響應(yīng)面法優(yōu)化針葉櫻桃黃酒的發(fā)酵工藝

鞠雪莉 譚海生 楊勁松 郭海陽 史一珂 仵云學(xué)

摘? 要? 以針葉櫻桃和粳米為原料，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對針葉櫻桃黃酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在酒曲添加量0.8%、糖化溫度31 ℃、糖化時間68 h、釀酒酵母添加量0.8%、液料比為1.1∶1、針葉櫻桃果漿添加量33%、發(fā)酵溫度26 ℃、發(fā)酵時間4 d時為最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。該最佳釀造工藝條件下，研制得針葉櫻桃黃酒的色澤橙黃，清亮透明，特征香氣濃郁，口感醇厚柔和，酒精度13.8% vol，感官評分96.4。果糧混釀酒一直是熱帶水果釀酒的發(fā)展方向。釀制針葉櫻桃黃酒，開發(fā)黃酒新品種，對豐富市場具有重要的現(xiàn)實意義。

關(guān)鍵詞? 針葉櫻桃;黃酒;發(fā)酵工藝;響應(yīng)面法

中圖分類號? S31? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

Abstract? The Box-Behnken response surface method was used to optimize the fermentation process of yellow wine from acerola cherry and rice on the basis of single factor experiments. The best fermentation conditions were as follows： koji addition 0.8%， saccharification temperature 31 ℃， saccharification time 68 h， Saccharomyces cerevisiae 0.8%， liquid to material ratio 1.1： 1（mL： g）， acerola cherry 33%， fermentation temperature 26 ℃， and fermentation time 4 d. Under the best fermentation conditions， the yellow wine produced had orange color， clear and transparent characteristics， harmonious and fragrant aroma， soft and mellow taste， alcohol content 13.8% vol， and the sensory evaluation score was 96.4. Fruit and grain blending is the development direction of the wine making for tropical fruits. The production of yellow wine from acerola cherry and rice would be of importance both in the development of new varieties of fruit wine and marketing.

Keywords? acerola cherry （Malpighia glabra）; yellow rice wine; fermentation process; response surface method

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.022

針葉櫻桃（acerola cherry， Malpighia glabra）原產(chǎn)于熱帶美洲西印度群島加勒比海地區(qū)，又名“西印度櫻桃”，被譽為“天然維C果王”[1]。20世紀(jì)50年代后，在我國引種栽培成功[2]。針葉櫻桃營養(yǎng)豐富，含有多種維生素及礦物質(zhì)，其中鮮果中維生素C的含量高達(dá)至1215～3024 mg/100 g，是含量最高的天然維生素C源之一[3-4]。維生素C是維持人體生命活動不可缺少的成分，水溶性維生素C參與了人體多種代謝過程，對于維持細(xì)胞完整、預(yù)防感染、增強抵抗力等方面有著重要的臨床意義[5]。維生素C還能有效的保護(hù)維生素A、E、不飽和脂肪酸等抗氧化劑，防止自由基對人體的傷害，從而達(dá)到延緩衰老的效果[6-7]。黃酒是以稻米、小米、玉米、小麥等為主要原料，經(jīng)蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵等工序制成的釀造酒[8]。黃酒是我國特產(chǎn)，享有“國酒”之美譽，也是世界上最古老的酒類之一[9]。由于它的酒度適中，酒香濃郁，口味獨特，營養(yǎng)豐富，具有食療價值，且易被人體吸收利用，故被稱為“液體蛋糕”[10-11]。近年來人們的保健意識不斷增強，對具有保健功效的低度酒類的需求不斷提高，黃酒因具有營養(yǎng)、綠色、保健等特點而備受青睞，因而風(fēng)味黃酒的開發(fā)展現(xiàn)出較大的市場潛力[12-14]。

