基于TaqMan qPCR檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦樣品中蝦肝腸胞蟲(chóng)并樣檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)*

宋增磊 董 宣 趙若恒 王秀華 武和英 于黨輝 謝國(guó)駟 黃 倢①

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水養(yǎng)殖 流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 大連 116023)

水產(chǎn)養(yǎng)殖是一種典型的大群體操作，其疾病診斷和流行病學(xué)研究是基于少量樣品的測(cè)試而完成的。樣品的代表性是得出正確的疾病診斷結(jié)果和可靠的流行病學(xué)研究結(jié)論的關(guān)鍵，但這一關(guān)鍵在生產(chǎn)中常常被忽視。對(duì)一個(gè)群體進(jìn)行隨機(jī)采樣時(shí)，達(dá)到95%可信度的采樣率所需被全部檢測(cè)到的樣品數(shù)量與群體中疫病的不同流行率及群體大小相關(guān)，以含有10萬(wàn)個(gè)以上個(gè)體的大群體為例，在2%的疾病流行率時(shí)的被檢測(cè)的樣本數(shù)要求達(dá)到150；10%流行率時(shí)要求達(dá)到 30個(gè)樣本(Ossianderet al,1973)，這樣的采樣率在實(shí)際生產(chǎn)的診斷應(yīng)用中如果都進(jìn)行單尾檢測(cè)會(huì)造成極高的成本，使養(yǎng)殖業(yè)者難以承受，而并樣檢測(cè)則能夠降低成本，但也很容易造成假陰性的現(xiàn)象。因此，需對(duì)并樣檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估，來(lái)保證診斷結(jié)果的可靠性和可行性(Williamset al,2001)。在OIE標(biāo)準(zhǔn)及美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)中，都有最多每5個(gè)個(gè)體進(jìn)行并樣的建議，但這樣的并樣方法在水生動(dòng)物疾病研究中并沒(méi)有明確的研究數(shù)據(jù)支持(OIE,2017; FHS,2014)。在陸生動(dòng)物疾病研究中，也只有少量研究報(bào)道(Mu?oz-Zanziet al,2000; Arnoldet al,2009; Rovira,2008)。因此，有必要對(duì)水生動(dòng)物疾病樣品檢測(cè)中的并樣問(wèn)題開(kāi)展研究。

自2003年以來(lái)，泰國(guó)養(yǎng)殖斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢綜合征(MSGS)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(Chayaburakulet al,2004)。在2009年，泰國(guó)研究者在生長(zhǎng)緩慢的斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺中檢測(cè)到蝦肝腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP) (Tourtipet al,2009)，EHP感染并沒(méi)有明顯的臨床病變特征，對(duì)于該病原的診斷主要通過(guò)組織學(xué)觀察、PCR法、地高辛標(biāo)記核酸探針原位雜交法以及LAMP檢測(cè)方法(Tangprasittipapet al,2013; Suebsinget al,2013)。2013年，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)研究室建立了EHP的SYBR Green qPCR方法，并首次在中國(guó)養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)中檢出EHP。進(jìn)一步對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦群體的單尾EHP載量和體長(zhǎng)關(guān)系分析表明，對(duì)蝦肝胰腺樣品總DNA(HpDNA)中EHP載量在103copies/(ng HpDNA)以上時(shí)，代表了較高的風(fēng)險(xiǎn)水平(劉珍等,2016)。Liu等(2018)建立了EHP的TaqMan探針qPCR方法，靈敏度高于SYBR Green qPCR和套式PCR方法，并證實(shí)上述EHP載量與對(duì)蝦生長(zhǎng)關(guān)系的存在，這些研究為EHP的檢測(cè)和防控提供了多項(xiàng)技術(shù)手段。

EHP的定量檢測(cè)對(duì)于養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)的判定具有重要意義，但針對(duì)大抽樣量存在過(guò)高的檢測(cè)工作量和成本問(wèn)題，為了提高EHP檢測(cè)的適用性和有效性，有必要考慮應(yīng)用并樣檢測(cè)方案。本研究以TaqMan qPCR的EHP檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，考察不同并樣方案對(duì)EHP檢測(cè)的影響，以期為水生動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用和水生動(dòng)物流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

