高糖誘導(dǎo)的大鼠原代心肌細(xì)胞損傷對程序性壞死的影響及其機(jī)制*

方婷婷，曹瑞平，葉紅偉，馬善峰，高 琴

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是世界上最常見的非傳染性慢性疾病之一，隨病程延長，往往伴有多臟器并發(fā)癥。高血糖引起的心肌損傷是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為心肌氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致心力衰竭。細(xì)胞死亡是生命的基本組成部分，包括凋亡、自噬、壞死等多種形式。隨著研究的深入，Degterev A團(tuán)隊(duì)于2005年在小鼠腦缺血損傷中第一次報(bào)道另一種可調(diào)控性的細(xì)胞壞死方式——程序性壞死(necroptosis)[1]。Necroptosis也稱為壞死性凋亡，是一種由激酶的激活引起的細(xì)胞死亡方式，兼具凋亡和壞死特征，又不同于這兩種細(xì)胞死亡方式。與經(jīng)典的細(xì)胞凋亡相比，necroptosis雖然可調(diào)控，但不形成凋亡小體，染色質(zhì)不聚集，不依賴半胱氨酸天冬蛋白酶(caspase)，但伴有活性氧的增加，發(fā)生炎癥反應(yīng)，可被Nec-1特異性抑制，而不受凋亡抑制劑(如z -VAD)的影響；與經(jīng)典的壞死相比，necroptosis具有壞死樣的形態(tài)學(xué)變化，出現(xiàn)細(xì)胞膜/器破裂、核裂解等，但受多種基因調(diào)控，主要通過受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1，RIP1)、受體相互作用蛋白激酶3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3，RIP3)與混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)形成RIP1-RIP3-MLKL軸，稱為“壞死復(fù)合物”。RIP3與RIP1通過各自的RIP同源結(jié)構(gòu)相互作用，RIP3是RIP1的下游調(diào)節(jié)因子，RIP3誘導(dǎo)MLKL寡聚化轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)膜，與磷脂酰肌醇相互作用觸發(fā)細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，并破壞細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2-5]。

近年來，程序性壞死作為一種受調(diào)控的細(xì)胞壞死形式，引起人們的廣泛關(guān)注[6]。各種損傷性刺激如氧化應(yīng)激、缺血、炎癥等均可誘發(fā)程序性壞死的發(fā)生，與心肌梗死、中風(fēng)、缺血/再灌注損傷等疾病密切相關(guān)，有效抑制necroptosis的發(fā)生可直接抑制炎癥反應(yīng)，減輕疾病損傷。心肌損傷作為糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，深入探討其發(fā)生機(jī)制具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。值得注意的是，高糖引起的心肌損傷中伴有氧化應(yīng)激、炎癥等的發(fā)生，那么高糖是否誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生程序性壞死？抑制程序性壞死是否可減輕高糖引起的心肌損傷和炎癥反應(yīng)？以上問題值得我們深入探討。因此本研究首先觀察了程序性壞死在高糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞損傷中變化，并探討其可能機(jī)制，為臨床預(yù)防及治療糖尿病心肌損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑材料、儀器設(shè)備

SPF級1～3 d SD乳鼠，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK(蘇 2017-0001)。Nec-1(necrostatin-1，RIP1的特異性抑制劑)、二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)、MTT均購于美國Sigma公司，TNF-α、IL-6及IL-1β試劑盒均購于達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，總RNA的提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，Real-time PCR試劑盒購于日本Takara Clontech公司，各引物由上海生工生物公司合成，RIP1引物：上游序列5'- AGG TAC AGG AGT TTG GTA TGG GC-3'，下游序列 5'- GGT GGT GCC AAG GAG ATG TAT G-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為123 bp；RIP3引物：上游序列 5'- TAG TTT ATG AAA TGC TGG ACC GC-3'，下游序列 5'- GCC AAG GTG TCA GAT GAT GTC C-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為145 bp；MLKL引物：上游序列 5'- GCC ACT GGA AAG ATC CCG TT-3'，下游序列 5'- CAA CAA CTC GGG GCA ATC CT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約108 bp；以GAPDH為內(nèi)參，上游序列 5'- ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC-3'，下游序列5'-TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT -3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為255 bp。兔抗大鼠RIP1抗體、RIP3抗體均購自美國Abcam公司，兔抗大鼠MLKL抗體、GAPDH抗體分別購于英國biorbyt公司、上海愛必信生物公司。

