5種海藻在刺參幼參飼料中的應(yīng)用研究*

王曉艷 喬洪金 黃炳山 王成強(qiáng) 李培玉 李寶山 王際英

(山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺 264006)

仿刺參(Apostichopus japonicus)，也稱為刺參，是經(jīng)濟(jì)效益很高的增養(yǎng)殖種類之一。海參作為世界八大珍品之一，以高蛋白、黏多糖豐富及不含膽固醇著稱，隨著其價(jià)值知識的普及，刺參逐漸進(jìn)入尋常百姓餐桌。刺參需求量的增大，引起養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和飼料產(chǎn)業(yè)的迅速擴(kuò)大，而關(guān)于海參營養(yǎng)需求的研究尚處于摸索階段，營養(yǎng)需求標(biāo)準(zhǔn)缺乏，飼料研究落后于產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。鼠尾藻(Sargassum thunbergii)和馬尾藻(Sargassum)被認(rèn)為是最優(yōu)質(zhì)的刺參餌料，由于過度開采已經(jīng)不能滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要。天然海域中，刺參主要以沉積物中的單細(xì)胞藻類、原生動(dòng)物、細(xì)菌、大型海藻碎屑及海泥為食，因?yàn)榇虆?yōu)先選擇棲息在富含大型海藻的海域，充足的大型海藻碎屑是海參的主要食物來源，所以大型海藻成為人工配合飼料的主要原料。目前已有不少研究報(bào)道，部分大型海藻用于刺參養(yǎng)殖取得了不錯(cuò)的投喂效果(Wenet al,2016; 殷旭旺等,2015; 李猛等,2017; 唐薇等,2014; 葛立保等,2017; 朱建新等,2007)。石莼(Ulva lactucaL.)和海帶(Saccharina japonica)是中國北方很受歡迎且價(jià)格較低的大型海藻，含有豐富的纖維素、碳水化合物、蛋白質(zhì)、各種微量元素和多糖類，目前已廣泛應(yīng)用于刺參養(yǎng)殖中。銅藻(Sargassaum horneri)是中國暖溫帶海域淺海區(qū)海藻場的主要連片大型褐藻物種，植株高大，枝葉繁茂，多生長在潮下帶淺海巖礁上，成片漂浮水面，堪稱“海中森林”，銅藻不但含有豐富的藻膠、纖維素、半纖維素及礦物質(zhì)，而且生物活性物質(zhì)含量相當(dāng)高，作為工業(yè)、食品原料資源具有極大的開發(fā)潛力，可惜目前還沒有被廣泛開發(fā)利用(鄭海羽等,2008)。海帶渣為工業(yè)提膠的剩余產(chǎn)品，干海帶加水浸泡后切碎，甲醛固色，在加熱條件下，利用碳酸氫鈉消化后過濾，濾液用于提取海藻酸鈉，不溶性組分干燥后得到海帶渣原料，所以，海帶經(jīng)過有效成分提取后，仍存在許多粗蛋白、粗纖維和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，用來制作刺參餌料可實(shí)現(xiàn)海帶渣的高值化利用，這一部分資源的利用可使海帶干物質(zhì)的利用率高達(dá)45%左右(張俊杰等,2010)。本研究在刺參幼參配合飼料中添加海帶粉、海帶渣粉、銅藻粉及石莼粉，與鼠尾藻的飼喂效果作對比研究，并探討混合藻粉的應(yīng)用效果，以期為大型海藻在刺參人工配合飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以魚粉、小麥粉、海泥等為主要原料，對照組為鼠尾藻粉(D1購自萊州市海福飼料有限公司)，分別用銅藻粉(D2采集于江蘇省鹽城市大豐區(qū)養(yǎng)殖水域; 菌落總數(shù) 20840 CFU/g; 大腸桿菌 16 MPN/100 g; 沙門氏菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌均未檢出)、海帶粉(D3購自青島匯福林海洋生物科技有限公司)、海帶渣(D4購自青島匯福林海洋生物科技有限公司)、石莼粉(D5購自青島海之源飼料科技有限公司)及 5種海藻粉等比例混合(1∶1∶1∶1∶1; D6)替代鼠尾藻，配制成6種實(shí)驗(yàn)飼料，每種實(shí)驗(yàn)飼料包含30%的藻粉。將所有實(shí)驗(yàn)原料逐級混勻，與適量新鮮蒸餾水混合，用螺旋擠壓機(jī)加工成厚度為2 mm的片狀飼料，室溫風(fēng)干至水分為5%左右，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。飼料配方及基本營養(yǎng)組成見表1，實(shí)驗(yàn)飼料氨基酸組成見表2。