2017年6 月～7月自山東海陽(yáng)和濰坊2家養(yǎng)殖場(chǎng)分批采集凡納濱對(duì)蝦，海陽(yáng)樣品編號(hào)為60401～60450，濰坊樣品編號(hào)為60301～60350、61401～61450和70701～70750。每尾活蝦用3倍以上體積的95%乙醇進(jìn)行保存。

1.2 肝胰腺總DNA提取

95%乙醇中保存的對(duì)蝦肝胰腺組織經(jīng)無(wú)菌海水沖洗去除乙醇后，用一次性解剖刀片切取約30 mg，利用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取處理好的樣品肝胰腺總DNA，用核酸分析儀(NanoDrop 2000c,Thermo)測(cè)定樣品的DNA濃度，并分析提取的DNA質(zhì)量，然后根據(jù)DNA濃度的不同，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)叵♂尯螅瑢NA樣品置于-20℃冰箱保存。

1.3 樣品EHP載量的檢測(cè)

將1.2中保存的DNA樣品用Liu等(2018)建立的TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光qPCR進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)本研究并樣檢測(cè)時(shí)的陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線確定陰性循環(huán)閾值(CtN)為31，對(duì)各樣品EHP載量進(jìn)行計(jì)算。

1.4 樣品的并樣檢測(cè)方案

1.4.1 海陽(yáng)樣品的并樣檢測(cè) 將山東海陽(yáng)的50份樣品按照樣品編號(hào)順序，每5個(gè)為1組，對(duì)每個(gè)樣品取10 μl DNA至1.5 ml離心管中，充分混勻后，確定其濃度仍在200 ng/μl，得到10個(gè)5∶1 (5P)并樣方式的樣品，分別命名為H5P01～H5P10，再對(duì)這10個(gè)樣品采取同樣的方法進(jìn)行并樣，得到2個(gè)25∶1 (25P)并樣方式的樣品，分別命名為H25P01和H25P02。對(duì)這12個(gè)新并樣的樣品進(jìn)行EHP檢測(cè)，與組內(nèi)對(duì)應(yīng)樣品檢測(cè)結(jié)果取平均值進(jìn)行比較。

1.4.2 濰坊樣品的并樣檢測(cè) 將山東濰坊的3次跟蹤采樣的樣品分別按照山東海陽(yáng)樣品的并樣方法進(jìn)行處理，每批樣品得到5∶1 (5P)并樣后的10個(gè)樣品，分別命名為W5P01～W5P30，再對(duì)30個(gè)樣品采取同樣的方法進(jìn)行并樣，得到6個(gè)25∶1 (25P)并樣方式的樣品，分別命名為W25P01～W25P06，接著對(duì)這6個(gè)樣品每2個(gè)進(jìn)行并樣，得到3個(gè)50∶1 (50P)并樣樣品，分別命名為W50P01～W50P03，對(duì)50P的3個(gè)樣品兩兩并樣，得到3個(gè)100∶1 (100P)并樣樣品，分別命名為W100P01～W100P03，最后對(duì)50P的3個(gè)樣品進(jìn)行并樣，得到 1個(gè) 150∶1 (150P)并樣樣品W150P01。對(duì)并樣后的各樣品進(jìn)行 EHP載量檢測(cè)，與單個(gè)樣品檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較。

1.5 并樣檢測(cè)的定性分析

為了考察在不同陽(yáng)性強(qiáng)度的水平下并樣對(duì)陽(yáng)性檢出的影響，通過(guò)劃定不同的假定臨界循環(huán)值(Ca)，分別用海陽(yáng)和濰坊樣品的 EHP檢測(cè)的循環(huán)閾值(Ct)與Ca值比較，樣品擴(kuò)增曲線在Ca值之前升起，即Ct≤Ca，則判定為分析陽(yáng)性，否則為分析陰性，求出不同Ca值的各并樣組陽(yáng)性和陰性數(shù)目。根據(jù)并樣組的單個(gè)樣品分析陽(yáng)性判定并樣組已知陽(yáng)性，即并樣組中有1個(gè)及1個(gè)以上單一樣品為陽(yáng)性，則并樣組為已知陽(yáng)性。以上述陰性和陽(yáng)性數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，計(jì)算不同假定臨界循環(huán)值下的已知陽(yáng)性數(shù)/檢測(cè)到的陽(yáng)性數(shù)、不同并樣模式的已知陽(yáng)性率和測(cè)試陽(yáng)性率、不同已知陽(yáng)性率的各并樣組的已知陽(yáng)性數(shù)/檢測(cè)到的陽(yáng)性數(shù)、低陽(yáng)性率并樣組的已知陽(yáng)性數(shù)和檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)、不同并樣模式的診斷靈敏度和診斷特異性(OIE,2017)。

