茶樹(shù)體胚APX基因克隆及其在體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)與酶活性分析

郭玉瓊 黃道斌 李小楨 朱晨 張舒婷 傅海峰 周承哲 歐陽(yáng)明秋 陳蘭 賴鐘雄

摘? 要? 以鐵觀音茶樹(shù)體胚為材料，克隆了茶樹(shù)抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因CsAPX（Genbank登錄號(hào)為MG799534.1）。CsAPX基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為753 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），共編碼250個(gè)氨基酸，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。APX酶活性測(cè)定結(jié)果表明在球形胚至子葉胚階段APX酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并在子葉胚階段到達(dá)最低值，隨著體胚進(jìn)一步的分化，在子葉胚、成熟胚和萌發(fā)胚階段，茶樹(shù)APX酶活性不斷上升，總體呈“先降后升”的趨勢(shì)。在體胚發(fā)生過(guò)程中CsAPX基因的表達(dá)分析顯示，CsAPX基因在茶樹(shù)體胚發(fā)生的5個(gè)階段均存在顯著差異表達(dá)，總體呈“升—降—升”的趨勢(shì)，其中在萌發(fā)胚階段的CsAPX基因的表達(dá)水平顯著高于其他4個(gè)階段，推測(cè)CsAPX基因在體胚發(fā)生過(guò)程中的萌發(fā)胚階段發(fā)揮著重要的作用。

關(guān)鍵詞? 茶樹(shù)體胚;抗壞血酸過(guò)氧化物酶;基因克隆;表達(dá)分析;酶活性分析

中圖分類號(hào)? S571.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Abstract? The ascorbate peroxidase gene CsAPX （GenBank accession number： MG799534.1） was cloned from the somatic embryo of Camellia sinensis cultivar ‘Tieguanyin. The CsAPX gene contained an open reading frame （ORF） of 753 bp in length， which would encode a total of 250 amino acids， and bioinformatics analysis about CsAPX gene was also employed. The total APX activity was measured during the whole somatic embryogenesis and the results showed that the total APX enzyme activity presented a downward trend in the globular embryo to cotyledonary embryo stage， and reached the lowest value in the cotyledon embryo stage. With the further differentiation of the embryo cells， the total APX enzyme activity increased continuously during the cotyledonary embryo stage， the embryo maturation stage and the germinating stage， and showed an overall trend of “decreasing first and then rising”. The expression of CsAPX was significantly different between the 5 stages of the somatic embryogenesis， showing an overall trend of “up-down- up” with a significantly higher expression level in the germinating stage than in the other 4 embryo stages. It was speculated that CsAPX played an important role in the germinating stage.

Keywords? somatic embryo of tea plant; ascorbate peroxidase; gene cloning; expression analysis; enzyme activity analysis

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.013

抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是植物參與活性氧代謝的重要抗氧化酶之一，在清除活性氧和降低細(xì)胞氧化損傷等方面發(fā)揮著重要作用[1]。APX催化超氧化物陰離子還原的化學(xué)反應(yīng)為2AsA（抗壞血酸）+H2O2（過(guò)氧化氫）→2MDHA（單脫氫抗壞血酸）+H2O，其中APX以抗壞血酸（AsA）為電子供體，催化H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O，降低植物細(xì)胞中活性氧的水平，減輕其對(duì)植物體的氧化損傷[2-3]。近年來(lái)，隨著基因克隆技術(shù)的蓬勃發(fā)展，APX基因在擬南芥[4-5]、大麥[6]、甜菜[7]和橡膠樹(shù)[8]等植物中已有相關(guān)研究。Davletova等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)APX基因的表達(dá)水平較低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致擬南芥中葉綠體和過(guò)氧化物酶體的活性氧清除系統(tǒng)工作緩慢，不能及時(shí)分解光合作用和光呼吸中產(chǎn)生的H2O2，導(dǎo)致H2O2含量升高，引起植物細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。羅丹等[5]研究發(fā)現(xiàn)，草酸脅迫能夠有效誘導(dǎo)擬南芥APX基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，而APX基因過(guò)表達(dá)后的擬南芥植株較野生型相比，對(duì)草酸脅迫的抵抗力大幅提高。Shi等[6]將大麥APX基因轉(zhuǎn)入擬南芥后發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫處理后，非轉(zhuǎn)基因植株的葉片出現(xiàn)大量枯黃，而轉(zhuǎn)基因植株的葉片仍然保持正常。Dunajska-Ordak[7]和Chao[8]也分別在甜菜和橡膠樹(shù)中發(fā)現(xiàn)，APX基因的高效表達(dá)可以顯著提高甜菜和橡膠樹(shù)的抗逆性。最近，Tian等[9]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫和干旱脅迫能夠誘導(dǎo)茶樹(shù)APX基因的表達(dá)量顯著上升。因此，APX基因在植物抗逆脅迫中發(fā)揮重要作用。