倒置熒光顯微鏡(Cat No.1X71)購自日本Olympus公司。Real-time PCR儀(Applied Biosystems? StepOnePlus)為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀(Cat No.Synergy 2)為美國Bio-Tek公司。小型轉(zhuǎn)印槽(Mini Trans-Blot?)、垂直電泳槽(Mini-PROTEAN? Tetra Cell和成像儀(ChemiDocTMXRS+ System)為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)

取1～3 d的乳鼠心尖組織，放于預(yù)冷的HBSS液中擠壓出血，清洗，眼科剪將心臟組織塊剪成1 mm3塊狀，加入終濃度為10 μg/ml的DNA酶I、0.08%的II型膠原酶、0.07%的胰蛋白酶混合液進(jìn)行消化，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置7～10 min，棄上清。重復(fù)消化步驟約5～7次，直至組織塊蓬松。加入低糖完全培養(yǎng)基(4.9 mmol/L葡萄糖)終止消化，輕柔吹散，靜置，待組織沉淀后吸取混濁上清液入一離心管中。重復(fù)步驟直至組織中的液體清亮，收集的混濁上清液1 000 r/min、離心6 min，棄上清，獲取細(xì)胞沉淀。低糖完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，種入培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min后，小心吸取培養(yǎng)液1 000 r/min、離心6 min，獲取細(xì)胞沉淀，F(xiàn)12完全培養(yǎng)基將其重懸，加入5-Brdu(終濃度為0.1 mmol/L，抑制混雜的成纖維細(xì)胞)，種入培養(yǎng)皿中于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞，培養(yǎng)至3～4 d，心肌細(xì)胞相互接觸交織，出現(xiàn)同步化搏動(dòng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞，干預(yù)前予以無血清培養(yǎng)基處理24 h，使其同步化。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組：(1)正常對照組(normal control group，Control)：心肌細(xì)胞在葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h；(2)高糖組(high glucose，HG)：葡萄糖濃度為30 mmol/L的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h[7]；(3)高糖+Nec-1組(HG+Nec-1)：將RIP1的特異性抑制劑Nec-1加入葡萄糖濃度為30 mmol/L的完全培養(yǎng)基中，其終濃度為100 μmol/L[8]，培養(yǎng)48 h；(4)高滲組(hypertonic pressure group，HPG)：含 5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

1.4 MTT檢測各處理組細(xì)胞活力

心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞種在96孔板于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組設(shè)置5個(gè)孔，四周孔加入PBS液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)處理前予以無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h。實(shí)驗(yàn)處理48 h后各孔加入20 μl MTT溶液(工作濃度：0.5 mg/ml)，37℃孵育4 h，生成深紫色結(jié)晶，小心去除液體，各孔加入150 μl DMSO，置于搖床上搖15～30 min，使結(jié)晶完全溶解，上機(jī)，檢測波長在490 nm處的OD值。

1.5 DHE檢測不同處理組心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平

每孔2×105個(gè)細(xì)胞種于6孔板,于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)處理前予以無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h，實(shí)驗(yàn)干預(yù)處理48 h后，PBS清洗3次，每次3 min，按照說明書各孔加入含有DHE的F12完全培養(yǎng)基(DHE工作濃度：10 μmol/L)，避光，37℃孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min，然后4%多聚甲醛固定10 min，倒置熒光顯微鏡下拍照。使用ImageJ1.48v軟件對各組圖片進(jìn)行量化分析。

1.6 ELISA法檢測不同處理組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6及IL-1β水平

每孔1×106個(gè)細(xì)胞種于培養(yǎng)皿于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)處理前予以無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h，實(shí)驗(yàn)干預(yù)處理48 h后，收集上層培養(yǎng)液備用，準(zhǔn)備5批次樣品，按照試劑盒說明書操作：加樣，洗板，加檢測抗體，洗板，加酶，洗板，顯色，終止反應(yīng)，讀板：終止后 10 min內(nèi)，使用檢測波長450 nm、校正波長610～630 nm 雙波長同時(shí)讀板。

