有氧運(yùn)動(dòng)和谷氨酰胺對(duì)二型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激及相關(guān)因子表達(dá)的影響*

王小梅，景會(huì)鋒

(延安大學(xué)體育學(xué)院，陜西 延安 716000)

眾多研究表明，糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激損傷和炎性因子應(yīng)答能力下降與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)[1-2]。在二型糖尿病(type 2 diabetes,T2MD)患者中大約有50% 合并血脂異常，導(dǎo)致心血管等出現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)[3]；氧化應(yīng)激損傷也占有重要作用，活性氧不但造成胰島β 細(xì)胞的損傷，還能激活某些應(yīng)激敏感通路，通過對(duì)相關(guān)因子表達(dá)的調(diào)節(jié)，誘發(fā)胰島素抵抗，導(dǎo)致或加重糖尿病[4]。目前的研究也表明，在人類和嚙齒動(dòng)物中，慢性炎性已經(jīng)成為胰島素抵抗、T2MD和心血管疾病的治療靶標(biāo)[5]。糖尿病固有的免疫炎癥反應(yīng)會(huì)引起機(jī)體多系統(tǒng)的功能障礙，炎性反應(yīng)失調(diào)引起胰島素的抵抗等各種并發(fā)癥，進(jìn)而加重病情。谷氨酰胺(glutamine,Gln)具有多種免疫調(diào)節(jié)功能、參與糖代謝的調(diào)節(jié)、同時(shí)也是合成體內(nèi)還原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)的重要前提物質(zhì)，谷胱甘肽在機(jī)體主要是參與細(xì)胞保護(hù)作用，能夠增加機(jī)體抗氧化能力，降低活性氧的產(chǎn)生，降低中性粒細(xì)胞對(duì)組織的浸潤[6]。研究表明肥胖及T2MD患者體內(nèi)Gln減少[7]。而運(yùn)動(dòng)對(duì)于防治糖尿病有積極作用[8]。運(yùn)動(dòng)在降低體脂的同時(shí)可改善骨骼肌質(zhì)量，調(diào)節(jié)糖脂的代謝；增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力；促進(jìn)抗炎因子白介素6等的表達(dá)進(jìn)而強(qiáng)烈抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)程度；改善胰島素的抵抗，且不同運(yùn)動(dòng)方式影響不同[9]。因此，本研究觀察有氧運(yùn)動(dòng)和外源性補(bǔ)充Gln聯(lián)合干預(yù)對(duì)T2MD糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激損傷和炎性因子應(yīng)答能力的影響，旨在為制定改善糖尿病患者的癥狀和預(yù)防并發(fā)癥發(fā)生的措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

鏈脲佐菌素(STZ)購買于Sigma公司，溶于 0.1 mmol/L枸椽酸緩沖液內(nèi)，pH=4.2，現(xiàn)配現(xiàn)用；血糖和血脂測(cè)定應(yīng)用東芝全自動(dòng)生化分析儀；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的測(cè)試嚴(yán)格按照試劑盒說明，試劑盒購于南京建成生物科技有限公司；血清脂聯(lián)素、瘦素和TNF-α檢測(cè)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物

雄性SD大鼠50只(購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心)，6周，體重220～270 g，動(dòng)物室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度45%～55%，自然晝夜照明，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料為標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料，高脂飼料為含膽固醇2%，豬油10%，膽酸鈉0.5%。

1.3 大鼠分組及DOP模型的建立

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組：安靜對(duì)照組(N)、糖尿病對(duì)照組(D)、糖尿病施加有氧運(yùn)動(dòng)組(DE)、糖尿病施加谷氨酰胺組(DG)、糖尿病施加有氧運(yùn)動(dòng)+谷氨酰胺組(DEG)，每組各10只。N組大鼠正常飼料喂養(yǎng)，不加任何干預(yù)，D、DE、DG和DEG組大鼠造模組高脂飼料喂養(yǎng)2個(gè)月，在禁食16 h后一次性腹腔注射35 mg/kg STZ[10]，注射7 d后尾靜脈采血測(cè)試血糖濃度，血糖濃度大于16.7 mmol/L，且持續(xù)三周，為成模大鼠。

1.4 Gln干預(yù)

Gln購自 Sigma公司，DG組和DEG組大鼠第一周預(yù)適應(yīng)訓(xùn)練期間不補(bǔ)充Gln，正式訓(xùn)練期間于每次訓(xùn)練前1 h用灌胃針灌胃Gln混懸液2 ml(0.8 g/(kg·d))[11]，N組、D 組和DE組每天灌胃等體積的蒸餾水。