1.2 飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)用刺參幼參購于山東安源水產(chǎn)股份有限公司，正式實(shí)驗(yàn)前，于實(shí)驗(yàn)所用循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，用對照組(鼠尾藻組)飼料投喂14 d，使刺參幼參適應(yīng)養(yǎng)殖系統(tǒng)的條件及實(shí)驗(yàn)飼料。選取540頭規(guī)格統(tǒng)一、體質(zhì)健康、初始體重為(10.02±0.03) g的刺參隨機(jī)分配到 18 個(gè)玻璃鋼水槽內(nèi)(Φ 65 cm×80 cm)，實(shí)驗(yàn)分為 6組，每組3個(gè)平行，每個(gè)平行30頭刺參，每個(gè)桶內(nèi)放置2個(gè)聚乙烯波紋板筐作為刺參的遮蔽物。每天定時(shí)定量投喂1次(16:00)，初始投喂量為刺參總濕重的2%，觀察攝食情況并及時(shí)調(diào)整投喂量。每3 d采用虹吸法吸出殘餌及糞便，實(shí)驗(yàn)周期為56 d，實(shí)驗(yàn)期間每天換水量為1/3，控制水溫為(18±2)℃，溶氧＞6 mg/L，pH 為 7.6～8.2，鹽度為 28～32，-N＜0.05 mg/L，-N＜ 0.05 mg/L，光照周期為自然光周期。

1.3 樣品采集

實(shí)驗(yàn)中期開始收集刺參糞便，用鑷子從每個(gè)桶內(nèi)小心夾取完整糞便，用電熱鼓風(fēng)干燥箱 60℃烘干，用于酸不溶性灰分的測定。飼養(yǎng)結(jié)束后禁食48 h，分別對每桶刺參進(jìn)行計(jì)數(shù)并稱總重，每桶隨機(jī)選取 10頭刺參，解剖分離內(nèi)臟、體壁及腸道，稱重后保存于-80℃冰箱備用。另每桶隨機(jī)取 3頭刺參，沿腹中線的右側(cè)解剖(避免破壞腹腸系膜)，剔除呼吸樹后，取中腸 0.8 cm 左右并固定于 Bouin’s液中 24 h 后，保存于70%酒精中，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，進(jìn)行常規(guī)石蠟連續(xù)切片，切片厚度為 7.0 μm，然后經(jīng)H.E染色后，中性樹膠封片并編號，在徠卡高清攝像系統(tǒng)(LEICA ICC50 HD)下觀察并拍照。從-80℃冰箱中取出刺參腸道，冰浴解凍勻漿，4℃離心 20 min (2500 r/min)，上清液(粗酶液)于 4℃保存，用于消化酶和免疫酶活性的測定(24 h內(nèi)測定)。

1.4 計(jì)算公式與實(shí)驗(yàn)方法

增重率(Weight gain rate,WGR,%)，特定生長率(Specific growth rate,SGR,%/d)，存活率(Survival rate,SR,%)，腸體比(Ratio of intestine weight to body weight,IBR,%)，臟體比(Ratio of viserosomatic weight to body weight,VBR,%)，根據(jù)以下公式計(jì)算:

WGR=(Wf-Wi)×100/W1；

SGR=(lnWf-lnWi)×100/T；

SR=(存活數(shù)量/初始數(shù)量)×100；

IBR=(腸道質(zhì)量/體重)×100；

VBR=(內(nèi)臟質(zhì)量/體重)×100

式中，Wi和Wf分別為每個(gè)桶內(nèi)刺參的平均初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量，T為養(yǎng)殖天數(shù)。

表1 飼料配方及營養(yǎng)組成(%)Tab.1 Composition and nutrient levels of the experimental diets (%)

飼料及刺參體壁的水分、粗灰分、粗脂肪及粗蛋白含量分別根據(jù) GB/T6435-2006、GB/T6433-2007、GB/T6433-2006和GB/T5009.5-2003測定，飼料能量采用氧彈燃燒法測定(PARR 6100)，酸不溶性灰分(Acid-insoluble ash)根據(jù) GB/T23742-2009 測定；腸道粗酶液蛋白濃度(考馬斯亮藍(lán)法)、胰蛋白酶(Trypsin)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、α-淀粉酶(α-Amylase)、脂肪酶(Lipase)、總超氧化物歧化酶(Total-superoxide dismutase,T-SOD)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，測定方法均參考試劑盒說明書；飼料氨基酸測定參照國標(biāo)測定方法(GB/T 14924.10- 2008)，采用全自動(dòng)氨基酸測定儀(Hitachi L-8900,日本)測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用 Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 不同藻粉對刺參生長性能、形體指標(biāo)及存活率的影響

不同海藻粉對刺參的生長性能具有顯著影響，如表3結(jié)果顯示，混合藻粉組與對照組的刺參WGR和SGR顯著高于其他各組(P＜0.01)，銅藻組與海帶組差異不顯著(P＞0.05)，但顯著低于石莼組(P＜0.01)，海帶渣組最低；海帶渣組刺參的 IBR和 VBR均顯著低于其他各組(P＜0.05)，其他各組間差異不顯著(P＞0.05)；不同海藻粉對刺參SR影響不顯著(P＞0.05)。

表2 實(shí)驗(yàn)飼料氨基酸組成(干物質(zhì)基礎(chǔ),%)Tab.2 Amino acids composition of experimental diets (Dry matter basis,%)

表4結(jié)果顯示，飼料中添加海帶、海帶渣、石莼及混合藻粉均能提高刺參的體壁粗蛋白含量，但與對照組差異不顯著(P＞0.05)，不同海藻粉對刺參體壁水分、粗灰分和粗脂肪影響不顯著(P＞0.05)。

2.2 不同海藻粉對刺參消化酶活性的影響

鼠尾藻和混合藻粉組刺參腸道胰蛋白酶活性顯著高于海帶、海帶渣和石莼組(P＜0.05)，銅藻組與對照組差異不顯著(P＞0.05)；海帶渣及石莼粉組刺參腸道的糜蛋白酶活性顯著低于其他各組(P＜0.05)，其他各組間差異不顯著(P＞0.05)；不同處理組α-淀粉酶和脂肪酶活性差異不顯著(P＞0.05)；銅藻組刺參糞便的酸不溶性灰分顯著高于對照組(P＜0.01)，其他各組均顯著低于對照組(P＜0.01)(表5)。

2.3 不同海藻對刺參非特異性免疫性能的影響

由表6可見，不同海藻對刺參非特異性免疫具有顯著影響，海帶渣組刺參腸道 T-SOD活性顯著低于其他各組(P＜0.01)，混合藻粉組顯著高于銅藻、海帶及石莼組(P＜0.01)；海帶渣組刺參腸道 MDA含量顯著高于其他各組(P＜0.01)，石莼組顯著低于對照組(P＜0.01)，混合藻粉組與對照組差異不顯著(P＞0.05)；不同藻粉對刺參的 ACP、AKP活性具有顯著影響(P＜0.01)，海帶渣組刺參的 ACP活性顯著低于對照組及混合藻粉組(P＜0.01)，其余各組與對照組差異不顯著(P＞0.05)；銅藻、海帶渣及石莼組腸道AKP活性顯著低于對照組(P＜0.01)，混合藻粉組與對照組差異不顯著(P＞0.05)。