1.7 Real-time PCR檢測不同處理組心肌細(xì)胞RIP1、RIP3、MLKL mRNA水平變化

Trizol提取心肌細(xì)胞總 RNA，酶標(biāo)儀測總RNA的純度和濃度，取3 μg總RNA 作模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，按照Real-time PCR 試劑盒說明書對應(yīng)的Applied Biosystems?Step One Plus 儀器，取2 μl cDNA(50 ng/μl)為模板，加入上下游引物各0.6 μl(終濃度0.3 μmol/L)，SYBR? Premix DimerEraser(2×)10 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl，加入無酶水使總體積為20 μl,進(jìn)行上機(jī)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：(1)預(yù)變性95℃、30 s，(2)變性95℃、5 s，(3)退火60℃、30 s，(4)延伸72℃、34 s，(2)(3)(4)40個(gè)循環(huán)，(5)溶解曲線條件由儀器自動(dòng)生成。用內(nèi)參GAPDH進(jìn)行校正，以正常組作為對照，計(jì)算2-ΔΔCt值為各處理樣品基因的相對表達(dá)量，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 Western blot檢測不同處理組心肌細(xì)胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白水平變化

收集不同批次培養(yǎng)的心肌細(xì)胞沉淀，加入細(xì)胞裂解液(RIPA)和PMSF(終濃度為1 mmol/L)，提取細(xì)胞總蛋白，按照試劑盒說明書檢測蛋白濃度。獲取的蛋白按照40 μg對應(yīng)的體積加樣，進(jìn)行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠)電泳(10%分離膠90 V，5%濃縮膠60 V)。然后轉(zhuǎn)膜，200 mA、120 min。5%的脫脂牛奶(脫脂奶粉+TBST液)常溫封閉150 min，加入RIP1抗體(1∶500)、RIP3抗體(1∶500)、MLKL抗體(1∶800)、GAPDH抗體(1∶ 6 000)，4℃孵育過夜。次日洗膜后，加二抗IgG(1∶ 7 000)，孵育60 min，TBST洗膜后，加入顯影液，凝膠成像系統(tǒng)曝光。以GAPDH為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度值掃描，分別算出RIP1、RIP3、MLKL與GAPDH的灰度值比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同處理組心肌細(xì)胞活力的比較

MTT結(jié)果反映心肌細(xì)胞活力變化。結(jié)果顯示，正常對照組OD值為(0.601±0.033)。與正常對照組相比，高糖組OD值為(0.368±0.010)，心肌細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01)；與高糖組相比，高糖+Nec-1組OD值為(0.528±0.045)，心肌細(xì)胞活力明顯升高(P<0.01)。與正常對照組相比，高滲組OD值(0.567±0.089)，心肌細(xì)胞活力無顯著差異，提示高滲環(huán)境對心肌細(xì)胞活力無明顯影響，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中未設(shè)高滲實(shí)驗(yàn)組。

2.2 不同處理組心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的比較

DHE為活性氧簇的熒光探針，其可穿透活細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，氧化活性氧簇，產(chǎn)生氧化乙啶，并與染色體DNA結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。根據(jù)紅色熒光的強(qiáng)度，可判斷各組心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激變化。正常對照組平均熒光強(qiáng)度為(0.0130±0.0004)；高糖組平均熒光強(qiáng)度為(0.0336±0.0003)，與正常對照組相比，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.01)，提示氧化應(yīng)激水平增高；高糖+Nec-1組平均熒光強(qiáng)度為(0.0204± 0.0010)，與高糖組相比，熒光強(qiáng)度明顯減弱(P<0.01)，提示氧化應(yīng)激水平降低(圖1)。

2.3 不同處理組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6及 IL-1β水平的比較

與正常對照組相比，高糖組TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高明顯(P<0.01)；與高糖組相比，高糖+Nec-1組TNF-α、IL-6及IL-1β水平明顯降低(P<0.01，表1)。

Tab. 1 Levels of TNF-α,IL-6 and IL-1β in different groups n=5)

HG:High glucose group;HG+Nec-1:High glucose+necrostatin-1 group;TNF-α:Tumor necrosis factor-α;IL-6:Interleukin-6;IL-1β:Interleukin-1β
**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group

2.4 不同處理組心肌細(xì)胞中RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白表達(dá)的比較

與正常對照組相比，高糖組中RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)；與高糖組相比，高糖+Nec-1組RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白表達(dá)均降低(P<0.05～0.01，表2，3、圖2)。

Tab. 2 Expressions of RIP1,RIP3 and MLKL at mRNA level in cardiomyocytes in different groups n=5)