植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是植物體細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下，沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精作用，通過(guò)與合子胚類似的發(fā)育途徑形成新植株個(gè)體的過(guò)程。研究表明植物細(xì)胞的分化常常伴隨著氧化脅迫，植物體胚胎發(fā)生作為植物細(xì)胞分化的重要系統(tǒng)，必然會(huì)存在抗氧化酶的表達(dá)，而正常情況下，細(xì)胞的代謝過(guò)程也會(huì)產(chǎn)生一定的氧化脅迫[10]。H2O2是植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中重要的信號(hào)傳遞物質(zhì)，H2O2的過(guò)量積累會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，而低濃度的H2O2又是維持細(xì)胞穩(wěn)定所必需的[11]。鑒于APX對(duì)H2O2的清除作用，植物體胚發(fā)生過(guò)程中必然存在一定程度的APX酶活性變化及APX基因的表達(dá)變化。目前，關(guān)于APX在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的作用已有一定研究[12-14]。邵巍[15]發(fā)現(xiàn)在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中，APX基因的表達(dá)量會(huì)隨胚性細(xì)胞的不斷分化而發(fā)生變化，且在體胚的不同發(fā)育階段存在明顯差異。王鳳華等[16]利用mRNA差異顯示技術(shù)發(fā)現(xiàn)APX基因是不同發(fā)育階段龍眼胚性培養(yǎng)物中的主要差異表達(dá)基因，推測(cè)APX可能是影響體胚發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。Stasolla等[17]研究表明在白云杉體胚發(fā)生的不同階段發(fā)現(xiàn)了APX基因的表達(dá)模式與H2O2濃度變化存在一定的相關(guān)關(guān)系。因此了解體胚發(fā)生過(guò)程中APX基因的表達(dá)模式，對(duì)人工調(diào)控H2O2濃度，控制體胚發(fā)生和發(fā)育具有重要意義。

目前，有關(guān)茶樹(shù)APX基因在體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)分析、酶活性分析和具體作用機(jī)制等相關(guān)研究還尚未見(jiàn)到報(bào)道。因此為研究茶樹(shù)APX基因在茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中的具體功能，本研究以烏龍茶的代表品種‘鐵觀音茶樹(shù)體胚為材料，進(jìn)行了茶樹(shù)胞質(zhì)型APX基因克隆，利用生物信息學(xué)技術(shù)手段對(duì)基因及其蛋白質(zhì)的理化特性進(jìn)行分析，并進(jìn)一步研究了茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中的APX酶活性變化和CsAPX基因的表達(dá)模式，以期明確APX基因在茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中的具體作用機(jī)制，為今后進(jìn)一步利用生物技術(shù)手段建立茶樹(shù)體胚發(fā)生系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實(shí)驗(yàn)材料? 烏龍茶品種‘鐵觀音未成熟胚，采自福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)實(shí)踐茶園。使用改良的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，參照課題組前期建立的茶樹(shù)體胚發(fā)生再生體系[18]，誘導(dǎo)鐵觀音茶樹(shù)球形胚、心形胚、子葉形胚、成熟胚和萌發(fā)胚五個(gè)不同發(fā)育階段的體胚，除萌發(fā)胚培養(yǎng)基中添加2 mg/L BA和0.1 mg/L IBA激素，其余培養(yǎng)基中均未添加激素。

1.1.2? 主要試劑? RNA提取試劑盒購(gòu)于上海申能博彩生物科技有限公司;TAE Buffer、ExTaq酶、pMD18-T載體、DNA Ligation Kit和Marker DL2000購(gòu)自大連寶生物有限公司（TaKaRa）;X-gal、IPTG、瓊脂糖、氨芐青霉素、胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂等購(gòu)自廈門(mén)泰京生物技術(shù)有限公司;dNTP購(gòu)自Promega公司。