表3 不同藻粉對刺參生長性能、形體指標(biāo)及存活率的影響Tab.3 Effects of different seaweeds on the growth performance,morphological parameters and survival rate of A.japonicus

表4 不同海藻粉對刺參體壁組成的影響Tab.4 Effects of different seaweeds on the body wall composition of A. japonicus

表5 不同海藻粉對刺參消化酶活性的影響Tab.5 Effects of different seaweeds on the digestive enzyme activities of A.japonicus

表6 不同海藻對刺參非特異性免疫性能的影響Tab.6 Effects of different seaweeds on the nonspecific immune performance of A.japonicus

2.4 不同海藻對刺參腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

圖1為 6組飼料投喂下刺參的中腸橫切組織結(jié)構(gòu)。由圖1可見，不同海藻對刺參腸道組織結(jié)構(gòu)影響 顯著，鼠尾藻和混合藻粉組刺參腸道皺襞高度明顯大于其他各組，且皺襞面積較大，銅藻組及海帶渣組皺襞高度最小，且皺襞面積最小，海帶組及石莼組皺襞高度居中。

3 討論

海藻為刺參生長所必需，飼料中添加30%的藻粉能最大程度提高刺參的生長性能(Yuanet al,2006)，而鼠尾藻是公認(rèn)的刺參優(yōu)質(zhì)餌料，在本實(shí)驗(yàn)條件下，銅藻粉、海帶粉、海帶渣及石莼粉對刺參的增重效果均不如鼠尾藻，然而，混合藻粉卻達(dá)到了與鼠尾藻相同甚至更優(yōu)的增重效果，這可能是因?yàn)?，多種海藻粉混合營養(yǎng)更全面，彌補(bǔ)了單一海藻營養(yǎng)不均衡的問題，與Gao等(2011)對刺參的研究結(jié)果一致。銅藻的氨基酸組成與鼠尾藻相似(表2)，但促生長效果卻明顯不及鼠尾藻，可能是因?yàn)槠涔劝彼岷?2.78)明顯低于鼠尾藻組(3.33)，而谷氨酸是一種呈味氨基酸 (劉長琳等,2015)，能增強(qiáng)動(dòng)物食欲，提高攝食量。本研究中海帶渣組刺參的IBR和VBR均顯著低于其他各組，可能是因?yàn)楹г谔崛『衷逅徕c過程中，為了保證提取物的色澤而加入的甲醛等固色劑部分殘留，影響了刺參的消化功能，而海帶渣組的SR與其他各組差異不顯著，表明海帶渣對刺參的SR無不利影響，但不利于腸道的消化吸收，郝繼浦(2014)研究表明，利用海帶渣生產(chǎn)刺參餌料，刺參的生長性能顯著低于配合飼料組(P＜0.05)，與本研究結(jié)果相似。

圖1 不同海藻對刺參腸道組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of different seaweeds on intestinal tissue structure of A.japonicus

