(jí))及肺纖維化(0—+++級(jí))的程度。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)其炎癥程度及纖維化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)(表4)。

Tab. 4 The results of pulmonary alveolitis and pulmonary interstitial fibrosis(score,,n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01 vs model；△P<0.05vsmedium concentration;▲P<0.05vspositive

2.3 各組TGF-β/Snail通路、E-cadherin及Fibronectin 蛋白表達(dá)的變化

Western blot結(jié)果顯示：與正常組大鼠比較，模型組大鼠的肺組織中TGF-β1、Snail1、Fibronectin的蛋白表達(dá)明顯高于正常組(P<0.01)，E-cadherin 蛋白表達(dá)則明顯低于正常組(P<0.01，圖3，表5)；與模型組大鼠比較，低、中、高濃度組均能不同程度的下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中 TGF-β1和Snail1 蛋白的表達(dá)(P<0.05)，能夠下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中Fibronectin蛋白的表達(dá)(P<0.05)以及增加E-cadherin蛋白的表達(dá)(P<0.05)；低、高濃度組與中濃度組比較,中濃度組結(jié)果更加顯著(P<0.05)；中藥治療各組與陽(yáng)性組比較，表達(dá)結(jié)果優(yōu)于陽(yáng)性組(P<0.05，圖3，表5)。

Fig.3The protein expressions of TGF-β/Snail signal pathway,E-cadherin and Fibronectin
A:Control;B:Model;C:Low concentration;D:Medium concentration;E:High concentration;F:Positive

2.4 TGF-β/Snail通路、E-cadherin及Fibronectin mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

qRT-PCR顯示：與正常組大鼠比較，模型組大鼠的肺組織中TGF-β1、Snail1、Fibronectin的mRNA表達(dá)明顯高于正常組(P<0.01)，E-cadherin mRNA表達(dá)則明顯低于正常組(P<0.01，表6)；與B組大鼠比較，低、中、高濃度組均能不同程度的下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中 TGF-β1和Snail1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，能夠下調(diào)肺纖維化大鼠的肺組織中Fibronectin蛋白的表達(dá)(P<0.05)以及增加E-cadherin mRNA的表達(dá)(P<0.05)；低、高濃度組與中濃度組比較,中濃度組結(jié)果更加顯著(P<0.05)；中藥治療各組與陽(yáng)性組比較，表達(dá)結(jié)果優(yōu)于陽(yáng)性組(P<0.05)。qRT-PCR與Western blot結(jié)果趨勢(shì)一致(表6)。

Tab. 5 The expressions of TGF-β1，Snail1,Fibronectin and E-cadherin protein in rats with pulmonary fibrosis(score, n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel；△P<0.05vsmedium concentration;▲P<0.05vspositive

Tab. 6 The expressions of TGF-β1，Snail1,Fibronectin and E-cadherin mRNA in rats with pulmonary fibrosis(score, n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel；△P<0.05vsmedium concentration;▲P<0.05vspositive

3 討論

肺纖維化是多種肺部疾病發(fā)展到終末期的共同的病理變化，嚴(yán)重危害著人類的健康，一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。本研究采用目前公認(rèn)的氣管內(nèi)一次性注射博來(lái)霉素的方法復(fù)制肺纖維化模型，該模型是觀察肺纖維化的經(jīng)典模型。

本研究選取曹文富教授治療肺纖維化及相關(guān)疾病的基礎(chǔ)方——益氣化瘀化痰方來(lái)實(shí)驗(yàn)。中醫(yī)學(xué)中并沒(méi)有“肺纖維化”的病名，只能根據(jù)臨床癥狀認(rèn)為屬于“肺萎”和“肺痹”的范疇。肺纖維化屬本虛標(biāo)實(shí)之證，主要是以“氣虛-痰瘀互結(jié)-阻滯肺絡(luò)”為基本病機(jī)，故以益氣化瘀化痰為治法來(lái)治療肺纖維化。以益氣、化瘀、化痰法為治法原則，益氣使肺脾腎之氣健旺，水濕與津液輸布、轉(zhuǎn)化功能和血液運(yùn)行功能趨于恢復(fù)正常，減少或消除痰濁與瘀血的生成(ECM形成減少)；化瘀使血行通利，減輕或消除瘀血內(nèi)阻和痰瘀互結(jié)(ECM形成減少，降解增強(qiáng))；化痰以消除已成之痰(促進(jìn)ECM降解)，益氣化瘀化痰法合用可扶正祛邪，澄源除積，達(dá)到使受損后處于纖維化病理進(jìn)程的肺組織形態(tài)和功能復(fù)原的目的。

