改良的大鼠模擬失重模型制備方法*

付子豪，王 臻，吳 潔，楊紅燕，張 星，高 峰，李 嘉

(空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系，陜西 西安 710032)

大鼠后肢去負(fù)荷(hindlimb unloading)作為地面研究模擬失重(weightlessness simulation)的動物模型已被學(xué)術(shù)領(lǐng)域廣泛接受和認(rèn)可[1]。目前已有的大鼠后肢去負(fù)荷方法包括尾部懸吊(tail suspension)，背部懸吊(back harness suspension)和骨盆懸吊(pelvic suspension)[2]等。尾部懸吊由于實驗動物應(yīng)激小的優(yōu)點逐漸為國內(nèi)外實驗室所采用[3-5]。目前模擬失重模型的制備方法主要參考Morey-Holton等[1]和陳杰等[6]進行整理和改進的經(jīng)典方法，該方法通過使用縱向牽引膠帶(traction tape)粘貼大鼠尾部，橫向固定膠帶(filament tape)纏繞，外層用紗布包裹固定使尾套與大鼠尾部緊密貼合，可實現(xiàn)長達120 d的長期尾吊。但是該方法要求操作者在包裹鼠尾和懸吊大鼠后肢方面具有較豐富的經(jīng)驗，能夠較好把握橫向固定膠帶和外層紗布包裹的松緊程度，因為包裹過緊容易影響大鼠尾部血液供給導(dǎo)致遠(yuǎn)端缺血、畸形和壞死；包裹過松易導(dǎo)致大鼠尾部與尾套粘合不牢，從而脫落滑出。本研究旨在改進尾套制作及包裹固定的方法，以制備簡單易行、成功率高的大鼠模擬失重模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量260～280 g，來源于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(軍)2012-0005。本實驗遵照空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物飼養(yǎng)和使用規(guī)定進行，符合倫理要求。

1.2 試劑與儀器

安息香(美國Sigma-Aldrich公司,貨號V900584)；松香；無水乙醇；醫(yī)用棉布基膠帶；紗布；塑料小管；魚線轉(zhuǎn)環(huán)；聚乙烯發(fā)泡棉網(wǎng)套；帆布套；大鼠尾部懸吊籠。

1.3 動物分組

90只SD大鼠隨機分為3組：經(jīng)典尾吊組，改良尾吊組和對照組，每組30只。

1.4 模型大鼠尾部處理

輕柔抓取待懸吊大鼠，使其鉆入帆布套內(nèi)限動，僅露出尾部(圖1A)，黑暗安靜的環(huán)境有助于減小應(yīng)激，方便操作。用肥皂水(或酒精)仔細(xì)清洗去除尾部皮膚表面污垢，吹風(fēng)機吹干。無水乙醇分別溶解安息香及松香至飽和狀態(tài)。用棉簽蘸取適量安息香酊，均勻涂抹尾部粘貼區(qū)(從根部起始至少覆蓋尾部表面積三分之二)，吹干后重復(fù)該步驟兩次，使得粘貼區(qū)均勻覆蓋安息香以增加皮膚表面澀度，安息香也可起到防腐止痛作用。按照同樣操作方法涂抹松香酊并吹干，重復(fù)2次，松香可增加尾部皮膚表面的黏性(圖1)。

1.5 模型大鼠尾套制作

剪取大約兩倍于粘貼區(qū)長度的膠帶作為縱向牽引膠帶，中點處放置與膠帶條等寬塑料小管。將牽引膠帶沿尾根部開始粘貼，覆蓋粘貼區(qū)后繞過小管粘貼于對側(cè)尾部表面，輕輕按壓貼緊。膠帶的寬度根據(jù)大鼠尾根部的粗細(xì)程度選擇，保證鼠尾兩側(cè)牽引膠帶之間無重疊。剪取3或4條短膠帶按照均勻間隔以C字形纏繞牽引膠帶(圖1B)。改良尾吊組大鼠用聚乙烯發(fā)泡棉網(wǎng)套包裹鼠尾。聚乙烯發(fā)泡棉網(wǎng)套的長度應(yīng)與牽引膠帶覆蓋區(qū)域一致，寬度接近于鼠尾尾根處周長，各網(wǎng)格邊長約為1 cm。尾套外層用寬約3～4 cm，長約25 cm的紗布將聚乙烯發(fā)泡棉網(wǎng)套和鼠尾一同裹緊固定。經(jīng)典尾吊組大鼠無聚乙烯發(fā)泡棉網(wǎng)套層，只用紗布包裹。塑料小管內(nèi)穿入曲別針并與魚線轉(zhuǎn)環(huán)相連，魚線轉(zhuǎn)環(huán)可以360°旋轉(zhuǎn)使大鼠利用前肢活動時方向不受限制(圖1C)。對照組大鼠尾部不做特殊處理。