RIP1:Receptor interacting serine/threonine protein kinase 1;RIP3:Receptor interacting serine/threonine protein kinase 3;MLKL:Mixed lineage kinase domain-like protein
**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group

RIP:Receptor interacting serine/threonine protein kinase;MLKL:Mixed lineage kinase domain-like protein

Tab. 3 Changes of RIP1,RIP3 and MLKL protein expressions in cardiomyocytes in different groups n=4)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group

3 討論

糖尿病心肌損傷是糖尿病最嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量。高血糖引起心肌氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、心肌纖維化、細(xì)胞死亡等，最終導(dǎo)致心力衰竭[9,10]。我們通過檢測觀察到高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞活力明顯下降，高滲對心肌細(xì)胞活力無明顯影響，提示高糖本身可模擬糖尿病高血糖狀態(tài)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。

慢性炎癥和氧化應(yīng)激在高血糖引起的心血管并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用。高血糖引起炎癥因子和氧自由基生成增加，導(dǎo)致細(xì)胞功能損害[11,12]。文獻(xiàn)報(bào)道，TNF-α刺激程序性壞死發(fā)生，且可刺激炎癥反應(yīng)[13]。多種信號如脂多糖、鈣離子載體、細(xì)胞因子等和一些病理狀態(tài)如外傷、細(xì)菌和病毒感染、自身免疫性疾病、炎癥等均能上調(diào)IL-6水平。IL-1β通常在正常細(xì)胞中分泌較少，但在應(yīng)對刺激如炎癥物質(zhì)、感染、細(xì)菌性內(nèi)毒素時(shí)，IL-1β水平明顯提高。疾病進(jìn)展期間減緩炎癥和氧化應(yīng)激可能是治療高血糖引起心血管疾病的潛在治療手段之一。本實(shí)驗(yàn)觀察到，與正常對照組相比，高糖處理的心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加，TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯升高，提示高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的發(fā)生。但高糖如何引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)值得探討。

長期以來細(xì)胞壞死都被認(rèn)為是一種被動(dòng)且不可調(diào)控的過程。近年研究表明，細(xì)胞壞死也是受到精密調(diào)控的，程序性壞死作為規(guī)律性細(xì)胞死亡形式之一與許多疾病的病理和器質(zhì)損傷密切相關(guān)，可能涉及細(xì)胞內(nèi)感染的防御過程[14]。文獻(xiàn)報(bào)道，心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧時(shí)，RIP1、RIP3蛋白表達(dá)水平顯著升高，D-半乳糖致衰老小鼠模型中，抑制RIP1通過抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)改善腦損傷[15,16]。本研究中，我們觀察到原代心肌細(xì)胞在高糖干預(yù)后，炎癥反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)，程序性壞死關(guān)鍵介質(zhì)RIP1、RIP3和MLKL的mRNA水平和蛋白表達(dá)均升高，提示高糖可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生；程序性壞死本身可能誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

據(jù)報(bào)道，抑制程序性壞死的發(fā)生對體內(nèi)外動(dòng)物心肌損傷均發(fā)揮有益作用。RIP1-RIP3復(fù)合物的形成和磷酸化是necroptosis的關(guān)鍵性和特異性步驟，是necroptosis發(fā)生的標(biāo)志[17,18]。Nec-1是RIP1選擇性變構(gòu)抑制劑，特異性抑制RIP1的激酶活性及RIP1和RIP3的相互作用[19]，Nec-1在小鼠及豬心肌缺血/再灌注損傷中均可抑制程序性壞死，保護(hù)心肌免受損傷[20-22]，Nec-1抑制程序性壞死途徑減緩百草枯誘導(dǎo)的心臟收縮功能障礙[23]，提示各種誘因誘發(fā)的心肌損傷中，抑制程序性壞死可發(fā)生保護(hù)作用。本研究中，高糖處理的心肌細(xì)胞中給予Nec-1抑制RIP1后，RIP1、RIP3和MLKL的mRNA水平和蛋白表達(dá)均降低的同時(shí)心肌細(xì)胞存活率增高，ROS的產(chǎn)生和炎癥因子釋放減少，進(jìn)一步表明程序性壞死與心肌損傷中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。抑制程序性壞死可減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中伴有程序性壞死的發(fā)生。抑制程序性壞死可能通過減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)而減弱高糖誘導(dǎo)的心肌損傷。如何有效對抗程序性壞死的發(fā)生可能是治療糖尿病心肌損傷的重要途徑之一。