斑馬魚作為肺癌模型的應(yīng)用進(jìn)展

俞華林 李鵬飛 汪麗

[摘要]肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均居全球首位。因此，進(jìn)一步了解肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制及致病機(jī)制，評(píng)價(jià)抗肺癌藥物的療效和安全性，對(duì)肺癌的診斷及治療都有重要意義，也為早日實(shí)現(xiàn)保障民生健康的改革發(fā)展理念添磚加瓦。斑馬魚是一種重要的模式生物，其基因與人類基因高度保守，生長(zhǎng)速度快，最重要的是斑馬魚早期胚胎透明，有助于對(duì)發(fā)育過程進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)。在現(xiàn)代生物研究中，斑馬魚作為人類疾病模型得到充分的應(yīng)用。本文主要闡述了斑馬魚在肺癌研究領(lǐng)域中的應(yīng)用及研究進(jìn)展，認(rèn)為用斑馬魚構(gòu)建肺癌模型技術(shù)已相當(dāng)成熟。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，其在肺癌相關(guān)研究領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展將取得更大的進(jìn)步。

[關(guān)鍵詞]綜述；肺癌；斑馬魚；模式生物；分子機(jī)制；抗癌藥物；進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）5（b）-0025-04

[Abstract] Lung cancer is one of the most common human malignancy. Its morbidity and mortality are the highest in the world. Therefore， it is of great significance for the diagnosis and treatment of lung cancer to further understand the related molecular mechanisms and pathogenesis of lung cancer and evaluate the efficacy and safety of anti-lung cancer drugs. And also for the early realization of the countrys security health reform and development of the concept of the people′s livelihood. Zebrafish is a kind of important model organisms. Their genes with human genes are highly conserved， growth speed quick. The most important thing is that early embryonic Zebrafish transparent， which will help the development process for real-time observation. In modern biological research， Zebrafish as a model of human disease are fully applied. This article mainly elaborated the zebrafish in lung cancer research in the field of application and research progress. It′s thought that use Zebrafish lung cancer model construction technology already quite mature. With the continuous development of experimental technology， its application and development in the field of lung cancer related research will make greater progress.

[Key words] Review； Lung cancer； Zebrafish； Model organisms； Molecular mechanisms； Anticancer drugs； Progress

肺癌是目前全世界最常見的致死性腫瘤之一，死亡數(shù)約占所有癌癥死亡數(shù)的30%，中國每年有140萬人死于肺癌，每年新發(fā)肺癌患者大約有160萬人次[1]。根據(jù)組織病理分類，肺癌又可以分為小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其中SCLC約占20%，NSCLC約占80%[2]。故加強(qiáng)對(duì)肺癌的研究仍然是當(dāng)前保障民生的重要任務(wù)。目前對(duì)肺癌的治療，一般包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、免疫治療、以及分子靶向治療等，其中肺癌的個(gè)體化治療是當(dāng)下的一個(gè)熱門話題[3]，然而利用斑馬魚腫瘤模型可用于發(fā)現(xiàn)新的免疫檢查點(diǎn)，開發(fā)腫瘤新靶點(diǎn)、多靶點(diǎn)抗腫瘤藥，以達(dá)到對(duì)腫瘤患者個(gè)體化給藥；利用斑馬魚模型進(jìn)一步研究腫瘤耐藥分子機(jī)制，為臨床合理調(diào)整腫瘤患者用藥提供理論依據(jù)。

1肺癌的分子機(jī)制

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者們已經(jīng)開展了關(guān)于肺癌分子機(jī)制的各項(xiàng)研究，進(jìn)一步揭開了肺癌發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制，從而為其治療水平提上了一個(gè)新臺(tái)階。

免疫治療成為當(dāng)下肺癌治療的一個(gè)熱門話題，Mu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，PD1及其配體PD-L1在NSCLC中極其普遍，PD1在NSCLC的腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的PD-L1結(jié)合，傳遞負(fù)性調(diào)控信號(hào)，從而導(dǎo)致腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和免疫無應(yīng)答，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)控和殺傷，PD1、PD-L1抑制劑的研究及應(yīng)用為肺癌患者帶來福音。