1.5 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

EG、DE和DEG組大鼠采用遞增負(fù)荷的方式進(jìn)行跑臺(tái)有氧運(yùn)動(dòng)，起始速度為10 m/min，時(shí)間為20 min，適應(yīng)性訓(xùn)練1周后開始正式訓(xùn)練。運(yùn)動(dòng)負(fù)荷參考Bedford的研究加以調(diào)整[12]，每周訓(xùn)練5 d，速度逐漸遞增由10 m/min增至24 m/min，訓(xùn)練時(shí)間遞增值為5 min/d，整個(gè)訓(xùn)練過程共持續(xù)8周。

1.6 儀器設(shè)備與觀察指標(biāo)的測(cè)定

于末次訓(xùn)練結(jié)束后，按50 mg/kg的劑量腹腔注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉后，迅速分離頸總動(dòng)脈，采血4 ml，注入含乙二胺四乙酸鈉30 μl和10%抑肽酶40 μl的試管中，混勻，離心半徑12 cm，離心(3 000 r/min，10 min，4℃)，分離血漿，-20℃保存，備用待測(cè)血糖、SOD、GSH-Px、MDA、胰島素和血脂。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中的SOD活性和MDA含量變化的比較

由表1可知，與N組相比，D組大鼠血清中SOD和GSH-Px活性明顯下降(P<0.01)，MDA含量明顯升高(P<0.01)；與D組相比，DE、DG和DEG組大鼠血清中SOD和GSH-Px活性明顯升高(P<0.05,P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.05,P<0.01)；與DE和DG組相比，DEG大鼠血清中SOD和GSH-Px活性和MDA含量變化較DE、DG單獨(dú)作用更為明顯(P<0.01)。

Tab. 1 MDA content and SOD,GSH-Px activity changes of diabetic n=10)

N：Control group；D：Diabetic control group；DE：Diabetic aerobic exercise group；DG：Diabetic Gln group；DEG：Exercise Gln group；SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malonaldehyde；GSH-Px：Glutathione peroxidase
**P<0.01vsN；#P<0.05,##P<0.01vsD；△△P<0.01vsDE,DG

2.2 各組大鼠血清中血糖和血脂含量變化的比較

由表2可知，與N組相比，D組大鼠血糖、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)和胰島素含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein- cholesterol，HDL-C)含量明顯降低(P<0.05)，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)含量升高，但無顯著性差異(P>0.05)；與D組相比，DE、DG和DEG組大鼠血清中血糖、TC、TG和胰島素含量明顯降低(P<0.05,P<0.01)，HDL-C含量明顯上升(P<0.05,P<0.01)，DE和DG組LDL-C含量降低，但無顯著性差異(P>0.05)，DEG組LDL-C含量明顯降低(P<0.05)；與DE和DG組相比，DEG組大鼠血清中血糖、TC、TG、LDL-C和胰島素、HDL-C含量含量變化較DE、DG單獨(dú)作用變化更為明顯(P<0.01)。

Tab. 2 Changes of blood glucose,blood lipid and insulin in diabetic n=10)

N：Control group；D：Diabetic control group；DE：Diabetic aerobic exercise group；DG：Diabetic Gln group；DEG：Exercise Gln group；TC：Total cholesterol；TG：Triglyceride；LDL-C：Low density lipoprotein-cholesterol；HDL-C：High density lipoprotein- cholesterol
*P<0.05,**P<0.01vsN；#P<0.05,##P<0.01vsD；△△P<0.01vsDE,DG

2.3 各組大鼠血清脂聯(lián)素、瘦素和TNF-的變化

由表3可知，與N組相比，D組大鼠血清中脂聯(lián)素水平明顯降低(P<0.05)，瘦素和TNF-水平明顯升高(P<0.05,P<0.01)；與D組相比，DE、DG和DEG組大鼠血清中脂聯(lián)素水平明顯升高(P<0.05,P<0.01)，瘦素和TNF-水平明顯降低(P<0.05,P<0.01)；與DE和DG組相比，DEG組大鼠血清中脂聯(lián)素，瘦素和TNF-水平變化較DE、DG單獨(dú)作用變化更為明顯(P<0.01)。

Tab. 3 Changes of serum adiponectin,leptin and tumor necrosis factor-(TNF-)in diabetic rats(ng/ml, n=10)

Tab. 3 Changes of serum adiponectin,leptin and tumor necrosis factor-(TNF-)in diabetic rats(ng/ml, n=10)

N：Control group；D：Diabetic control group；DE：Diabetic aerobic exercise group；DG：Diabetic Gln group；DEG：Exercise Gln group