針葉櫻桃不耐貯藏、易腐爛，而目前針葉櫻桃深加工產(chǎn)品開發(fā)較少，主要產(chǎn)品是糖果。所以，針葉櫻桃黃酒的研制，對豐富黃酒品種與利用針葉櫻桃有較為重要的意義。針葉櫻桃黃酒是在傳統(tǒng)黃酒的基礎(chǔ)上，添加含維生素C極高的針葉櫻桃而制成的果糧混釀型黃酒，與傳統(tǒng)黃酒相比，針葉櫻桃黃酒不僅風(fēng)味獨特，酒體的針葉櫻桃果香和米酒香協(xié)調(diào)濃郁，滿足了現(xiàn)代人群的口味要求，而且酒體中天然維生素C含量豐富，維生素C與黃酒的有效結(jié)合，使酒體營養(yǎng)成分豐富，符合現(xiàn)代人群的養(yǎng)生消費理念。針葉櫻桃黃酒風(fēng)味和營養(yǎng)上的獨特性，使其具有巨大的推廣潛力。本研究以針葉櫻桃和粳米為主要原料，研究針葉櫻桃黃酒釀造工藝技術(shù)，制成風(fēng)味獨特的果糧混釀型黃酒，對提升黃酒的價值，推動風(fēng)味黃酒的發(fā)展有重要意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 針葉櫻桃（acerola cherry）：采摘自海南省定安縣，果中可溶性固形物含量為9.7%，pH為3.9;粳米：市售;甜酒曲：安琪酵母股份有限公司;釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：海南大學(xué)實驗室菌株FP-8。

試劑：酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅、葡萄糖、次甲基藍(lán)、鹽酸、甲基紅、氫氧化鈉、2，6-二氯靛酚鈉等均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2? 儀器與設(shè)備? SW-CJ-17-D型超凈工作臺，蘇州佳寶凈化工作設(shè)備有限公司;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JYL-Y11型高速破壁打漿機，九陽股份有限公司;GJJ-0.1/25型高壓均質(zhì)機，上海臺馳輕工裝備有限公司;YM50FGN型全自動高壓滅菌鍋，上海滬譽貿(mào)易有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 酵母種子液制作? 酵母菌種活化：無菌條件下挑取保存原菌接種于PDA斜面的試管中，28 ℃培養(yǎng)48 h。

酵母一級種子液：無菌條件下挑取活化酵母接入到盛有10 mL YPD液體培養(yǎng)基的大試管中，振蕩均勻后28 ℃培養(yǎng)24 h;酵母二級種子液：將取10 mL酵母一級種子接入到盛有100 mL YPD液體培養(yǎng)基三角瓶中，振蕩均勻后28 ℃培養(yǎng)24 h;酵母三級種子液：將取100 mL酵母二級種子接入到盛有1000 mL培養(yǎng)基（YPD∶針葉櫻桃汁=1∶1）的三角瓶中，振蕩均勻后28 ℃培養(yǎng)24 h，備用。1.2.2? 針葉櫻桃黃酒的加工工藝流程及操作要點? 工藝流程：

操作要點：挑選無腐爛、無破損、無病蟲害的針葉櫻桃果，用流動水洗滌，采用打漿機低溫原果打漿，制得針葉櫻桃果漿備用（針葉櫻桃果漿中，可溶性固形物含量為9.7%，pH 3.9）。稱取適量粳米，淘洗后于室溫下浸泡24 h。將浸泡好的粳米進(jìn)行蒸煮，蒸煮后用涼開水沖淋至室溫，加0.8%的甜酒曲（按粳米干質(zhì)量計算），在31 ℃條件下糖化68 h。在針葉櫻桃黃酒糖化工藝條件的基礎(chǔ)上，研究后續(xù)釀酒酵母發(fā)酵工藝對針葉櫻桃黃酒品質(zhì)的影響。糖化結(jié)束后，加水沖缸（液料比=水的體積/粳米干質(zhì)量），接種酵母菌，加入針葉櫻桃果漿（比例按粳米干質(zhì)量計算）進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)澄清、過濾、封缸陳釀使其風(fēng)味趨以完善，最后，根據(jù)針葉櫻桃果的特性，采用超高溫110 ℃殺菌15 s，再迅速降溫，得產(chǎn)品[4， 12]。

1.2.3? 發(fā)酵單因素實驗? 釀酒酵母發(fā)酵的基礎(chǔ)工藝條件：首先進(jìn)行黃酒的糖化工藝，加曲量為0.8%（按粳米干質(zhì)量計算），在31 ℃條件下糖化68 h。糖化結(jié)束后，添加酵母菌，進(jìn)行釀酒酵母發(fā)酵。工藝條件為酵母菌添加量為0.8%，發(fā)酵溫度28 ℃，針葉櫻桃果漿添加量30%（按粳米干質(zhì)量計算），液料比1∶1（純凈水/粳米干質(zhì)量），發(fā)酵時間5 d。

