模擬高原低壓低氧環(huán)境對(duì)大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能影響*

馮振龍,趙 彤,成 祥,朱玲玲,趙永岐△,施 冰

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)陸軍總醫(yī)院臨床學(xué)院，北京 100700；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850；3.陸軍總醫(yī)院干部病房一科，北京 100700)

高原地區(qū)具有氣溫低、濕度低、溫差大、紫外線輻射強(qiáng)等特點(diǎn)[1]，其中低壓低氧是其最主要的特征[2]。暴露于高原低壓低氧環(huán)境時(shí)，心臟對(duì)低氧十分敏感。由于氧的供應(yīng)穩(wěn)態(tài)失衡以及其他因素的影響，心血管系統(tǒng)可發(fā)生損傷[3]，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能異常[4]。隨著海拔高度的上升，心肌組織損傷逐漸加重。目前用于高原低壓低氧心肌損傷研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，大多數(shù)學(xué)者采用高原現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)方法[5]。雖然其可以真實(shí)再現(xiàn)高原低壓低氧環(huán)境，但是受到交通、地域等諸多因素限制，需要花費(fèi)較多的人力、物力成本才能完成實(shí)驗(yàn)，并且影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)基于大型多因素復(fù)合環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn)艙，模擬海拔7 000 m高原環(huán)境，觀察高原低壓低氧環(huán)境下大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能變化，以期建立一個(gè)穩(wěn)定可靠的高原低壓低氧環(huán)境下心肌損傷的動(dòng)物模型，為探討高原低壓低氧環(huán)境下心肌損傷發(fā)生機(jī)制、防治措施等研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

多因素復(fù)合環(huán)境模擬醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)艙，貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司；小動(dòng)物超聲儀，Vevo770 ultrasound system，Visual Sonics Inc，Toronto Canada；SP2006動(dòng)物心電圖解析系統(tǒng)，北京軟隆生物技術(shù)有限公司；全血細(xì)胞分析儀，日本希森美康XT-2000i；小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)脈搏血氧儀MouseOx，STARR Life Sciences Corp.；全自動(dòng)生化分析儀羅氏Cobas8000；光學(xué)顯微鏡，OLympus BH；羅氏原裝生化試劑，10%多聚甲醛。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠96只，體質(zhì)量(200±20)g，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)軍事醫(yī)學(xué)研究院倫理委員會(huì)審核。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將96只SD大鼠按照4個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為高原低壓低氧3 d組、7 d組、14 d組和28 d組(簡(jiǎn)稱低氧組)，每組再設(shè)同時(shí)間點(diǎn)的常壓常氧對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)，每組12只。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)艙參數(shù)設(shè)定：模擬海拔高度7 000 m，升降速度10 m/s，新風(fēng)量102.5 m3/h,艙內(nèi)壓力39.1 kpa，艙內(nèi)氧氣壓力9.022 kpa，溫度24.9℃，濕度23.4%RH。低氧組大鼠放置在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)，保證食物和飲用水。實(shí)驗(yàn)艙運(yùn)行時(shí)間23 h/d，控制晝夜比大約12 h∶12 h。每天早上8:00～9:00開(kāi)艙更換墊料、補(bǔ)充食物和飲用水。對(duì)照組動(dòng)物置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙外，除了低壓低氧外，其他處理?xiàng)l件與低氧組動(dòng)物一致。分別在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)開(kāi)艙取出大鼠，稱體質(zhì)量、測(cè)量動(dòng)脈血氧飽和度后麻醉，進(jìn)行心臟超聲和心電圖檢查。完成上述檢查后左心室取血，進(jìn)行血常規(guī)和血生化等檢查。開(kāi)胸、完整摘取心臟后生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干水分后，10%多聚甲醛固定。進(jìn)行組織HE染色和病理分析。