1.6 并樣檢測(cè)的定量分析

在 Microsoft Excel 2016 中，根據(jù)單一樣品的 EHP載量，按各并樣組進(jìn)行平均，計(jì)算并樣組 EHP的已知載量。與各并樣組實(shí)際檢測(cè)的載量進(jìn)行比較，包括計(jì)算檢測(cè)值與已知載量值的差值和變異系數(shù)，分析已 知載量與實(shí)際檢測(cè)之間的相關(guān)系數(shù)(R)，根據(jù)函數(shù)式n-2，n為樣本數(shù))計(jì)算雙尾概率(P)，以P＜0.05作 為顯著水平，P＜0.01作為極顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 樣品EHP載量的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)山東海陽(yáng) 50個(gè)樣品和山東濰坊 3次采樣的 150個(gè)樣品逐尾進(jìn)行EHP的載量檢測(cè)(表1)。其中，海陽(yáng)群體樣品有 18個(gè)陽(yáng)性，32個(gè)陰性，陽(yáng)性率為36%；濰坊第 1、2次采樣群體中樣品全部為陰性；第3次采樣群體中樣品全部為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100%。

2.2 并樣檢測(cè)結(jié)果的定性分析

2.2.1 不同假定靈敏度下并樣檢測(cè)的陽(yáng)性率 分別對(duì)海陽(yáng)和濰坊樣品進(jìn)行不同模式的并樣檢測(cè)，比較在不同Ca值下，并樣組已知陽(yáng)性數(shù)和檢測(cè)陽(yáng)性數(shù) (表2)。結(jié)果顯示，在低假定靈敏度下，帶陽(yáng)性的并樣實(shí)際檢測(cè)容易出現(xiàn)陰性，5∶1并樣時(shí)，在多種靈敏度下都存在檢出的陽(yáng)性數(shù)量下降的情況，而高靈敏度下實(shí)際檢測(cè)的陽(yáng)性數(shù)量符合已知陽(yáng)性數(shù)量，而50∶1以上并樣的檢測(cè)差異主要出現(xiàn)在極低靈敏度的情況。

2.2.2 不同并樣模式的陽(yáng)性檢出 比較 2個(gè)采樣群體不同并樣模式的分組在 16～31個(gè)臨界循環(huán)的假定靈敏度下總的已知陽(yáng)性率和并樣檢測(cè)陽(yáng)性率(表3)，結(jié)果顯示，較高并樣率下的陽(yáng)性率總是大于或等于較低并樣率下的陽(yáng)性率。從濰坊群體的 50∶1～ 150∶1并樣的已知陽(yáng)性率變化可以看到，對(duì)單一樣品(并樣率 1∶1)并樣或從較低并樣率的樣本再并樣時(shí)，并樣已知陽(yáng)性率變化范圍符合關(guān)系：較低并樣率的陽(yáng)性率≤較高并樣率的陽(yáng)性率≤較低并樣率的陽(yáng)性率×較高并樣率/較低并樣率。當(dāng)并樣前各組陽(yáng)性率相同時(shí)，并樣后就有同樣的陽(yáng)性率，當(dāng)并樣前有各并樣模式中根據(jù)單樣品檢測(cè)結(jié)果推定的已知陽(yáng)性率略高于對(duì)并樣進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)所得出的陽(yáng)性率。

2.2.3 不同陽(yáng)性率并樣的陽(yáng)性檢出 按不同并樣組中個(gè)體的陽(yáng)性率區(qū)間，統(tǒng)計(jì)所有16～31個(gè)臨界循環(huán)的假定靈敏度下各并樣組按單樣品推定的已知陰性或陽(yáng)性的數(shù)量，與并樣組經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所得的相應(yīng)數(shù)量進(jìn)行比較(表4)。結(jié)果顯示，當(dāng)陽(yáng)性率在0.1%～10.0%時(shí)，25∶1～150∶1的并樣組均未測(cè)出陽(yáng)性，陽(yáng)性率為10.1%～20.0%時(shí)，上述并樣組的實(shí)驗(yàn)測(cè)試所得的陽(yáng)性數(shù)量與已知陽(yáng)性數(shù)量也有出入，20.0%陽(yáng)性時(shí)，5∶1并樣組也只測(cè)出已知陽(yáng)性的1/2數(shù)量的陽(yáng)性；陽(yáng)性率在 40.0%的 5∶1并樣組的測(cè)試陽(yáng)性與已知陽(yáng)性也有少量差異，但 30.1%～40.0%陽(yáng)性率的 25∶1～150∶1并樣組所有樣品均檢出了與已知陽(yáng)性數(shù)量相同的結(jié)果；更高陽(yáng)性率的各并樣組的實(shí)驗(yàn)測(cè)試陽(yáng)性數(shù)量與已知陽(yáng)性數(shù)量均沒(méi)有差異。