1.6 模型大鼠尾部懸吊方法

將尾套制作好的大鼠從帆布套中取出放入尾部懸吊籠內(nèi)，每籠1只。將魚線轉(zhuǎn)環(huán)與吊臂上的滑輪相連，調(diào)節(jié)吊臂高度使大鼠后肢懸空去負(fù)荷，保證后肢完全伸直時無法觸及鼠籠底面即可。大鼠始終處于頭低位狀態(tài)，軀干與鼠籠底面形成大約30°角。隨著大鼠生長發(fā)育，后肢長度增加將接觸鼠籠底面恢復(fù)承重，操作者需要每5 d左右提升一次吊臂高度維持后肢去負(fù)荷。每日觀察大鼠整體健康狀況是否良好，尾套是否脫落。自由進食、飲水，(23±2)℃環(huán)境溫度，12 h/12 h光/暗交替循環(huán)條件下飼養(yǎng)。對照組飼養(yǎng)在相同懸吊籠內(nèi)，各項條件與懸吊組保持一致(圖2)。尾吊時間為4周，實驗結(jié)束后觀察大鼠尾部損傷和尾套脫落情況，測量大鼠體質(zhì)量及右側(cè)比目魚肌濕重。尾吊模型構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)為比目魚肌濕重及占體質(zhì)量比顯著降低，體質(zhì)量增加且與對照組無顯著差別，尾部無缺血壞死等嚴(yán)重?fù)p傷，尾套貼合緊密未脫落，完全符合以上四項指標(biāo)評估為模型構(gòu)建成功。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量、比目魚肌濕重及比目魚肌濕重占體質(zhì)量比值

尾吊結(jié)束后，對照組、經(jīng)典尾吊組和改進尾吊組大鼠體質(zhì)量較尾吊前均顯著增加(P<0.01)，三組之間最終體質(zhì)量無顯著差異(P>0.05)。但經(jīng)典尾吊組和改良尾吊組的比目魚肌濕重較對照組均顯著降低(P<0.01)，比目魚肌濕重占體質(zhì)量比值較對照組均顯著減小(P<0.01，表1)。

Tab. 1 Body weight and right soleus wet weight of rats in three different n=30)

**P<0.01vsthe control group;##P<0.01vsbaseline in the same group

2.2 尾部并發(fā)癥發(fā)生率及模型成功率

操作者每日密切觀察大鼠整體健康狀況。大鼠可利用前肢自由活動、飲食和進水，精神狀態(tài)良好。但隨著大鼠不斷生長，尾部直徑增加，部分經(jīng)典尾吊組大鼠由于尾套包裹過緊出現(xiàn)尾部遠(yuǎn)端缺血壞死情況，尾部缺血壞死的發(fā)生率為40.0%。尾套包裹過松使得尾套脫落的發(fā)生率為26.7%，模型成功率為33.3%。與經(jīng)典尾吊組相比，改良尾吊組的尾部損傷程度明顯降低(圖3)，遠(yuǎn)端缺血壞死率為13.3%(P<0.05),尾套脫落率為3.3%(P<0.05)，而模型成功率提高至83.3%(P<0.01，表2)。無模型同時出現(xiàn)尾部缺血壞死和尾套脫落兩種并發(fā)癥。

Tab. 2 The incidence of rat tail complications and success rates of models between the two groups(n=30)

#P<0.05，##P<0.01vsthe classical suspension group

3 討論

在長期失重環(huán)境中，重力缺失將引起機體生理功能的顯著變化，對肌肉骨骼、心血管、免疫、泌尿，神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌代謝等多系統(tǒng)產(chǎn)生不同影響[7]。構(gòu)建地面模擬失重模型對于闡明空間失重環(huán)境改變機體生理功能的機制，從而進一步研究對抗措施，預(yù)防或逆轉(zhuǎn)可能潛在的嚴(yán)重?fù)p害具有重要意義[8,9]。地面模擬失重模型相較于直接在空間環(huán)境進行失重實驗有許多優(yōu)勢：(1)實驗周期的設(shè)計不需要考慮空間飛行任務(wù)和機組成員的時間安排；(2)太空飛行對艙內(nèi)環(huán)境要求苛刻，許多實驗操作無法在太空艙內(nèi)進行；(3)可實現(xiàn)以較小的代價及時調(diào)整實驗方案和多次重復(fù)實驗；(4)動物模型可在實驗過程中隨時麻醉取材等[1]。

