姜黃素及其類似物J7對2型糖尿病大鼠睪丸氧化應(yīng)激損傷的干預(yù)作用*

徐菲菲，繆成鋒，池 琛，吳 谷，陳國榮

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325015)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種由于胰島素分泌不足或者胰島素抵抗引起的內(nèi)分泌疾病，它可以引發(fā)全身多個器官及組織的并發(fā)癥。生殖功能障礙作為糖尿病的一種并發(fā)癥，包括了陽痿、射精不全、不孕等[1,2]。有研究表明，氧化應(yīng)激在糖尿病男性和動物模型的生殖功能異常中發(fā)揮重要作用；核因子E2相關(guān)因子2(the nuclear factor-erythroid-2 related factor 2，tNrf2)作為一個對抗氧化應(yīng)激的防御因子，它可以通過上調(diào)抗氧化蛋白的表達來對細胞產(chǎn)生保護[3]，而糖尿病大鼠睪丸氧化應(yīng)激損傷與Nrf2的下調(diào)息息相關(guān)[4,5]。

姜黃素是從姜黃根莖中分離出來的具有活性的黃色二酮類化合物，分子式為C21H20O6。姜黃素已被證實具有治療糖尿病、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用；同時，在中國及印度等國家，它也得到廣泛的臨床應(yīng)用，并取得較好的治療效果[6]。此前，有學(xué)者提出姜黃素可通過上調(diào)Nrf2及其下游因子的表達來對抗糖尿病大鼠睪丸病變[7]，本實驗室在前期實驗中也證明了姜黃素類似物B06對于糖尿病大鼠發(fā)生在心肌[8]，腎臟[9]，睪丸[10]的病變均有一定的治療效果。本次實驗，使用B06基礎(chǔ)上改良而來的姜黃素類似物J7，將姜黃素結(jié)構(gòu)中不穩(wěn)定的β-二酮替換為單酮，其藥物穩(wěn)定性及生物利用度上均得到一定程度的改良。并進一步優(yōu)化實驗設(shè)計及分組，通過建立糖尿病大鼠模型，研究姜黃素類似物J7與姜黃素對糖尿病大鼠睪丸病變的干預(yù)作用及其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠60只(200±20)g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(浙)2015-0009。大鼠飼養(yǎng)室內(nèi)溫度18～24℃，相對濕度45%～55%。

1.2 藥品與試劑

姜黃素采購自美國Sigma公司，姜黃素類似物J7(圖1)由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成提供，兩種藥物均溶于1%羧甲基纖維素鈉(CMCNa)溶液；Western blot及免疫組化所使用的抗體包括β-actin、磷酸化核因子E2相關(guān)因子2(phosphorylation of Nrf2，pNrf2)、tNrf2、過氧化氫酶(catalase，CAT)、NAD(P)H 醌氧化還原酶1(NAD(P)H quinine oxidoreductase 1，NQO1)均購自于美國Abcam公司；逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR試劑盒均購自于日本Takara公司；Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)相關(guān)引物由上海生工合成；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。

Fig. 1 The chemical formula of J7

1.3 主要儀器

血糖測試儀(美國強生公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，QuantStudio 5 Real-Time PCR系統(tǒng)(美國Thermo公司)，RM2245型石蠟切片機(德國萊卡公司)，BX 43型顯微成像系統(tǒng)(日本Olympus公司)，全自動酶標儀(西班牙Diagnostic Grifo公司)，Image Lab圖像分析軟件(美國Bio-Rad公司)。