*P<0.05,**P<0.01vsN；#P<0.05,##P<0.01vsD；△△P<0.01vsDE,DG

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用STZ注射進(jìn)行T2MD造模，成模后的D組大鼠的血糖和胰島素水平較N組明顯升高，表明塑模成功。研究表明糖脂代謝紊亂加重了糖尿病的氧化應(yīng)激的程度[13]，從而引起下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)功能亢進(jìn)，引起糖代謝紊亂，血糖升高，進(jìn)一步造成機(jī)體損傷。機(jī)體氧化應(yīng)激水平可以通過檢測(cè)血漿SOD、GSH-Px活力以及MDA 含量來反映[14]。本研究結(jié)果表明，與N組大鼠相比，D組大鼠血清中SOD和GSH-Px活力明顯下降，MDA含量明顯升高，表明T2MD大鼠抗氧化防御體系受到抑制，易出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。大量研究表明，糖尿病患者糖脂代謝紊亂，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[15]。本實(shí)驗(yàn)T2MD大鼠存在明顯的糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激以及炎癥情況，這與Wei等和Zeyda等的研究一致，即T2MD的發(fā)病與慢性炎癥以及胰島素抵抗(insulin resistance，IR)關(guān)系密切[16]。現(xiàn)代研究表明，肥胖是引發(fā)IR和瘦素抵抗(leptin resistance，LR)的最重要因素，而IR和LR是T2MD等代謝性疾病的基礎(chǔ)。目前的研究已經(jīng)表明，脂聯(lián)素與IR密切相關(guān)，并且很可能是一種新的代謝綜合征標(biāo)志物。本研究顯示，T2MD大鼠血漿脂聯(lián)素水平與血漿胰島素呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，再次證實(shí)脂聯(lián)素與IR密切，但是脂聯(lián)素與IR之間的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。Kubota認(rèn)為，脂聯(lián)素能有效提高胰島素的敏感性，可能是由于胰島素的敏感性與葡萄糖代謝的穩(wěn)定需要脂聯(lián)素進(jìn)行正常調(diào)節(jié)[17]。近年來，TNF-α在T2MD相關(guān)疾病中的作用越來越受到重視。有研究表明，TNF-α可加速脂肪細(xì)胞的脂解，促使游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)從細(xì)胞溢出，參與肥胖及IR的發(fā)生[18]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，T2MD大鼠TNF-α水平上升，說明其IR和炎癥損傷的程度較高。以往研究表明，胰島素不僅能夠直接抑制炎癥因子的生成，而且還能通過調(diào)節(jié)血糖濃度來間接發(fā)揮抗炎作用，緩解炎癥損傷。但當(dāng)T2MD伴隨IR和LR時(shí)，TNF-α等炎癥因子水平上升，由此可以認(rèn)為IR和LR是一個(gè)炎癥過程，這與本研究結(jié)果一致，故對(duì)T2MD肥胖患者治療的關(guān)鍵是增強(qiáng)其胰島素和瘦素的敏感性。本實(shí)驗(yàn)中T2MD大鼠糖脂代謝紊亂、IR和LR抵抗、氧化應(yīng)激增強(qiáng)等都被認(rèn)為直接或間接地誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)的增加，這些因素的之間的交互作用可能進(jìn)一步加劇機(jī)體多器官系統(tǒng)的炎癥損傷，從而引起代謝改變綜合征。