PAQR又被稱為黃體酮和脂聯(lián)素（adipoq）受體家族，是一個(gè)高度保守的蛋白質(zhì)家族，共有11個(gè)成員，即從PAQR1到PAQR11，其已被證實(shí)在多種腫瘤中作為腫瘤抑制因子，近來 Li等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中，PAQR3在mRNA和蛋白水平均表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PAQR3過表達(dá)可顯著抑制NSCLC細(xì)胞G0/G1期增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯（P<0.05），研究還發(fā)現(xiàn)PAQR主要是通過PI3K/AKT通路抑制肺癌的發(fā)生。p53丟失以及Bcl/BclxL的過表達(dá)是腫瘤抗凋亡的主要分子機(jī)制，有研究指出，整合素a3和Bcl-2蛋白參與肺癌患者的預(yù)后。

Phiboonchaiyanan等[6]研究發(fā)現(xiàn)Phoyunnanin E通過活化caspase-3、-9和poly（adp-核糖）聚合酶切割，對(duì)H469肺癌細(xì)胞系有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，其主要是通過p53依賴性途徑來增加細(xì)胞p53蛋白的積累從而介導(dǎo)凋亡。并發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白，如誘導(dǎo)的骨髓白血病細(xì)胞分化蛋白（MCL1）和B細(xì)胞淋巴瘤2（BCL2）顯著減少，而促凋亡的Bcl-2相關(guān)的X蛋白（BAX）被上調(diào)。

Yan等[7]研究發(fā)現(xiàn)高良姜素通過誘導(dǎo)Topoi構(gòu)象重新的折疊，使α螺旋含量增加，而不利于其形成活性中心，進(jìn)而導(dǎo)致Topoi活性的降低，從而對(duì)其有較好的抑制作用；研究發(fā)現(xiàn)高良姜素能夠優(yōu)先結(jié)合到Topoi的活性中心附近，并與催化基MAr9364和lAsn352形成氫鍵，而使腫瘤細(xì)胞DNA單鏈解旋的速率降低，最終誘導(dǎo)肺癌腫瘤細(xì)胞株A549和H46的凋亡，進(jìn)而達(dá)到抑癌作用。Yang等[8]的最近一項(xiàng)Meta分析的結(jié)果顯示，E-鈣粘素的表達(dá)下調(diào)和NSCLC發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其可作為NSCLC患者的預(yù)后因子[8]。研究還發(fā)現(xiàn)E-鈣粘素不僅能直接調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附作用，還能通過受體酪氨酸激酶產(chǎn)生調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)因子受體活性和影響GTP酶活性的8-連環(huán)蛋白在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)間接發(fā)揮功能。

2斑馬魚成為生物模型的優(yōu)勢(shì)

利用斑馬魚做科學(xué)研究已有80多年的歷史。早在19世紀(jì)，斑馬魚發(fā)現(xiàn)于印度恒河流域，為淡水魚，屬脊椎動(dòng)物亞門輻鰭魚綱鯉科[9]。早期，斑馬魚主要被用于胚胎發(fā)育和藥物處理研究。19世紀(jì)80年代，斑馬魚開始被應(yīng)用于分子遺傳學(xué)研究，至此，斑馬魚作為生物模型的黃金時(shí)代拉開帷幕。