1.4 動物模型建立

60只健康SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，測量體重及血糖情況均正常，且無明顯差異，后隨機分組，其中10只作為正常組(normal control，NC組)，剩余50只作為實驗組。正常組正常飲食4周，實驗組高脂飲食4周。4周后，高脂飲食的大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(steptozotocin，STZ)30 mg/kg進行糖尿病建模，72 h后及一周后檢測大鼠尾靜脈空腹血糖，兩次均大于16.7 mmol/L的認為造模成功。測定結(jié)果為50只實驗組大鼠中，42只建模成功，8只建模失敗予以剔除。然后將成功建模的大鼠，隨機分為4個實驗組：糖尿病組(DM組)、姜黃素治療組(curcumin，CUR組)、J7高劑量治療組(J+ 組)、J7低劑量治療組(J- 組)。將姜黃素及姜黃素類似物J7分別溶于1%羧甲基纖維素鈉(CMCNa)溶液，在接下來的8周中，CUR組大鼠每天予以姜黃素20 mg/kg灌胃治療，J+及J-組分別予以J7 20 mg/kg、10 mg/kg灌胃治療，NC組及DM組予以相同體積的1%CMCNa溶液灌胃。在實驗過程中，8只大鼠死亡予以剔除，實驗結(jié)束時，每組大鼠數(shù)目分別為NC 組(n=9)、DM 組(n=10)、CUR 組(n=7)、J+ 組(n=8)、J- 組(n=10)。8周后，測量過所有大鼠的血糖及體重后，予以腹腔麻醉后并處死，并對所需標本進行及時的收集與處理。

1.5 HE染色及免疫組織化學(xué)法

將大鼠睪丸組織用Bouin’s液固定后，脫水，透明，浸蠟，包埋制成蠟塊，使用切片機對蠟塊進行切片(3.5 μm)。根據(jù)試劑說明書，對處理好的切片分別進行HE染色及Nrf2、CAT指標的免疫組化處理。最后，利用顯微鏡對圖像進行觀察及采集。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)

將新鮮大鼠睪丸組織進行充分裂解及研磨后，使用BCA法測定不同組間蛋白濃度，并將等量蛋白樣本進行煮沸及分裝。然后，進行制膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育，曝光，獲得Western blot最終條帶。使用Image Lab軟件對各條帶進行定量分析。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

將新鮮大鼠睪丸組織進行研磨，提取RNA后，使用酶標儀測定不同組間RNA的純度及濃度，并將等量RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。然后，根據(jù)試劑盒說明書，利用cDNA樣本進行qRT-PCR反應(yīng)并分析。

1.8 SOD及MDA測定

根據(jù)試劑盒說明書，分別對不同組間睪丸的超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量進行測定。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同組大鼠血糖及體重的比較

如表1所示，在實驗結(jié)束時，糖尿病大鼠血糖(29.26±4.67)mmol/L明顯高于正常組(5.82± 1.19)mmol/L，其中J+組及J-組血糖顯著下降(P<0.05)，而CUR組大鼠血糖下降并不明顯。同時，糖尿病大鼠體重(287.00±56.18)g相對于健康大鼠(407.80±46.04)g也出現(xiàn)了顯著的降低(P<0.05)，通過姜黃素及J7治療后，三個治療組體重未發(fā)生明顯改變。

Tab. 1 Effects of curcumin and J7 on fast blood glucose and body

NC：Normal control；DM：Diabetes mellitus；CUR：Curcumin-treated diabetes mellitus；J+：High dose of J7；J-:Low dose of J7
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

2.2 不同組大鼠睪丸形態(tài)學(xué)改變的比較

如圖2所示，HE染色結(jié)果中，正常組睪丸曲細精管形態(tài)完整，生精細胞5～8層，排列整齊，規(guī)則的管腔內(nèi)可見發(fā)育成熟的精子。在糖尿病組中，曲細精管內(nèi)各級生精細胞出現(xiàn)不同程度缺失，層數(shù)減少，排列紊亂，管腔發(fā)生閉塞，精子成熟出現(xiàn)障礙。經(jīng)過姜黃素及J7治療后，上述形態(tài)學(xué)的病變得到不同程度的改善，但三個治療組間差異不明顯(圖2)。