國內(nèi)外研究表明，運(yùn)動(dòng)是防治T2MD的重要手段[19-20]。以往研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)能改善IR，從而有效地控制T2MD[21]。本研究顯示，進(jìn)行6周的有氧運(yùn)動(dòng)能有效提高T2MD大鼠的抗氧化應(yīng)激能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著血糖水平的下降，TC和TG隨之明顯下降，HDL-C明顯升高，可見血糖的控制程度的優(yōu)劣對(duì)脂肪代謝能力有顯著的影響；有氧運(yùn)動(dòng)能夠改善糖脂代謝紊亂，可能是由于有氧運(yùn)動(dòng)使糖脂消耗增加，在運(yùn)動(dòng)后的超量恢復(fù)階段，糖原合成酶的活性升高，使血液中的血糖迅速轉(zhuǎn)移到肌肉中用于肌糖原的補(bǔ)充；運(yùn)動(dòng)引起交感神經(jīng)興奮性提高，使得血液胰島素水平下降，體內(nèi)脂肪分解增加，增加了脂肪作為能量的利用，降低TC含量；運(yùn)動(dòng)也增加了骨骼肌對(duì)游離脂肪酸的攝取和利用，使得TC分解代謝增強(qiáng)，濃度下降；同時(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)又能夠降低血液中LDL-C和提高HDL-C含量，從而改善T2MD導(dǎo)致的血管粥樣硬化，減輕并發(fā)癥的發(fā)生；運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練還可以增強(qiáng)脂解酶的活性，即在肌肉收縮過程中不僅糖代謝紊亂得到改善，脂代謝也得到相應(yīng)的改善。有氧運(yùn)動(dòng)后SOD、GSH-Px活性增強(qiáng)，MDA 含量降低，表明運(yùn)動(dòng)通過提高抗氧化酶的活性，改善T2MD大鼠的過氧化損傷、抑制氧化應(yīng)激來提高防御能力。關(guān)于血清炎癥因子TNF-α與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系已有研究表明，長期系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)可以降低TNF-α，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，運(yùn)動(dòng)能降低T2MD大鼠TNF-α，從而減輕炎癥反應(yīng)。本研究表明，運(yùn)動(dòng)可明顯增加抗炎因子脂聯(lián)素的表達(dá)，這可能是由于運(yùn)動(dòng)能有效改善糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂，從而抑制TNF-ɑ和瘦素的產(chǎn)生。Hulve研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)脂聯(lián)素水平的影響不大，且不能改善胰島素的敏感性[22]。目前關(guān)于運(yùn)動(dòng)與脂聯(lián)素的水平存在爭議。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)增加了脂聯(lián)素的含量，但與D組比較沒有顯著性的差異，這可能與本實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度較低，持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短有關(guān)，適當(dāng)增加運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度或者持續(xù)時(shí)間可能會(huì)顯著提高脂聯(lián)素。長期有氧運(yùn)動(dòng)極大地改善了T2MD大鼠糖脂代謝紊亂、IR、氧化應(yīng)激的狀況，從而直接或間接地抑制炎癥因子表達(dá)的增加，減輕炎癥反應(yīng)。有研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞分泌大量IL-6，IL-6能夠抑制TNF-α和IL-1β分泌，同時(shí)還能促進(jìn)抗炎因子如IL-10 和IL-1的分泌。雖然認(rèn)識(shí)到運(yùn)動(dòng)對(duì)緩解機(jī)體炎癥有一定的作用，但其機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

機(jī)體處于應(yīng)激狀況以及高分解代謝疾病狀態(tài)下(比如糖尿病)，血漿中游離Gln含量迅速下降甚至耗竭，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)細(xì)胞免疫能力下降。研究表明，外源性補(bǔ)充Gln后可明顯緩解上述情況，因此已被廣泛用做營養(yǎng)補(bǔ)充劑以及多種臨床疾病的治療[23]。T2MD患者體內(nèi)Gln明顯減少，給予T2MD患者外源性Gln補(bǔ)充不僅可提高機(jī)體的抗氧化能力。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)充Gln可明顯地提高T2MD大鼠抗氧化應(yīng)激作用，改善T2MD 大鼠血糖代謝紊亂的情況，有效降低T2MD大鼠瘦素和TNF-的表達(dá)，減輕大鼠的炎癥性損傷。

脂肪組織是循環(huán)血液中TNF-α的主要來源，長期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可以改善身體成分，減少脂肪細(xì)胞分泌TNF-α；Opara的研究表明補(bǔ)充Gln會(huì)使高脂膳食小鼠體重下降的同時(shí)改善IR[24]；然而Bock的研究報(bào)道指出，補(bǔ)充Gln并不能有效的改善小鼠的體重以及IR狀態(tài)[25]。因此，Gln是否能改善糖尿病大鼠體重的增加和IR的作用還存在爭議。本研究表明，Gln干預(yù)后大鼠體重下降，IR改善，且二者聯(lián)合干預(yù)效果更好。T2MD機(jī)體Gln水平降低，及時(shí)的補(bǔ)充且伴隨有氧運(yùn)動(dòng)有效地改善糖脂的代謝以及全身的血液循環(huán)，使得機(jī)體獲取更多的能源底物，增加抗氧化物質(zhì)的合成，改善血脂代謝紊亂以及炎癥因子和抗炎因子的失衡有關(guān)。有氧運(yùn)動(dòng)組和Gln組大鼠胰島素、瘦素水平顯著下降，脂聯(lián)素水平上升，且兩者聯(lián)合干預(yù)效果更顯著，從而提示有氧運(yùn)動(dòng)和Gln均能調(diào)節(jié)胰島素和瘦素水平，改善IR 和LR，增強(qiáng)胰島素和瘦素的敏感性，提高脂聯(lián)素水平。

綜上所述，改善糖脂代謝、減輕氧化應(yīng)激以及慢性炎性已經(jīng)成為T2MD的治療靶標(biāo)，補(bǔ)充Gln和有氧運(yùn)動(dòng)均可以改善T2MD大鼠糖脂代謝、胰島素敏感性，減輕氧化應(yīng)激損傷，降低炎性因子應(yīng)答能力，且兩者聯(lián)合作用效果更好，但其確切機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。