1.2? 方法

1.2.1? 茶樹(shù)體胚總RNA的提取和cDNA合成? ?茶樹(shù)體胚總RNA的提取方法參考趙姍姍等[19]的方法，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并通過(guò)Nanodrop 2000檢測(cè)RNA的濃度和純度。采用Clontech公司的SMART RACE逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Primpscript RT Reagent Kit試劑盒分別合成用于CsAPX基因克隆和茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中qPCR分析的cDNA，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA置于?20 ℃冰箱中備用。

1.2.2? CsAPX基因的ORF擴(kuò)增? 根據(jù)Genbank中已登錄的植物APX基因序列，在開(kāi)放閱讀框（ORF）的起始密碼子ATG和終止密碼子TAA處設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增CsAPX基因ORF的引物。以鐵觀音茶樹(shù)體胚cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。參照朱晨等[20]的方法，進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，連接及轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序。引物合成由福州尚亞生物技術(shù)有限公司完成（表1），相關(guān)測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.2.3? 生物信息學(xué)分析? 利用在線分析工具ExPASy ProtParam、ProtScale、EMBnet TMpred、SignalP 4.1 Server和TargetP 1.1 Server對(duì)CsAPX基因編碼的蛋白質(zhì)分別進(jìn)行理化性質(zhì)、蛋白親水性、蛋白跨膜區(qū)段、信號(hào)肽及其斷裂位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行分析;CsAPX蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分別利用SOPMA和SWISS-MODEL進(jìn)行預(yù)測(cè);NetPhos 2.0、EMBnet COILS和STRING分別用于蛋白磷酸化位點(diǎn);卷曲螺旋結(jié)構(gòu)和蛋白互作關(guān)系分析;NCBI蛋白比對(duì)工具用于預(yù)測(cè)CsAPX蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;采用MEGA 6.0軟件，依照鄰位歸并法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4? 茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中的APX酶活性變化分析? 將0.5 g鐵觀音茶樹(shù)體胚，加入5 mL酶提取液（50 mmol/L磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖溶液，pH 7.8;2 mmol/L抗壞血酸溶液;5 mmol/L乙二胺四乙酸溶液），冰浴研磨，在4 ℃條件下離心20 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，吸取上清粗酶液后分裝于離心管中置于4 ℃待測(cè)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)測(cè)定，茶樹(shù)體胚APX酶活性的計(jì)算方法參考孫云等[21]的方法。

1.2.5? CsAPX基因在茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)模式分析? 設(shè)計(jì)特異性引物CsAPX-qF和CsAPX-qR進(jìn)行qPCR擴(kuò)增（表1），使用Roche LightCycler 480 qPCR儀檢測(cè)CsAPX基因在茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)模式，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)?；虮磉_(dá)量采用相對(duì)定量法2?△△Ct法進(jìn)行測(cè)定，選用18S rRNA作為qPCR內(nèi)參基因[22]，計(jì)算茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中CsAPX基因的相對(duì)表達(dá)量，并利用SPSS進(jìn)行顯著性差異分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? CsAPX基因克隆與序列分析

以鐵觀音茶樹(shù)體胚cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后得到一條約750 bp的單一條帶，與預(yù)期長(zhǎng)度一致。測(cè)序結(jié)果顯示，CsAPX基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為753 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼250個(gè)氨基酸，在NCBI上進(jìn)行blastn比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該基因序列與其他植物的APX基因序列的相似性較高。通過(guò)氨基酸序列多重比對(duì)分析

后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)APX基因所編碼蛋白的氨基酸序列與煙草（NP_001311803.1）、辣椒（NP_ 001311967.1）、番茄（NP_001318094.1）、葡萄（NP_001267988.1）、胡蘿卜（XP_017228269.1）和草莓（XP_004294686.1）共6種植物胞質(zhì)型APX蛋白的氨基酸序列具有90.44%的相似度，序列同源性高。因此確定其為茶樹(shù)胞質(zhì)型APX基因，并將其命名為CsAPX，并在GenBank上進(jìn)行登錄，登錄號(hào)為：MG799534.1。將CsAPX氨基酸序列比對(duì)到茶樹(shù)基因組中與茶樹(shù)基因組進(jìn)行序列多重比對(duì)分析[23-24]，發(fā)現(xiàn)CsAPX氨基酸序列與茶樹(shù)基因組中兩條轉(zhuǎn)錄本的氨基酸序列（CSA017238，CSA018282）相似度高達(dá)96.60%。對(duì)這2條氨基酸序列進(jìn)行Pfam注釋后，發(fā)現(xiàn)注釋結(jié)果為APX（PF00141），進(jìn)一步證明克隆所得的CsAPX基因的正確性。