單因素實驗條件：根據(jù)釀酒酵母發(fā)酵的基礎(chǔ)工藝條件，采用單一變量進(jìn)行試驗。以感官評分、酒精度為評價指標(biāo)，依次研究酵母菌添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、發(fā)酵時間（1、2、3、4、5 d）、針葉櫻桃添加量（0、15%、30%、45%、60%）、液料比（純凈水/粳米干質(zhì)量：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）、發(fā)酵溫度（20、24、28、32、36 ℃）對針葉櫻桃黃酒品質(zhì)的影響。按1.2.4中的方法進(jìn)行評價。

1.2.4? 發(fā)酵響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計? 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗，確定針葉櫻桃黃酒的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。響應(yīng)面實驗因素和水平見表1。

1.2.5? 測定方法? 針葉櫻桃黃酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)：選擇10名食品專業(yè)人員，參照GB/T 13662-2008《黃酒》的方法，從外觀、香氣、口味、風(fēng)格四個方面制定感官評分標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行感官評分，滿分為100分。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

酒精度、總糖、總酸（以乳酸含量計）、氨基酸態(tài)氮、pH：均參照GB/T 13662-2008《黃酒》中規(guī)定的檢測方法進(jìn)行測定;維生素C：參照GB 5009.86-2016《食品中抗壞血酸的測定》中規(guī)定的檢測方法進(jìn)行測定;菌落總數(shù)：參照GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》中規(guī)定的檢測方法進(jìn)行測定;大腸桿菌：參照GB 4789.3-2016《食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》中規(guī)定的檢測方法進(jìn)行測定。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 針葉櫻桃黃酒發(fā)酵工藝單因素實驗

2.1.1? 釀酒酵母添加量對針葉櫻桃黃酒品質(zhì)的影響? 由圖1可知，釀酒酵母添加量為0.8%時，得到的針葉櫻桃黃酒果香和酒香醇厚濃郁，酒體組分協(xié)調(diào)豐滿，風(fēng)味最佳，感官評分達(dá)到最大值92分，此刻酒精度為13.2% vol。釀酒酵母添加量少時，針葉櫻桃黃酒的發(fā)酵緩慢，容易導(dǎo)致雜菌生長，發(fā)酵產(chǎn)生的酒精度較低，導(dǎo)致針葉櫻桃黃酒的果香和酒香香氣淡薄，風(fēng)味不夠協(xié)調(diào)[15];釀酒酵母添加量過高時，酵母菌為了生存競爭營養(yǎng)物質(zhì)，酵母菌的發(fā)酵受到抑制，酒精度不高，雜菌繁殖，酸味與苦澀味變得突出，針葉櫻桃黃酒果香和酒香香味淡薄，感官評分降低[15]。故最佳酵母菌接種量為0.8%。由于在整個發(fā)酵工藝優(yōu)化過程中酵母添加量對黃酒感官評分的影響較其他因素而言并不明顯，故而酵母添加量在響應(yīng)面實驗中不作為考察對象。

2.1.2? 發(fā)酵溫度對針葉櫻桃黃酒品質(zhì)的影響? 針葉櫻桃對溫度敏感，雖然低溫有利于針葉櫻桃黃酒的釀造并提升針葉櫻桃黃酒品質(zhì)，但發(fā)酵溫度低，酵母菌發(fā)酵時間會延長;隨著發(fā)酵溫度的增加，針葉櫻桃黃酒的果香和酒香變得越來越協(xié)調(diào)濃郁，口感越來越豐滿協(xié)調(diào);當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到24 ℃時，感官評分最高;當(dāng)發(fā)酵溫度超過24 ℃后，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵速度逐漸加快，生成較多的副產(chǎn)物，針葉櫻桃黃酒的果香和酒香香味不足，酒香和果香不協(xié)調(diào)，酒體中的異雜味越來越突出，使針葉櫻桃黃酒的整體風(fēng)味變差[16]，故發(fā)酵溫度24 ℃較為適宜（圖2）。

2.1.3? 液料比對針葉櫻桃黃酒品質(zhì)的影響? 圖3所示，當(dāng)液料比為1.0時，感官評分分別達(dá)到最大值為95分，酒精度為13.8% vol。水添加量過少時，針葉櫻桃黃酒發(fā)酵液過于黏稠，不利于糖化液的發(fā)酵，而當(dāng)水添加量過大時，發(fā)酵液被稀釋，營養(yǎng)成分含量不足[13]。這兩者都導(dǎo)致發(fā)酵完成后酒精度過低，也因此影響針葉櫻桃黃酒品質(zhì)，致使針葉櫻桃黃酒的果香和酒香香氣成分不協(xié)調(diào)，感官評分降低;當(dāng)液料比為1.0時，果香和酒香醇厚濃郁，風(fēng)味協(xié)調(diào)，故液料比為1.0時比較適宜。