大鼠是地面模擬失重模型最常用的動物[10]。上世紀(jì)80年代，Morey-Holton等[7,11]構(gòu)建了大鼠尾部懸吊法使后肢去負(fù)荷，體液頭向轉(zhuǎn)移，模擬航天員在太空時機體發(fā)生的改變。與軀干整體懸吊相比，尾部懸吊大鼠血漿皮質(zhì)酮水平較低，體質(zhì)量無明顯減輕，應(yīng)激程度小[12,13]。尾部懸吊逐漸成為目前最主要的制備大鼠模擬失重的方法。其操作步驟經(jīng)過許多改進，陳杰等[6]完善的尾吊方法實現(xiàn)了長期尾吊，減輕了尾部損傷，引用次數(shù)超過300余次；Morey-Holton等[1]總結(jié)的詳細(xì)模型制備技術(shù)引用次數(shù)超過500余次；Marjolein等[14]用注射器針筒包繞尾套能夠防止大鼠撕咬牽引膠帶等。

構(gòu)建尾部懸吊模型關(guān)鍵步驟是制作包裹鼠尾的尾套。目前經(jīng)典尾部懸吊方法存在薄弱點，即要求操作者有較為豐富的尾套制作經(jīng)驗，能夠控制好外層紗布包裹固定鼠尾的松緊程度。否則在進行尾吊實驗特別是4周以上的長期尾吊時，大鼠尾部易出現(xiàn)如缺血壞死或尾套脫落等并發(fā)癥，造成模型構(gòu)建失敗，例如尾部缺血壞死，甚至感染壞疽對大鼠體內(nèi)免疫、代謝等功能產(chǎn)生不良影響，對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。模型構(gòu)建成功率較低也會增加模型制備的整體工作量。針對該薄弱環(huán)節(jié)本研究進行簡便易行的改進，創(chuàng)新性地在C字形橫向固定膠帶和紗布之間增加一層聚乙烯發(fā)泡棉網(wǎng)套。該網(wǎng)套材質(zhì)柔軟，彈性和延展性較好，既保持牽引膠帶對鼠尾的緊密貼合防止尾部脫落，又形成緩沖避免對鼠尾硬性擠壓從而保證遠(yuǎn)端血液循環(huán)。聚乙烯發(fā)泡棉在生活中易于獲得(常用于食品包裝)，網(wǎng)套制作快捷簡便。改進的尾吊模型制備方法優(yōu)越性在于降低了對實驗者尾套制作經(jīng)驗的要求，整體減少了工作時間，提高了模型制備成功率，實用性強。本研究還發(fā)現(xiàn)，牽引膠帶應(yīng)具有較高的強度，否則大鼠體質(zhì)量不斷增加易使膠帶斷裂。故不建議使用目前常見的紙基透氣醫(yī)用膠帶，而換用黏性和強度更高的棉布基膠帶。

除尾套制作方法外，大鼠模擬失重模型還有其他值得探討改良之處。例如，目前大鼠的尾吊角度即大鼠軀干與水平面所形成的夾角大多為30°，該角度下大鼠前肢承重約為自身體質(zhì)量的一半，與非尾吊大鼠相似。該角度使大鼠的腰椎去負(fù)荷而頸椎保持正常狀態(tài)，體液頭向轉(zhuǎn)移[1,15]。孫聯(lián)文等[16]研究發(fā)現(xiàn)，非尾吊大鼠在站立狀態(tài)和休息狀態(tài)等不同的姿態(tài)下，前肢承重也不相同。要使尾吊大鼠前肢承擔(dān)與正常站立狀態(tài)時的44.6%相同,其尾吊角度根據(jù)公式經(jīng)計算后應(yīng)為35°；而要與休息時正常大鼠的前肢承重相當(dāng),尾吊角度達63°左右。此外，正常大鼠約有40%的時間前肢幾乎不承重。如果從大鼠前肢承重考慮,30°尾吊角度則偏小。如何根據(jù)實際研究內(nèi)容，結(jié)合不同系統(tǒng)(運動、循環(huán)、免疫等)不同部位(前肢、后肢)之間差別，從而合理調(diào)整大鼠尾部懸吊角度，改良大鼠模擬失重模型制備的其他環(huán)節(jié)，需要更進一步的研究。