2.2? CsAPX基因編碼蛋白的特征分析

運(yùn)用ExPASy ProtParam分析CsAPX基因編碼的蛋白基本理化性質(zhì)，結(jié)果表明CsAPX蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為27.634 ku，理論等電點(diǎn)（pI）為5.62，原子組成為C1240H1917N333O366S9，總原子數(shù)為3865;由20種氨基酸組成，其中含量最豐富的3種氨基酸依次為亮氨酸Leu（10.0%）、甘氨酸Gly（9.6%）和丙氨酸Ala（9.2%），而色氨酸Trp（0.8%）、谷氨酰胺Gln（1.6%）和半胱氨酸Cys（1.6%）的含量較低;CsAPX蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為37.31，脂肪指數(shù)為77.72，總平均疏水性為?0.394，且不含有跨膜螺旋，表明CsAPX蛋白可能為穩(wěn)定、親水的中性蛋白;TargetP 1.1和SignalP 4.1預(yù)測(cè)CsAPX蛋白的亞細(xì)胞定位及信號(hào)肽情況，結(jié)果表明CsAPX蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)且為非信號(hào)肽蛋白。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)，CsAPX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示CsAPX主要由40.0%的α-螺旋、12.4%的延伸鏈、6.8%的β-轉(zhuǎn)角和40.8%的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)構(gòu)成;CsAPX蛋白與大豆APX蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度為56%，三級(jí)結(jié)構(gòu)類主要由螺旋和卷曲結(jié)構(gòu)組成;利用NCBI網(wǎng)站進(jìn)一步對(duì)CsAPX蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析后發(fā)現(xiàn)，CsAPX蛋白具有典型的APX蛋白保守結(jié)構(gòu)域，隸屬于過(guò)氧化物酶超家族，含有24個(gè)血紅素結(jié)合位點(diǎn)，8個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)和6個(gè)K+離子結(jié)合位點(diǎn)。

蛋白水平上的磷酸化和去磷酸化修飾在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控中起重要的作用，利用NetPhos對(duì)CsAPX蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，結(jié)果表明CsAPX蛋白的氨基酸序列上存在16個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括3個(gè)絲氨酸（Ser）位點(diǎn)，6個(gè)蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)和7個(gè)酪氨酸（Tyr）位點(diǎn)。

利用STRING對(duì)CsAPX蛋白潛在的互作關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明CsAPX蛋白與谷胱甘肽還原酶（GR）蛋白的互作系數(shù)為0.944，抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中的MDHAR蛋白與CsAPX蛋白的互作系數(shù)為0.987，此外，CsAPX蛋白與過(guò)氧化物酶（CAT）蛋白的互作系數(shù)為0.970。

2.3? CsAPX基因編碼蛋白進(jìn)化樹(shù)分析

為進(jìn)一步了解CsAPX基因的生物學(xué)功能，采用MEGA6.0軟件構(gòu)建了植物APX蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，APX蛋白可分為胞質(zhì)型APX蛋白（Group 1）、葉綠體型APX蛋白和過(guò)氧化物酶型APX蛋白三大分支。其中，胞質(zhì)型茶樹(shù)APX蛋白（Camellia sinensis，AUZ41890.1）與野草莓（Fragaria vesca，XP_004294686.1）、煙草（Nicotiana attenuata，NP_001311967.1）的胞質(zhì)型APX基因處于同一分支（Group 1），序列相似度最高，推測(cè)可能具有類似的結(jié)構(gòu)。而胞質(zhì)型茶樹(shù)APX蛋白與葡萄（Vitis vinifera，NP_001267988.1）和番茄（Solanum lycopersicum，NP_001318094.1）進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，可能在結(jié)構(gòu)上存在一定差別;在Group 2中，葉綠體型茶樹(shù)APX蛋白（Camellia sinensis，AFI98764.1）與棗（Ziziphus jujuba，XP_ 015885724.1）的進(jìn)化距離最近;Group 3中的過(guò)氧化物酶型茶樹(shù)APX基因（Camellia sinensis，AFI98389.1）和橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis，XP_021659122.1）、獼猴桃（Actinidia chinensis，PSS25985.1）的序列相似度最高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，3種類型茶樹(shù)APX蛋白的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，而同一類型的APX蛋白聚在一起，呈現(xiàn)出簇狀分布，該聚類結(jié)果可能與同一類型APX蛋白功能相似有關(guān)。