對(duì)并樣組內(nèi)陽(yáng)性率(即并樣組中的單樣品的陽(yáng)性率)低而未能有效檢出的情況進(jìn)行具體分析(表5)，結(jié)果顯示，在海陽(yáng)樣品中，最終并樣組(25∶1)中有2尾以下對(duì)蝦為陽(yáng)性(陽(yáng)性率8.0%)時(shí)，其相關(guān)的5∶1和25∶1有已知陽(yáng)性的并樣組均未能檢出陽(yáng)性；最終并樣組有3尾對(duì)蝦為陽(yáng)性(陽(yáng)性率12.0%)時(shí)，其相關(guān)的5∶1已知陽(yáng)性的并樣組有部分陽(yáng)性檢出，但25∶1并樣組未能檢出；最終并樣組中有4尾對(duì)蝦為陽(yáng)性(陽(yáng)性率為16.0%)時(shí)，相關(guān)的5∶1并樣組有部分陽(yáng)性檢出，但25∶1的并樣組未能檢出。在濰坊樣品中，最終并樣組(150∶1)有 2尾對(duì)蝦為陽(yáng)性(陽(yáng)性率 1.3%)時(shí)，其相關(guān)的所有5∶1～150∶1并樣組均未能檢出陽(yáng)性；有6尾對(duì)蝦為陽(yáng)性(陽(yáng)性率4.0%)時(shí)，已知陽(yáng)性5∶1并樣組部分能檢出陽(yáng)性，但 25∶1～150∶1的并樣組均未能檢出陽(yáng)性；有10和17尾對(duì)蝦為陽(yáng)性(陽(yáng)性率分別為 6.7%和 11.3%)時(shí)，已知陽(yáng)性的 5∶1、25∶1和50∶1并樣組能有陽(yáng)性檢出，但100∶1和150∶1的并樣均為能檢出。

表1 凡納濱對(duì)蝦樣品中肝胰腺的EHP拷貝數(shù)Tab.1 EHP copies in hepatopancreas of farmed L.vannamei

表2 不同假定靈敏度下并樣組陽(yáng)性情況Tab.2 The positive number of sample detection at different assumed sensitivities

2.2.4 并樣檢測(cè)的診斷靈敏度和診斷特異性 統(tǒng)計(jì)所有 16～31個(gè)臨界循環(huán)的假定靈敏度下不同并樣模式的已知陽(yáng)性和已知陰性對(duì)應(yīng)于檢測(cè)陽(yáng)性和檢測(cè)陰性的數(shù)量，其中，已知陽(yáng)性并樣檢出為陽(yáng)性則為真陽(yáng)性，已知陰性檢出為陽(yáng)性則為假陽(yáng)性，已知陰性檢出為陰性則為真陰性，已知陽(yáng)性檢出為陰性則為假陰性，計(jì)算得出各并樣模式下的診斷靈敏度和診斷特異性(表6)，結(jié)果顯示，5∶1～50∶1的診斷靈敏度均不低于80%，且5∶1和50∶1的診斷靈敏度接近，100∶1 ～150∶1的診斷靈敏度有所下降。5∶1～25∶1的診斷特異性為 99.5%～98.8%，50∶1～150∶1的診斷特異性均達(dá)100%。