刺參食道和胃都很短，僅起到運(yùn)輸和機(jī)械處理內(nèi)吞食物的作用，刺參無特化的消化腺(崔龍波等,2000; 李旭等,2013)，前腸和中腸有腺細(xì)胞，能分泌消化酶，對食物進(jìn)行細(xì)胞外消化(王吉橋等,2007)，本研究中，刺參腸道蛋白酶活性較高，且受不同藻類影響顯著，而脂肪酶活性較低，表明刺參對不同藻類蛋白的吸收能力不同，對脂肪的耐受性低(Seoet al,2011)，多項(xiàng)研究也證明了刺參腸道具有較高的蛋白酶活性和較低的脂肪酶活性(唐黎等,2007; 姜令緒等,2007;趙斌等,2015)，與本研究結(jié)果一致。銅藻和海帶渣組刺參腸道消化酶活力較低，證明刺參對其消化吸收能力較弱。與此一致，本研究中銅藻及海帶渣組刺參腸道皺襞高度明顯低于對照組及混合藻粉組，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，而腸絨毛的完整性及高度是營養(yǎng)物質(zhì)被消化吸收的基本保障，可能是因?yàn)橄纼?nèi)褐藻酸酶活力較低(唐黎等,2007)，刺參對銅藻和海帶渣的吸收能力較弱，絨毛之間的隱窩細(xì)胞分裂速度降低，不能及時(shí)分化遷移，補(bǔ)充正常脫落的絨毛上皮(王吉橋等,2007; 孫麗娜,2013)，消化吸收的表面積減少，從而影響了對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。此外，酸不溶性灰分是指示飼料消化率的有效指標(biāo)(Liet al,2008)，本研究中，海帶、石莼及混合藻粉組的酸不溶性灰分均顯著低于對照組，銅藻顯著高于對照組，海帶渣與對照組差異不顯著，表明刺參對海帶、石莼及混合藻粉的消化吸收率較高，對銅藻和海帶渣的消化吸收率低，可能因?yàn)檩^銅藻而言，海帶和石莼的質(zhì)地較軟，易被刺參腸道破壞。

T-SOD、ACP和AKP是評價(jià)刺參機(jī)體免疫力的重要指標(biāo)。T-SOD是機(jī)體清除活性氧的關(guān)鍵防御酶，其活性直接指示免疫系統(tǒng)的狀態(tài)及清除自由基的能力(楊寧等,2016; 秦搏等,2015; 董曉亮等,2013)，MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化的終產(chǎn)物，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子交聯(lián)聚合(Wakitaet al,2011)。在本研究中，海帶渣組刺參的氧化產(chǎn)物MDA含量顯著高于其他各組，T-SOD活性顯著低于其他各組，表明該組刺參體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)較為嚴(yán)重，機(jī)體清除自由基的能力較弱，混合藻粉組 T-SOD活性與對照組差異不顯著，但均顯著高于其他各組，表明多種藻粉混合飼喂刺參可以有效提高機(jī)體清除自由基的能力，提高刺參的抗氧化性能。ACP和AKP是溶酶體酶的重要組成部分(鄭慧等,2014)，同時(shí)還是刺參體內(nèi)參與免疫防御活動(dòng)的重要水解酶，在刺參抵抗疾病、免疫反應(yīng)及細(xì)胞損傷修復(fù)過程中具有一定的生物學(xué)意義(李繼業(yè),2007)。在本研究中，海帶、海帶渣、石莼及混合藻粉組的刺參腸道ACP和AKP活性顯著高于對照組和銅藻組，可能是因?yàn)楹Ш褪恢泻休^多微量元素及多糖成分，能激活免疫相關(guān)酶活性，從而有效提高刺參的免疫性能(李丹彤等,2014)。研究證實(shí)，刺參大部分的免疫反應(yīng)都是由阿米巴吞噬細(xì)胞介導(dǎo)，Canicatti(1990)在刺參H.polii阿米巴吞噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ACP、AKP、β-葡萄糖酶、氨基多肽酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和脂酶等多種溶酶體酶，同時(shí)在包囊體中也檢測到了ACP活性。

4 結(jié)論

通過對刺參生長性能、非特異性免疫及消化機(jī)能的研究可知，混合藻粉具有跟鼠尾藻相似的飼喂效果，因此建議刺參幼參養(yǎng)殖中多種海藻粉混合使用，以保證刺參營養(yǎng)均衡。