2.4? 茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中的APX酶活性變化和CsAPX基因的表達(dá)模式分析

測(cè)定了茶樹(shù)球形胚、心形胚、子葉胚、成熟胚和萌發(fā)胚5個(gè)體胚發(fā)生階段的APX酶活性，結(jié)果表明在茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中，APX酶活性呈先下降后上升的趨勢(shì);球形胚階段APX酶活性最高，達(dá)到1482.4 U/mg;子葉胚階段APX酶活性最低，為406.25 U/mg。

對(duì)CsAPX基因在體胚發(fā)育的不同階段（球形胚、心形胚、子葉胚、成熟胚、萌發(fā)胚）的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CsAPX基因在茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程的表達(dá)模式總體呈現(xiàn)“升—降—升”的趨勢(shì)。其中，在球形胚階段的表達(dá)量最低;隨著體胚發(fā)育的成熟，在心型胚和子葉胚階段CsAPX基因的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，并在子葉胚階段達(dá)到第1個(gè)峰值，為球形胚階段相對(duì)表達(dá)量的5.56倍;隨后，成熟胚階段APX基因的表達(dá)量相比于子葉胚階段有所下降;而在萌發(fā)胚階段CsAPX基因的表達(dá)量迅速上升且顯著高于之前4個(gè)體胚階段，為球形胚階段相對(duì)表達(dá)量的的44.41倍。

3? 討論

3.1? CsAPX基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)特點(diǎn)

本研究以烏龍茶的代表品種‘鐵觀音茶樹(shù)體胚為材料，克隆得到胞質(zhì)型CsAPX基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明該基因編碼的蛋白不具有信號(hào)肽，無(wú)跨膜螺旋區(qū)，亞細(xì)胞預(yù)測(cè)結(jié)果也表明CsAPX蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中。CsAPX蛋白具有典型的APX蛋白保守結(jié)構(gòu)域，隸屬于過(guò)氧化物酶超家族，含有24個(gè)血紅素結(jié)合位點(diǎn)，8個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)和6個(gè)K+離子結(jié)合位點(diǎn)，豐富的結(jié)合位點(diǎn)可增強(qiáng)植物體中無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸和調(diào)節(jié)代謝生長(zhǎng)的能力。蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明APX蛋白有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)其在蛋白翻譯過(guò)程中發(fā)生多次磷酸化修飾，可能與CsAPX基因參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育并在多種脅迫的抗逆反應(yīng)中起著重要作用。

3.2? CsAPX基因可能間接參與體胚發(fā)生調(diào)控

植物體胚發(fā)生是一個(gè)細(xì)胞分化的過(guò)程，該過(guò)程中可能有氧化脅迫的影響。而活性氧中一種相對(duì)穩(wěn)定的小分子物質(zhì)H2O2，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞壁加厚和細(xì)胞信號(hào)傳遞分子Ca2+離子的濃度，從而影響調(diào)控胚胎發(fā)生的相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)胚性細(xì)胞分化[11]。程文瀚等[25]在棉花胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加1 mmol/L的H2O2能夠顯著提高胚狀體的產(chǎn)生效率，進(jìn)一步證明H2O2可能參與體胚發(fā)生的調(diào)控。在本研究中，CsAPX基因在茶樹(shù)體胚發(fā)生的5個(gè)階段（球形胚、心形胚、子葉胚、成熟胚、萌發(fā)胚）均存在顯著差異表達(dá)，總體呈“升—降—升”的趨勢(shì)。其中，CsAPX基因在球形胚階段的表達(dá)量最低。隨著茶樹(shù)體胚的不斷發(fā)育，CsAPX基因在心形胚和子葉胚階段的轉(zhuǎn)錄水平不斷提高，并在子葉胚時(shí)期達(dá)到第一個(gè)峰值，與Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)在落葉松體胚發(fā)生前期LIAPX、LISOD和LICAT基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)的研究結(jié)果一致。隨著茶樹(shù)體胚進(jìn)一步發(fā)育，在成熟胚階段CsAPX基因的轉(zhuǎn)錄水平有所下降，而在萌發(fā)胚階段CsAPX基因的表達(dá)量迅速上升且顯著高于之前4個(gè)體胚階段。Luo等[27]研究表明高含量的H2O2會(huì)阻礙豆科植物沙打旺體胚的進(jìn)一步發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)在茶樹(shù)體胚發(fā)育的萌發(fā)胚階段CsAPX基因顯著上調(diào)，可能促進(jìn)清除過(guò)量的H2O2，從而有利于茶樹(shù)體胚的發(fā)育，也表明高表達(dá)的CsAPX基因可能是誘導(dǎo)萌發(fā)胚繼續(xù)進(jìn)行體胚發(fā)生的重要因素之一。