2.3 并樣檢測(cè)的定量分析

2.3.1 并樣檢測(cè)值與平均值的比較 對(duì)海陽(yáng)和濰坊群體單樣品EHP載量平均值和并樣檢測(cè)的EHP載量進(jìn)行比較(表7)。結(jié)果顯示，海陽(yáng)樣品的10個(gè)5∶1并樣檢測(cè)值有4個(gè)高于單樣品平均值，6個(gè)低于單樣品平均值，其中，3個(gè)并樣的差值在平均值的50%以上；2個(gè)25∶1并樣的檢測(cè)值分別不高于和低于平均值的50%。濰坊樣品的5∶1并樣中，20個(gè)陰性并樣中1個(gè)檢出了弱陽(yáng)性，其余陰性并樣在31個(gè)循環(huán)內(nèi)仍為陰性；9個(gè)陽(yáng)性并樣的檢測(cè)值均高于平均值，其差異幅度為平均值的10%～183%。濰坊樣品25∶1并樣中，4個(gè)陰性并樣有1個(gè)在31個(gè)循環(huán)內(nèi)檢出了弱陽(yáng)性；2個(gè)陽(yáng)性并樣的檢測(cè)值均低于平均值，差異幅度在平均值的 5%～50%范圍。50∶1～150∶1的并樣中，除了陰性并樣的檢測(cè)值依然為陰性，其余陽(yáng)性并樣的檢測(cè)值均低于平均值，差異幅度在 14%～61%范圍?？傮w來(lái)說(shuō)，在31個(gè)循環(huán)的檢測(cè)靈敏度區(qū)間，海陽(yáng)和濰坊的 5∶1～150∶1并樣的定量檢測(cè)結(jié)果與單個(gè)樣品的平均值的比值在(0.27±0.28)～(2.83±0.08)范圍內(nèi)，平均為(1.26±0.78)，說(shuō)明各種并樣模式所得的定量檢測(cè)結(jié)果在數(shù)量級(jí)水平能大致反映樣品的平均EHP載量。

2.3.2 并樣的 EHP載量的定量檢測(cè)值與并樣組已知量的相關(guān)性 分析并樣的 EHP載量的定量檢測(cè)值的對(duì)數(shù)(LgD)與并樣組根據(jù)單一樣品計(jì)算得到的已知量的對(duì)數(shù)(LgK)的關(guān)系(圖1)，結(jié)果顯示，二者呈線性關(guān)系(R=0.9741)，相關(guān)性極顯著(P=2.64×10-19)，LgD= (1.055±0.028)LgK-(0.153±0.095)。

3 討論

2017 年國(guó)家蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系開(kāi)展的被動(dòng)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，蝦肝腸胞蟲(chóng)(EHP)已在中國(guó)蝦類主要養(yǎng)殖區(qū)廣泛分布，在山東、河北、江蘇、上海、浙江、福建、廣東、海南和新疆均有不同程度地檢出。EHP感染引起的肝胰腺微孢子蟲(chóng)病(HPM)是近年來(lái)養(yǎng)殖對(duì)蝦經(jīng)常發(fā)生生長(zhǎng)緩慢的主要原因，對(duì)蝦肝胰腺中EHP的載量在103copies/ng HpDNA以上時(shí)，代表了較高的風(fēng)險(xiǎn)(劉珍等,2016)，而且體長(zhǎng)相同時(shí)，EHP陽(yáng)性群體的平均體重比陰性群體低30%，個(gè)體大小和體重差異顯著增加(劉雅梅等,2017)。由于EHP感染還沒(méi)有有效的防治藥物，苗種產(chǎn)地檢疫工作中進(jìn)行該病原的定性或定量檢測(cè)，對(duì)于該病的預(yù)防具有重要意義。本研究對(duì)采集的2個(gè)群體的樣品進(jìn)行逐尾檢測(cè)，海陽(yáng)群體采樣的陽(yáng)性率為36%；而濰坊群體前2次采樣共計(jì)100尾稚蝦，經(jīng)31個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增均未檢出陽(yáng)性，表明早期采樣可能遇到陽(yáng)性率很低的情況，需要進(jìn)行大樣本量的采樣和檢測(cè)。PCR檢測(cè)的成本可達(dá)40～200元/反應(yīng)，在認(rèn)證實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展檢測(cè)的成本可能更高，養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)大樣本量的逐尾檢測(cè)從成本來(lái)說(shuō)顯然是無(wú)法承受的，因此，并樣檢測(cè)通常是產(chǎn)業(yè)唯一能接受的檢測(cè)方式。

表3 不同并樣模式的陽(yáng)性率Tab.3 The positive rates under different pooling modes

表4 不同陽(yáng)性率的并樣的已知/檢測(cè)的陰性和陽(yáng)性數(shù)比較Tab.4 Comparison of known and detected negative or positive numbers of pooled samples with different positive rate of single sample in pooled group