益氣化瘀化痰方以益氣藥黃芪為君藥，黃芪為補(bǔ)氣之要藥，配白術(shù)以增強(qiáng)其補(bǔ)氣之功。有研究報(bào)道，黃芪含有多糖、皂苷、黃酮和微量元素，具有擴(kuò)張小血管、改善微循環(huán)、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化等多重藥理作用，并且在腎、肝、肺等多個(gè)器官具有抗纖維化作用[5]；臣以化瘀藥川芎和姜黃，川芎為“血中之氣藥”，對(duì)氣血瘀滯效果明顯，配以姜黃以加強(qiáng)行氣活血的功效。川芎的主要有效成分川芎嗪，能抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、LN的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚，發(fā)揮治療作用[6]；川芎其有效成分阿魏酸有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，可以有效的防止纖維化的發(fā)生和發(fā)展[7]；姜黃可抑制肺纖維化大鼠肺組織膠原沉積，在延緩肺纖維化形成中起重要作用[8]；佐以化痰藥海藻和瓜蔞，肺纖維化患者有呼吸困難，胸悶不暢等臨床癥狀，瓜蔞具有清熱化痰、寬胸散結(jié)功效，可減輕患者癥狀，現(xiàn)代藥理研究表明，瓜萎薤白湯(瓜蔞、薤白)能明顯減輕平陽(yáng)霉素所致的大鼠肺泡炎及纖維化[9]，與海藻相須使用能增強(qiáng)其化痰散結(jié)的功效，現(xiàn)代研究表明，海藻多糖能抑制羥脯氨酸的合成，減少肺膠原的產(chǎn)生，對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化形成有一定的抑制作用[10]。綜上所述，益氣化瘀化痰方有益氣健脾、化瘀消痰散結(jié)之功。

肺系數(shù)是肺濕重與大鼠體重的比值，肺系數(shù)的高低是反映肺纖維程度的最直觀的指標(biāo)之一。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維早期，主要有肺泡炎癥為主，肺部炎性滲出、細(xì)胞水腫、毛細(xì)血管充血等因素導(dǎo)致肺濕重增加，使肺系數(shù)增高；隨著進(jìn)入肺纖維化末期，炎癥、水腫、充血逐漸減輕，但膠原纖維沉積不斷加重，肺組織質(zhì)地變硬，彈性減弱[11]，肺濕重較早期略有降低，但較正常大鼠仍是增加；同時(shí)在肺纖維化發(fā)展過(guò)程中，由博來(lái)霉素干預(yù)的大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重者體重還會(huì)下降，最終導(dǎo)致肺系數(shù)的增高。觀察HE和Masson染色結(jié)果，中藥治療組可以下調(diào)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺泡炎癥和肺纖維化程度的損傷評(píng)分。這說(shuō)明益氣化瘀化痰方不同濃度的制劑均可在不同程度上降低大鼠的肺系數(shù)，改善肺組織纖維化程度，以中濃度組最明顯，這說(shuō)明益氣化瘀化痰方對(duì)治療肺纖維化有顯著的療效。

進(jìn)一步探討益氣化瘀化痰方治療肺纖維化的機(jī)制。EMT是PF發(fā)生發(fā)展中的重要過(guò)程。通過(guò)EMT，肺泡上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性，失去與基底膜領(lǐng)導(dǎo)連接等上皮表型，獲得遷移與侵襲的能力，進(jìn)入ECM獲得成纖維細(xì)胞表型。EMT與損傷修復(fù)、組織再生和器官纖維化密切相關(guān)，生理狀態(tài)下當(dāng)炎癥反應(yīng)緩解時(shí)會(huì)自行停止；但當(dāng)炎癥反應(yīng)持續(xù)活化，EMT過(guò)程將持續(xù)存在，最終導(dǎo)致肺纖維化的形成。TGF-β信號(hào)通路是許多可以導(dǎo)致EMT中的一條，TGF-β1是公認(rèn)的致纖維化因子，TGF-β1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、分化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量基質(zhì)蛋白成分分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，如膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分在TGF-β1的刺激下合成增多并沉積，進(jìn)一步增加TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展[12-13]。TGF-β信號(hào)通路能激活轉(zhuǎn)錄因子Snail，Snail可以抑制上皮基因的表達(dá)并且可以作為EMT的激活劑發(fā)揮作用。Snail蛋白連接到E-cadherin蛋白的啟動(dòng)子上沉默其表達(dá)用[14]。而E-cadherin和Fibronectin是EMT發(fā)生的標(biāo)志蛋白，EMT發(fā)生的主要特征是細(xì)胞黏附分子(如E-cadherin)表達(dá)的減少、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如Fibronectin)表達(dá)的增加。因此，可通過(guò)調(diào)控TGF-β1和Snail1來(lái)調(diào)控TGF-β/Snail信號(hào)通路來(lái)影響EMT發(fā)生。本研究中，模型組TGF-β1、Snail1和Fibronectin蛋白和mRNA表達(dá)較正常組明顯上調(diào)，E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)，表明博來(lái)霉素干預(yù)后TGF-β/Snail信號(hào)通路被激活；中藥治療組TGF-β1、Snail1和Fibronectin蛋白和mRNA表達(dá)較模型組明顯下調(diào)，E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)，提示藥物治療對(duì)TGF-β/Snail信號(hào)通路有抑制作用。本研究結(jié)果推測(cè)，益氣化瘀化痰方改善大鼠肺纖維化的作用可能與其能抑制TGF-β/Snail信號(hào)通路，在一定程度上抑制ECM的生成和堆積，增加細(xì)胞外基質(zhì)的降解有關(guān)。

PF是細(xì)胞、細(xì)胞因子、ECM產(chǎn)生與降解等相互作用、相互調(diào)節(jié)的多因素參與的十分復(fù)雜的過(guò)程[15]，所以單一靶點(diǎn)的藥物難以治療肺纖維化。益氣化瘀化痰方可以多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑的治療肺纖維化，本研究證明益氣化瘀化痰方可以顯著的改善博來(lái)霉素引起的肺纖維化，其機(jī)制是能抑制TGF-β/Snail信號(hào)通路，從而抑制ECM的生成和堆積，在防治肺纖維化方面具有較好的臨床應(yīng)用前景。