2.1.4? 針葉櫻桃果漿添加量對針葉櫻桃黃酒品質(zhì)的影響? 由圖4可知，隨著針葉櫻桃果漿添加量的增加，針葉櫻桃的風(fēng)味越來越突出，果香和酒香變得越來越協(xié)調(diào)濃郁，酒體組分變得豐滿協(xié)調(diào)，感官評分逐漸增加;在針葉櫻桃添加量15%時，酒精度達(dá)到最大值13.7% vol，但是由于針葉櫻桃添加量較少，果香和酒香不夠協(xié)調(diào)濃郁，酒體組分不夠豐滿協(xié)調(diào);在針葉櫻桃添加量30%時，針葉櫻桃黃酒的感官評分達(dá)到最大值93分，酒精度為13.3% vol。而后隨著針葉櫻桃果漿添加量的增加，針葉櫻桃黃酒的果香越來越凸顯，但同時在針葉櫻桃果漿的稀釋作用下，酒香則顯得不足，整體風(fēng)味不夠協(xié)調(diào)濃郁，感官評分降低。因此，選擇最佳針葉櫻桃果漿添加量為30%。

2.1.5? 發(fā)酵時間對針葉櫻桃黃酒品質(zhì)的影響? 隨著發(fā)酵時間的延長，針葉櫻桃黃酒的酒香越來越濃郁，果香和酒香越來越和諧，感官評分越來越高，當(dāng)發(fā)酵時間達(dá)到4 d后，由于酒體中大部分的糖已被酵母菌轉(zhuǎn)化為酒精[12]，果香和酒香醇厚濃郁，酒體組分豐滿協(xié)調(diào)，針葉櫻桃黃酒的感官評分趨于平穩(wěn);而發(fā)酵時間繼續(xù)延長，苦味和澀味物質(zhì)會逐漸凸顯，不利于針葉櫻桃黃酒風(fēng)味的形成。故最佳發(fā)酵時間為4 d。實驗結(jié)果見圖5。

2.2? 響應(yīng)面優(yōu)化針葉櫻桃黃酒發(fā)酵工藝試驗結(jié)果及分析

2.2.1? 數(shù)字模型的建立及分析? 結(jié)合單因素實驗結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化針葉櫻桃黃酒的發(fā)酵工藝條件。選取液料比（A）、針葉櫻桃果漿添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）為影響因子，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面實驗。Box-Behnken實驗結(jié)果見表3。通過Design Expert 8.0.6.1軟件對表3進(jìn)行回歸分析，方差分析結(jié)果見表4。

對表3中的試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合后，獲得各因素水平對針葉櫻桃黃酒感官評分（Y）影響的二次多項回歸模型：

Y=95.20+0.88A+2.00B+3.38C1.00AB+2.25AC+0.50BC5.23A24.98B24.22C2

由表4可知，上述建立的回歸模型極顯著（P<0.0001），失擬項不顯著（P=0.1097>0.05）。表明針葉櫻桃黃酒發(fā)酵工藝數(shù)據(jù)模型的選取具有合理性;模型決定系數(shù)R2為0.9776，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9489，表明該模型與試驗結(jié)果的擬合度較好，可以用此模型對葉櫻桃黃酒的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行可靠分析和預(yù)測。根據(jù)表4中F值判斷，各因素對針葉櫻桃黃酒發(fā)酵工藝感官評分的影響大小順序為：發(fā)酵溫度>針葉櫻桃果漿添加量>液料比，其中一次項B、C達(dá)到極顯著水平（P<0.01），AC的交互作用為極顯著（P<0.01），二次項A2、B2、C2對針葉櫻桃黃酒感官評分的影響極顯著（P<0.01）。綜合數(shù)據(jù)結(jié)果表明，該模型能較好地反映發(fā)酵溫度、針葉櫻桃添加量、液料比之間的關(guān)系，因此所得的回歸方程能較好地預(yù)測針葉櫻桃黃酒發(fā)酵工藝中感官評分在不同條件下的變化規(guī)律。