在大量樣本中檢出很少的陽(yáng)性對(duì)于檢測(cè)方案是個(gè)挑戰(zhàn)。在陽(yáng)性率低的情況下，并樣檢測(cè)隨著混合樣本數(shù)的增加，樣本中陽(yáng)性靶標(biāo)會(huì)被稀釋，這就需要檢測(cè)方法具有很高的靈敏性和特異性(顧衛(wèi)東,1998; Arnoldet al,2009)。中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖病害防控與分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室建立的EHP的TaqMan探針qPCR方法，比套式PCR和SYBR Green qPCR方法有更高的靈敏性和特異性(Liuet al,2018)。在此基礎(chǔ)上，本研究用海陽(yáng)和濰坊養(yǎng)殖場(chǎng)采集的凡納濱對(duì)蝦樣品分別進(jìn)行5∶1、25∶1、50∶1、100∶1和150∶1并樣檢測(cè)。由于并樣率越高，樣本越低，為了避免使用大量單個(gè)個(gè)體在高比例并樣時(shí)數(shù)據(jù)量過(guò)低使結(jié)果難以統(tǒng)計(jì)比較，本研究采用了設(shè)定不同臨界循環(huán)數(shù)的假定靈敏度的方式對(duì)qPCR定量結(jié)果進(jìn)行定性分析的方法，從而使每個(gè)樣品的1次qPCR的定量結(jié)果能產(chǎn)生16個(gè)可定性分析的數(shù)據(jù)，模擬了樣品中存在高于和低于臨界目標(biāo)核酸量時(shí)所產(chǎn)生的多種組合狀態(tài)。

表5 低陽(yáng)性率的并樣檢測(cè)分析Tab.5 Detection of pooled samples with low positive rate

表6 不同并樣模式的診斷靈敏度和診斷特異性Tab.6 Diagnostic sensitivity and diagnostic specificity of different pooling modes

表7 海陽(yáng)樣品2種檢測(cè)結(jié)果的比較Tab.7 The comparison of two kinds of test results of samples from Haiyang

續(xù)表7

圖1 并樣的EHP載量的定量檢測(cè)值與 并樣組已知量的相關(guān)性Fig.1 The correlation between of the detected amounts and the known amounts of EHP in pooling groups

對(duì)并樣陽(yáng)性率的分析表明，并樣率越高，并樣檢測(cè)所得到的陽(yáng)性率也越高。推算單樣本感染率均值(r)可以通過(guò)并樣數(shù)(n)和并樣陽(yáng)性率(rp)，經(jīng)公式r=1-(1-rp)1/n估 測(cè) ，方 差 (ν)通 過(guò) 公 式ν=[rp(1-rp)(2/n-1)]/(n2T)計(jì)算，其中，T為樣品總數(shù)(Klineet al,1989; 顧衛(wèi)東,1998)，上述關(guān)系對(duì)于較高陽(yáng)性率或較高并樣率的情況誤差很大，用本研究中海陽(yáng)和濰坊的 5∶1并樣的已知陽(yáng)性率推算的單樣本感染率與實(shí)際數(shù)據(jù)的差異系數(shù)達(dá) 25%～71%。從本研究的數(shù)據(jù)來(lái)看，并樣的陽(yáng)性率符合“較低并樣率的陽(yáng)性率≤較高并樣率的陽(yáng)性率≤較低并樣率的陽(yáng)性率×較高并樣率/較低并樣率”的關(guān)系。