3.3? 茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中APX基因的表達(dá)模式與其酶活性變化趨勢(shì)的不一致性

在體胚發(fā)生初期，一定濃度的H2O2有利于體胚發(fā)生的順利進(jìn)行，而APX酶對(duì)H2O2有很強(qiáng)的專一性，是植物體調(diào)節(jié)體內(nèi)H2O2水平的關(guān)鍵因素[28]。分析茶樹(shù)體胚發(fā)生5個(gè)階段的APX酶活性，表明APX酶活性總體上呈現(xiàn)先下降后回升的變化趨勢(shì)。其中，在球形胚至子葉胚階段呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并在子葉胚階段到達(dá)最低值;隨著體胚進(jìn)一步的分化，在子葉胚、成熟胚和萌發(fā)胚階段，APX酶活性不斷增強(qiáng)，但仍然低于球形胚和心型胚階段的APX酶活性。同時(shí)有研究表明CsAPX基因?qū)儆诳箟难嵫趸富蚣易錥9]，進(jìn)一步對(duì)APX基因進(jìn)行分類發(fā)現(xiàn)，其可分為3種類型：胞質(zhì)型APX基因、線粒體型APX基因以及葉綠體型APX基因[29]。本研究測(cè)定的APX酶活性是總CsAPX酶的活性，APX同工酶成員眾多，且是由不同的APX基因家族成員編碼蛋白組成，因而其活性可能受不同類型的APX基因表達(dá)量的共同影響。茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中的APX酶活性變化趨勢(shì)與CsAPX基因的表達(dá)模式有所差異，與王鳳華[30]、邵巍[15]研究龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的APX基因表達(dá)模式與其酶活性變化趨勢(shì)不一致的結(jié)果相似。Mittler等[31]發(fā)現(xiàn)APX基因在脅迫條件下出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定上升，但APX蛋白質(zhì)合成受阻的現(xiàn)象;Yoshimura等[32]發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)光處理下，植物APX酶活性受到葉綠體型APX基因和胞質(zhì)型APX基因共同影響，造成APX酶活性變化幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其基因轉(zhuǎn)錄水平的變化幅度，因此APX酶活性的變化可能受到轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平、酶原激活和mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體（mRNP）積累水平[33]等多重調(diào)控因素的影響。此外，本研究的供試茶樹(shù)材料品種為鐵觀音體胚，雜合度較高，克隆所得的CsAPX基因的等位基因及對(duì)應(yīng)蛋白的序列和活性可能存在差異，從而也可能導(dǎo)致APX基因的表達(dá)模式與其酶活性變化趨勢(shì)的不一致性。為進(jìn)一步明確CsAPX基因各成員表達(dá)水平與APX酶活性之間的關(guān)系，今后將對(duì)CsAPX基因家族在茶樹(shù)全基因組水平上進(jìn)行鑒定與分析。

本研究在CsAPX互作蛋白預(yù)測(cè)中還發(fā)現(xiàn)，APX蛋白與植物抗氧化酶系統(tǒng)中的CAT蛋白和抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中的MDHAR蛋白以及GR蛋白可能通過(guò)協(xié)同調(diào)控作用共同調(diào)節(jié)不同體胚階段植物體內(nèi)的H2O2濃度，以促進(jìn)不同體胚發(fā)生和后續(xù)茶樹(shù)形態(tài)發(fā)生，這對(duì)今后進(jìn)一步研究茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中CsAPX蛋白的互作調(diào)控機(jī)制提供了新的思路。因此，后續(xù)可利用酵母雜交系統(tǒng)和免疫共沉淀等新型技術(shù)手段進(jìn)一步探究CsAPX蛋白在茶樹(shù)體胚發(fā)生過(guò)程中的互作機(jī)制。

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