1.5 大鼠超聲心動(dòng)圖檢查

各組大鼠出倉(cāng)當(dāng)日立刻行心臟超聲檢查。2% 戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，胸前剃毛，仰臥固定。將小動(dòng)物超聲儀的超聲探頭(頻率17.5 MHz)置于大鼠胸骨前，顯示左室短軸切面。于乳頭肌水平，應(yīng)用M超聲記錄左心室運(yùn)動(dòng)曲線，分別測(cè)量舒張末期左室前壁厚度(left ventricular end-diastolic anterior wall thickness，LVAWD)、舒張末期左心室后壁厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LVPWD)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVIDD)和收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension systole,LVIDS)。計(jì)算左心室質(zhì)量(left ventricular mass，LVMass)、左室短軸縮短率(fractional shortening of left ventricle，F(xiàn)S)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，EF)、肺靜脈峰值流速(PV peak velocity)和肺靜脈峰值壓差(PV peak gradient)。

1.6 大鼠心電圖檢查

利用sp2006動(dòng)物心電圖解析系統(tǒng)進(jìn)行心電圖檢查。將電極插入到麻醉后大鼠的四肢皮下，電極位置參照人體心電圖的相應(yīng)部位。

1.7 大鼠血液生化檢查

左心室取血1 ml置于EDTA抗凝管中，利用全血細(xì)胞分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(red blood cell,RBC)、血紅蛋白(hemoglobin,HGB)、紅細(xì)胞分布寬度(red blood cell distribution width,RDW)、血小板(platelet count,PLT)計(jì)數(shù)等。左心室取血2 ml置于促凝管中離心(3 000 g，5 min)，吸取血清，利用羅氏全自動(dòng)血液生化分析儀Cobas8000檢測(cè)肌酸激酶(creatine kinase,CK)和肌酐(creatinine,CR)等生化參數(shù)。

1.8 大鼠心臟組織病理

大鼠處死后摘取心臟，生理鹽水沖洗干凈，10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。連續(xù)切片，厚度為4 μm，HE染色，鏡下觀察左心室心肌組織病理變化情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低壓低氧對(duì)大鼠體質(zhì)量、活動(dòng)情況與動(dòng)脈血氧飽和度的影響

低氧組大鼠體質(zhì)量在進(jìn)艙后3 d時(shí)明顯下降，第4日始體質(zhì)量開(kāi)始增長(zhǎng)，但是增長(zhǎng)速度與對(duì)照組相比較緩慢。動(dòng)脈血氧飽和度于低氧14 d和28 d 顯著降低(表1)。低氧組大鼠進(jìn)倉(cāng)后活動(dòng)減少，飲食飲水下降，精神萎靡，昏睡?？诒羌八闹つw粘膜變紫，呼吸頻率和心率明顯增快。3～7 d后大鼠活動(dòng)逐漸增多，飲食飲水增加，出現(xiàn)相互撕咬、興奮狀態(tài)。

2.2 低壓低氧對(duì)大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

動(dòng)物超聲儀可清晰地顯示大鼠左心室結(jié)構(gòu)，并且可以獲得滿意的M超左室運(yùn)動(dòng)曲線(圖1)。隨著低氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)下述變化：(1)左心室舒張末期前壁(LVAWD)及舒張末期后壁(LVPWD)增厚。左心室舒張末期直徑(LVIDD)及收縮末期直徑(LVIDS)變小，28 d最為明顯。(2)左心室射血分?jǐn)?shù)(EF%)、左心室短軸縮短率(FS%)、肺靜脈峰值流速及肺靜脈峰值壓差在低壓低氧3～7 d逐漸下降，14～28 d逐漸恢復(fù)正常，7 d下降最為明顯。(3)左心室質(zhì)量(LVMass)逐漸增加，28 d最為顯著(表2)。

Fig.1Motion curve of papillary muscle by left ventricular short-axis in M-mode ultrasonic

A：Control group(28 d)；B：Hypoxic group(28 d)

Tab. 1 Physiological parameters of rats at different time points of hypobaric n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab. 2 Echocardiography parameters of rats at different time points of hypobaric n=12)

LVAWD:Left ventricular end-diastolic anterior wall thickness;LVPWD:Left ventricular end-diastolic posterior wall thickness;LVIDD:Left ventricular end-diastolic diameter;LVIDS:Left ventricular internal dimension systole;LVMass:Left ventricular mass;EF%:Left ventricular ejection fraction;FS%:Fractional shortening of left ventricle;PV peak velocity:Pulmonary vein peak velocity;PV peak gradient:Pulmonary vein peak gradient
*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 低壓低氧對(duì)大鼠心電圖的影響

隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠心電圖QRS及QT間期逐漸增寬，14 d及28 d最為顯著。ST段逐漸下移，后期逐漸恢復(fù)，7 d及14 d下移顯著。R波振幅逐漸降低，7 d，14 d及28 d降低明顯(表3)

2.4 低壓低氧對(duì)大鼠血常規(guī)和血生化指標(biāo)的影響

低氧組大鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)均明顯增加；血小板計(jì)數(shù)(PLT)下降，14 d及28 d最為明顯。肌酸激酶(CK)、肌酐(CR)都有增加趨勢(shì)，各低氧組大鼠血肌酸激酶(CK)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低氧14 d及28 d大鼠血肌酐(CR)變化有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

2.5 低壓低氧對(duì)大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)的影響

HE結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞界限清楚。可見(jiàn)肌原纖維和橫紋，胞核清晰。肌漿未見(jiàn)變性和壞死。心肌細(xì)胞間毛細(xì)血管管腔內(nèi)有紅細(xì)胞，心內(nèi)膜平滑。低氧3 d可見(jiàn)心肌灶狀變性和壞死，伴有炎性細(xì)胞灶狀浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增生。肌漿凝聚，橫紋不清。低氧7 d心肌粗細(xì)不均，間質(zhì)增寬，血管擴(kuò)張。心肌細(xì)胞個(gè)別可見(jiàn)斷裂、腫脹。肌漿凝聚、紅染，橫紋不清。低氧14 d心肌細(xì)胞排列紊亂、稀疏，間質(zhì)增寬，血管擴(kuò)張。心肌細(xì)胞可見(jiàn)斷裂、腫脹，肌漿凝聚、紅染，橫紋不清。心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生明顯，并有膠原纖維排列。心內(nèi)膜下成片炎細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞和膠原纖維增生。低氧28 d心肌細(xì)胞排列明顯稀疏，間質(zhì)增寬。血管擴(kuò)張，心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生明顯。部分區(qū)域心肌間質(zhì)出血明顯，心肌細(xì)胞胞核減少(圖2)。

3 討論

超聲心動(dòng)圖是臨床評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)和功能的常用方法。左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮率(FS)是評(píng)價(jià)左心室收縮功能的兩個(gè)最常用指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，急進(jìn)高原環(huán)境后3 d大鼠EF和FS均低于對(duì)照組，提示大鼠左心室收縮功能已經(jīng)出現(xiàn)損傷。進(jìn)入高原后7 d，EF和FS較3 d時(shí)下降更顯著，提示左心室收縮功能受損進(jìn)行性加重。進(jìn)入高原后14 d和28 d，大鼠EF和FS均高于對(duì)照組，提示左心室收縮功能恢復(fù)正常。分析其原因，可能與高原低壓低氧環(huán)境使交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)、腎素血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活[6]。心率加快，外周血管阻力增加。左心室收縮做功增多，心肌耗氧量增多。心臟舒張末存留在動(dòng)脈中的血量增多、舒張壓升高，導(dǎo)致急性暴露于高海拔環(huán)境的大鼠左心室收縮功能減低。隨著低壓低氧時(shí)間延長(zhǎng)，在等長(zhǎng)機(jī)制作用下，左心室發(fā)揮了代償功能，使低壓低氧14 d和28 d組大鼠左心室收縮功能增強(qiáng)，EF和FS均較3 d和7 d組升高。然而部分學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，高原低壓低氧對(duì)心臟的影響可表現(xiàn)為左室收縮功能輕度增高[7,8]。原因可能系低氧作用于頸動(dòng)脈體導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮性提高，通過(guò)CAMP信號(hào)通路激活細(xì)胞膜L型鈣通道，增加鈣離子內(nèi)流，使心肌收縮能力增強(qiáng)[9]。