對(duì) EHP的并樣檢測(cè)來(lái)說(shuō)，更重要的結(jié)果是得出采樣群體內(nèi)是否有陽(yáng)性存在。群體中流行率越高，所需的采樣率越低(Ossianderet al,1973)。本研究的定性分析揭示，樣品個(gè)體陽(yáng)性率＞20%時(shí)，5∶1～150∶1的各并樣組檢測(cè)到的陽(yáng)性率與已知情況完全一致；但在樣品中個(gè)體陽(yáng)性率＜20%時(shí)，并樣檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)差異。在濰坊樣品中，陽(yáng)性率≤10/150時(shí)，100∶1～ 150∶1并樣均無(wú)法有效檢出陽(yáng)性，但 50∶1以下的并樣有較穩(wěn)定的檢出；陽(yáng)性率≤6/150時(shí)，25∶1以上的并樣均無(wú)法檢出陽(yáng)性；陽(yáng)性率≤2/150時(shí)，所有并樣均無(wú)法檢出陽(yáng)性。在海陽(yáng)的樣品中，陽(yáng)性率≤4/25時(shí)，25∶1的并樣無(wú)法有效檢出陽(yáng)性，陽(yáng)性率≤2/25時(shí)，5∶1以上的并樣均無(wú)法檢出陽(yáng)性?？紤]到不同流行率所需的采樣率(Ossianderet al,1973)，由上述情況推測(cè)，如果1個(gè)群體只進(jìn)行1個(gè)檢測(cè)反應(yīng)，則最靈敏的情況只能檢出群體中 7%以上的陽(yáng)性率，應(yīng)采集50尾樣品合并為1個(gè)并樣檢測(cè)；而如果該群體的平均EHP載量在 102copies/ng HpDNA的水平，則可能只能檢出16%以上的陽(yáng)性，應(yīng)采集25尾對(duì)蝦合并為 1個(gè)并樣檢測(cè)。Mu?oz-Zanzi等(2000)通過(guò)成本分析表明，對(duì)牛群的并樣檢測(cè)的最低成本與并樣率和疫病流行率有關(guān)，流行率在0.5%～3.0%范圍內(nèi)，最低成本的并樣率在15∶1～6∶1范圍。

前人多數(shù)采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)計(jì)算對(duì)并樣開(kāi)展研究。在并樣檢測(cè)靈敏度和特異性方面，滕海英等(2011)研究了給定靈敏度和特異性下并樣方法對(duì)提高總陽(yáng)性率的估計(jì)精度的作用。Mu?oz-Zanzi等(2006)對(duì)影響并樣檢測(cè)的靈敏度和特異性的流行率、并樣率、感染動(dòng)物的病原濃度和檢測(cè)方法的檢測(cè)限等參數(shù)進(jìn)行了推演。本研究則結(jié)合實(shí)際檢測(cè)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)假定靈敏度下所得出的已知陽(yáng)性、已知陰性、檢測(cè)陽(yáng)性和檢測(cè)陰性的數(shù)量，根據(jù)OIE診斷方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)(OIE,2017)計(jì)算得出各并樣模式下的診斷靈敏度和診斷特異性。結(jié)果表明，無(wú)論哪種并樣模式均有很好的診斷特異性；而診斷靈敏度在5∶1～50∶1并樣率下均不低于80%，5∶1和 50∶1的診斷靈敏度十分接近，但 100∶1～ 150∶1的診斷靈敏度有明顯下降。從這一分析來(lái)看，OIE標(biāo)準(zhǔn)和美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定并樣不超過(guò)5個(gè)個(gè)體的要求(OIE,2017; FHS,2014)，在多數(shù)情況下可以考慮擴(kuò)展到50個(gè)個(gè)體。

EHP感染的風(fēng)險(xiǎn)與其載量有較強(qiáng)的關(guān)系(劉珍等,2016)，定量分析對(duì)于EHP檢測(cè)具有重要意義。本研究觀察到并樣檢測(cè)的定量結(jié)果與單一個(gè)體檢測(cè)的平均值具有極顯著相關(guān)性(P=2.64×10-19)，測(cè)定值與個(gè)體平均值的比在0.27～2.29范圍，處于同一數(shù)量級(jí)，可以為群體量的測(cè)定提供參考。

綜上所述，通過(guò)基于TaqMan qPCR的EHP檢測(cè)的并樣分析，在定性上國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中推薦的5∶1并樣檢測(cè)方式可以擴(kuò)展到50∶1的檢測(cè)方式，可為群體中存在 7%以上的感染率提供兼顧準(zhǔn)確性和低成本的檢測(cè)方案，其診斷特異性和診斷靈敏度與5∶1并樣檢測(cè)接近，可以縮短檢測(cè)時(shí)間，節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用。更低感染率的檢測(cè)應(yīng)通過(guò)增加檢測(cè)反應(yīng)數(shù)量實(shí)現(xiàn)，簡(jiǎn)單提高并樣率反而會(huì)降低有效檢測(cè)的能力；并樣檢測(cè)的定量結(jié)果能用于群體感染載量水平的粗略評(píng)估。并樣檢測(cè)評(píng)估為水生動(dòng)物疫病診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了參考依據(jù)。