2.2.2? 影響因子間交互作用分析? 通過應(yīng)用Design-Expert. V 8.0.6軟件獲得針葉櫻桃黃酒發(fā)酵工藝的響應(yīng)面圖和等高線圖，能夠直觀地反映出各因素及其相互作用對實驗結(jié)果的影響。響應(yīng)面圖的曲面程度越大，表明兩因素間的交互作用越顯著[17]。由圖6可直觀地反映出針葉櫻桃添加量、發(fā)酵溫度和液料比之間的交互作用對總糖和總酸的影響程度。液料比和發(fā)酵溫度的交互作用對針葉櫻桃黃酒感官評分的影響顯著（P<0.05），其余因素間交互作用影響不顯著（P>0.05），這與方差分析結(jié)果一致。

2.3? 針葉櫻桃黃酒發(fā)酵工藝驗證實驗

通過軟件對所建立的發(fā)酵工藝模型進(jìn)行分析，獲得釀造針葉櫻桃黃酒最佳發(fā)酵工藝條件為液料比1.08∶1，針葉櫻桃添加量33.11%，發(fā)酵溫度25.82 ℃。為了實際操作的可行性，將最佳發(fā)酵工藝參數(shù)修正為液料比1.1∶1，針葉櫻桃添加量33%，發(fā)酵溫度26 ℃。在此發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行3組平行驗證實驗。得到的結(jié)果為感官評價得分96.4與預(yù)測值96.2458分相近，說明本實驗的回歸模型方程具有實際指導(dǎo)意義。

2.4? 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化后的最佳條件進(jìn)行發(fā)酵，檢測發(fā)酵后針葉櫻桃黃酒的各項指標(biāo)為：酒精度（溫度為20 ℃時）為13.8% vol;總糖為44.1 g/L;酸度為7.3 g/L;pH為3.8;氨基酸態(tài)氮為0.39 g/L;維生素C含量為132.0 mg/100g;菌落總數(shù)<1 CFU/mL。產(chǎn)品各項指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

3? 討論

目前，關(guān)于傳統(tǒng)黃酒的工藝研究報道較多，但對針葉櫻桃果糧混釀型黃酒的工藝研究尚未見報道。對于黃酒的傳統(tǒng)工藝研究，黃瑤等[18]對不同工藝釀制的黃酒進(jìn)行了比較，研究表明，使用純菌種先糖化后發(fā)酵工藝釀造的黃酒品質(zhì)最佳。本研究采用純菌種先糖化后發(fā)酵的釀造工藝釀造針葉櫻桃黃酒。

與傳統(tǒng)黃酒釀造工藝[19]相比，本研究在傳統(tǒng)黃酒釀造工藝的基礎(chǔ)上，將針葉櫻桃和黃酒結(jié)合，也是天然維生素C與黃酒的結(jié)合，使釀造的針葉櫻桃黃酒具有獨特的風(fēng)味和營養(yǎng);傳統(tǒng)黃酒釀造工藝的釀造溫度一般在30 ℃左右，崔闖等[12]研究黃酒的發(fā)酵溫度為32 ℃，本研究采用先在31 ℃糖化，然后在26 ℃進(jìn)行后發(fā)酵的發(fā)酵模式，且在添加釀酒酵母時加入輔料針葉櫻桃果漿。針葉櫻桃果香和維生素C受溫度影響較大[4]，?添加針葉櫻桃果漿后低溫發(fā)酵，可減緩維生素C的氧化，有利于發(fā)酵后針葉櫻桃新鮮果香風(fēng)味的形成。

本研究在單因素的基礎(chǔ)上，選取對針葉櫻桃黃酒品質(zhì)影響最大的因素，對發(fā)酵工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。最終確定針葉櫻桃黃酒發(fā)酵工藝的最優(yōu)參數(shù)為：加曲量0.8%，酵母添加量0.8%，液料比1.1∶1，針葉櫻桃添加量33%，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時間4 d，制得的針葉櫻桃黃酒呈橙黃色，清澈透明，有光澤，酒體協(xié)調(diào)，醇厚綿長，甘甜爽口，具有針葉櫻桃黃酒的典型風(fēng)格，得出的最優(yōu)針葉櫻桃黃酒釀造工藝具有較好的實際應(yīng)用價值，對帶動針葉櫻桃的規(guī)模化生產(chǎn)和豐富黃酒的品種有重要的實際意義。

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