PV peak velocity和PV peak gradient 是反映左心室舒張功能的常用參數(shù)。這兩個(gè)參數(shù)數(shù)值在低氧組均低于對(duì)應(yīng)的對(duì)照組，提示持續(xù)高原低氧環(huán)境造成左心室舒張功能受損。其原因可能是外周血管阻力增加，左心室舒張末期容積增加以及肺循環(huán)高壓和淤血導(dǎo)致左心室順應(yīng)性減退和充盈障礙。高原低氧不僅導(dǎo)致心臟功能發(fā)生變化，也可導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)研究中超聲心動(dòng)圖結(jié)果提示，各低氧組大鼠左心室舒張末內(nèi)徑和收縮末內(nèi)徑均小于對(duì)照組。左心室前壁和后壁厚度均大于對(duì)照組。推測(cè)大鼠心臟結(jié)構(gòu)變化系低氧對(duì)心肌細(xì)胞的直接損傷所致。

Tab. 3 Electrocardiogram parameters of rats at different time points of hypobaric n=12)

QRS:QRS interval;QT:QT interval;ST:ST-segment;R:R wave amplitude
*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab. 4 Blood routine and biochemical parameters of rats at different time points of hypobaric n=12)

RBC:Red blood cell;HGB:Hemoglobin;RDW:Red blood cell distribution width;PLT:Platelet count;CK:Creatine kinase;CR:Creatinine
*P<0.05,**P<0.01vscontrol

高原低壓低氧對(duì)心臟電生理異常與心臟結(jié)構(gòu)和功能改變密切相關(guān)。本研究中心電圖提示，與對(duì)照組相比，隨著高原低氧時(shí)間延長(zhǎng)，低氧組大鼠肢體導(dǎo)聯(lián)R波幅度逐漸下降，ST段發(fā)生改變，QRS及Q-T間期延長(zhǎng)。與暴露在高原低氧環(huán)境下青年健康男性心電圖的改變一致。提示高原低氧環(huán)境下,心肌能量供應(yīng)不足,導(dǎo)致心肌去極和復(fù)極過(guò)程延長(zhǎng)[10，11]。低氧是影響紅細(xì)胞和血色素水平變化的主要因素。本研究中大鼠血常規(guī)提示，低氧各組RBC、HGB、RDW明顯增高，PLT下降。考慮紅細(xì)胞增多系機(jī)體對(duì)高原低氧的一種代償性變化。通過(guò)增加循環(huán)血液內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量來(lái)提高運(yùn)氧能力，減輕機(jī)體缺氧狀態(tài)。但是紅細(xì)胞和血紅蛋白過(guò)度增高易導(dǎo)致血液濃度和黏滯度增加[12]，血流緩慢，循環(huán)受阻，心臟做功增多。這也是導(dǎo)致高原低氧環(huán)境下心肌損傷的一個(gè)主要原因。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)低氧組大鼠心肌組織HE染色，直觀地觀察到低氧3 d 和低氧7 d 心肌細(xì)胞水腫、肌漿凝聚、橫紋不清、排列紊亂、心肌灶狀變性和壞死伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、鈣鹽沉積、心肌纖維變性斷裂等病理變化較為顯著。低氧14 d 和低氧28 d 大鼠心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞和膠原纖維細(xì)胞增生等病理改變較為顯著。提示急進(jìn)高原一周內(nèi)，心肌組織病理變化以水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主要表現(xiàn)，一周后以心肌細(xì)胞肥大，膠原纖維增生等代償性修復(fù)為主要表現(xiàn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)較好地模擬了急進(jìn)高原后大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。發(fā)現(xiàn)急進(jìn)高原一周，心臟結(jié)構(gòu)和功能即可發(fā)生損傷性改變，一周后心肌出現(xiàn)代償性修復(fù)。急進(jìn)高原后一周可能是進(jìn)入高原習(xí)服期的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。本研究實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)便易行，在平原地區(qū)即能較好的完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)，可重復(fù)性好，所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以應(yīng)用于高原低壓低氧環(huán)境下心肌損傷的后續(xù)研究中。

致謝：感謝陸應(yīng)麟研究員為本文提供的病理學(xué)分析。