斑馬魚（Zebrafish）是近年來新興發(fā)展起來的用于研究脊椎動(dòng)物腫瘤發(fā)病學(xué)和發(fā)育遺傳學(xué)的一種模式生物[10-11]。其作為一種新型的模式動(dòng)物，以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已成為現(xiàn)代遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等研究領(lǐng)域的重要模式生物[12]。斑馬魚作為生物模型具有如下優(yōu)勢(shì)：①斑馬魚體型小，且為體外受精，受精卵發(fā)育迅速，受精后24 h即開始了器官發(fā)生，受精后5 d左右，其主要器官已發(fā)育完全，并執(zhí)行相應(yīng)功能；成年后，繁殖力強(qiáng)，產(chǎn)胚量多，且適合于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，這些都為斑馬魚成功加入到科學(xué)研究隊(duì)伍里提供了條件。②斑馬魚在幼魚階段適應(yīng)性免疫功能不全，易于腫瘤異種移植[13]；斑馬魚腫瘤異種移植模型本身有極大的優(yōu)勢(shì)，并且克服了小鼠的許多不足之處[14-15]。最重要的是其與人類的基因序列保持高度的相似性，約達(dá)87%，這些均為斑馬魚作為人類疾病模型奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

作為研究腫瘤模型工具，斑馬魚被稱作是一種理想的脊椎動(dòng)物模型。歸結(jié)原因如下：①從腫瘤的生物學(xué)角度來說，魚和人的腫瘤在組織學(xué)上是非常相似的。②魚的腫瘤竟然與人類一樣，也具有遺傳性。研究比較人和魚的基因序列，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞周期基因、腫瘤抑制因子、以及致癌基因等方面都具有保守性。③在藥物作用方面，發(fā)現(xiàn)雖然斑馬魚與人的蛋白同源性<70%，但蛋白功能域（如藥物作用的靶點(diǎn)）的同源性接近100%。④斑馬魚的胚胎和腫瘤具有相似的特征：比如細(xì)胞分裂快、細(xì)胞凋亡速度延緩和血管生成旺盛等。

綜上所述，斑馬魚作為腫瘤模式生物日益受到關(guān)注，目前其研究主要集中在腫瘤血管生成和細(xì)胞凋亡兩方面。

3斑馬魚所患的肺癌

盡管斑馬魚沒有肺器官，依靠魚鰓輔助呼吸。但先前有研究成功構(gòu)建出斑馬魚胚胎移植乳腺癌，其也無乳腺組織，未做到組織器官發(fā)病，不過癌細(xì)胞在斑馬魚胚胎中的存活、促血管生成、遷移特征、及相關(guān)分子的表達(dá)都具有極高相似度；同時(shí)腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)因子如VEGF、HER2等重要靶點(diǎn)與人類有較高的保守性[16]，對(duì)于靶點(diǎn)藥物的評(píng)價(jià)也展示出了良好的適用性，在抗腫瘤的應(yīng)用研究中得到很大認(rèn)可。故研究者們開始大膽設(shè)想并進(jìn)行研究，目前已經(jīng)有關(guān)以斑馬魚為模型來研究抗肺癌藥物療效，如Vinothkumar等[17]的研究，說明以斑馬魚模型替代小鼠模型進(jìn)一步驗(yàn)證石墨烯對(duì)NSCLC有一定的抑癌作用，所以至此一大批以斑馬魚模型研究探究肺癌藥物的有效性和安全性的試驗(yàn)將如雨后春筍般涌現(xiàn)，這也將進(jìn)一步推動(dòng)肺癌研究領(lǐng)域的快速發(fā)展。

4斑馬魚腫瘤模型建立技術(shù)

目前構(gòu)建各種良、惡性腫瘤模型的方法包括基因突變、人類腫瘤細(xì)胞移植、直接致癌藥物干預(yù)等。總結(jié)其腫瘤模型可分為以下3類：基因突變模型，化學(xué)誘導(dǎo)致癌模型，基因組改造模型[18]。由于斑馬魚與人類基因具有高度的同源性，各類腫瘤模型在組織學(xué)上與人類腫瘤是有高度一致性的。結(jié)合小分子篩選技術(shù)、遺傳分析和癌變檢測(cè)技術(shù)，斑馬魚正被廣泛用于新的腫瘤相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)及抗腫瘤藥物的篩選中[19-20]。斑馬魚的操作技術(shù)包括最常用的注射，其是在胚胎發(fā)育早期階段進(jìn)行的；原位雜交技術(shù)是斑馬魚研究中最古老的方法之一；原位標(biāo)記是斑馬魚研究中最經(jīng)典的方式，是通過著色標(biāo)記探針，用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)信號(hào)；移植是發(fā)育生物學(xué)中應(yīng)用得最古老的方法之一。在移植過程中，一團(tuán)細(xì)胞從供體胚胎中移出，植入受體胚胎中；以及對(duì)基因表達(dá)下調(diào)、定向突變、轉(zhuǎn)基因工具和嵌合實(shí)驗(yàn)。斑馬魚已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究中重要的體內(nèi)模型，且已經(jīng)開發(fā)和利用有效的方法來提供解決方案中的化合物或藥劑。最新研究表示，除了傳統(tǒng)的口服用藥和靜脈給藥，更推薦強(qiáng)飼，即一種灌胃程序，能更好的利于斑馬魚吸收，從而得出更精確的試驗(yàn)數(shù)據(jù)[21]。這些技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用都為斑馬魚在腫瘤模型及抗腫瘤新藥研究的發(fā)展打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

5斑馬魚肺癌模型的建立

許多研究者堅(jiān)信斑馬魚能在科研道路上開辟出來一片新天地，一直倡導(dǎo)并致力借此研究腫瘤，現(xiàn)已卓有建樹。已有研究發(fā)現(xiàn)以成年斑馬魚為模式生物，對(duì)其進(jìn)行肌肉注射5 μl的A549細(xì)胞，然后間隔14 d后，繼續(xù)注射。

5 μl的A549細(xì)胞。將魚置于21.l℃的水箱中，14/10 h的光周期和暗周期，如常喂養(yǎng)60 d，最后發(fā)展成腫瘤，但目前還沒有關(guān)于可用H60細(xì)胞系成功構(gòu)建斑馬魚肺癌模型的研究[22]。

通過研究斑馬魚黑色素瘤模型，研究者們已經(jīng)獲得多種治療人類相應(yīng)癌癥的先導(dǎo)化合物[23]。有研究者以斑馬魚模型進(jìn)一步探索肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力及其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，如Eramo等[24]在NSCLC和SCLC中均發(fā)現(xiàn)了CD133腫瘤細(xì)胞，CD133是一種擁有極強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的肺癌腫瘤干細(xì)胞，其通過Notch及Wnt兩條通路來維持自我更新和無限增殖分化。相對(duì)來說，斑馬魚肺癌模型研究尚只應(yīng)用于肺癌抗腫瘤藥物療效評(píng)價(jià)。勞喬聰?shù)萚25]借鑒斑馬魚腫瘤異種移植模型設(shè)計(jì)出斑馬魚肺癌異種移植模型，研究抗肺癌A549藥敏試驗(yàn)中，藥效從高到低分別為貝伐單抗（65%）>順鉑（55%）>長(zhǎng)春瑞濱（40%）>恩度（39%）>紫杉醇（27%）[26]。亦有研究者利用斑馬魚移植肺癌模型研究魚藤素的抑癌效果。

6小結(jié)

斑馬魚自身的眾多特點(diǎn)使其在生物模型中備受研究者們青睞，其移植瘤模型的制作方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性佳、周期且短，加之斑馬魚基因測(cè)序工程的完成，揭示其基因組與人類基因組的相似性高達(dá)87%[27]，在多種癌細(xì)胞的遷移研究和藥物活性評(píng)價(jià)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。從目前的研究來看，隨著斑馬魚腫瘤模型的不斷深入研究，尤其是斑馬魚肺癌模型構(gòu)建技術(shù)的不斷成熟，這將為肺癌的相關(guān)分子研究機(jī)制拉開新的研究途徑，同時(shí)也為接下來一大批肺癌耐藥機(jī)制的研究及新藥的研制提供更具優(yōu)勢(shì)的生物工具，且斑馬魚在抗癌藥體內(nèi)藥敏試驗(yàn)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可供研究者繼續(xù)挖掘。

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（收稿日期：2018-10-30 本文編輯：崔建中）