在Nrf2的免疫組化結(jié)果中，正常組曲細精管內(nèi)可見該蛋白在各級生精細胞中有較為明顯的核周陽性表達，糖尿病組核周染色相對較淺，通過姜黃素及J7治療后，糖尿病睪丸核周的Nrf2出現(xiàn)上升，但三個治療組間差異不明顯。而在CAT的免疫組化結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)在睪丸Leydig細胞內(nèi)，糖尿病組CAT的陽性表達程度明顯低于正常組，經(jīng)過姜黃素及J7治療后，CAT在Leydig細胞中的表達量得到提升，但三個治療組間差異不明顯。

2.3 不同組大鼠睪丸pNrf2、tNrf2、NQO1、CAT蛋白的表達

如圖3及表2所示，各組間的tNrf2并沒有出現(xiàn)顯著差異。但是，pNrf2/tNrf2值在糖尿病組出現(xiàn)下降(P<0.05)，經(jīng)過姜黃素及J7治療后，該比值得到了顯著的回升(P<0.05)。此外，J+組pNrf2/tNrf2比值明顯高于CUR組及J-組(P<0.05)。同時，糖尿病組比起正常組，NQO1及CAT蛋白的表達量也更低(P<0.05)，姜黃素及J7同樣可以減輕這兩個指標的變化(P<0.05)，其中J+組CAT蛋白水平明顯高于J-組(P<0.05)。

Fig.3Protein expressions of pNrf2,tNrf2,NQO1 and CAT in the testis

Tab. 2 Curcumin and J7 induced the protein expressions of tNrf2,pNrf2/tNrf2,NQO1,CAT in the

NC：Normal control；DM：Diabetes mellitus；CUR：Curcumin-treated diabetes mellitus；J+：High dose of J7；J-:Low dose of J7
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group；△P<0.05vsCUR group；▲P<0.05vsJ- group

2.4 不同組大鼠睪丸NQO1、Hemeoxygenase-1(HO1)、CAT mRNA表達水平的比較

如表3所示，在糖尿病大鼠的睪丸組織中，NQO1、HO1、CAT mRNA出現(xiàn)不同程度的下降(P<0.05)。通過姜黃素及J7治療后，三個治療組NQO1和HO1 mRNA的下降均得到緩解(P<0.05)；而CAT mRNA的改變只在J+組得到顯著的恢復(fù)(P<0.05)。同時，NQO1、HO1、CAT mRNA在三個治療組間不存在顯著差異。

Tab. 3 Curcumin and J7 induced Nrf2 transcription function in the

NC：Normal control；DM：Diabetes mellitus；CUR：Curcumin-treated diabetes mellitus；J+：High dose of J7；J-:Low dose of J7
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

2.5 不同組大鼠睪丸超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的改變

如表4所示，與正常組相比，糖尿病大鼠的睪丸組織中，SOD活性明顯下降(P<0.05)，而MDA的含量出現(xiàn)上升(P<0.05)。在三個治療組中，這兩個指標的異常變化均得到不同程度的改善(P<0.05)。但SOD活性及MDA含量在三個治療組間不存在顯著差異。

Tab. 4 Effects of curcumin and J7 on antioxidant ability in the

NC：Normal control；DM：Diabetes mellitus；CUR：Curcumin-treated diabetes mellitus；J+：High dose of J7；J-:Low dose of J7
*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

3 討論

近年來世界各地的糖尿病患者數(shù)量急劇增加，據(jù)統(tǒng)計，2013年全球已有3.82億的糖尿病患者，到2035年預(yù)計這個數(shù)字將會增加到5.92億，其嚴重的并發(fā)癥會給患者的身心健康和生活質(zhì)量帶來巨大的危害[11]。睪丸組織正常的結(jié)構(gòu)和功能是維持生殖能力的基本條件，本實驗觀察到糖尿病大鼠睪丸曲細精管結(jié)構(gòu)受到嚴重破壞，而姜黃素及其類似物J7對糖尿病大鼠的睪丸組織結(jié)構(gòu)則具有一定的保護作用。

國內(nèi)外均有研究表明高血糖導(dǎo)致的生殖系統(tǒng)損傷可能與過度激活的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[12]。在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，姜黃素已經(jīng)被證明可以通過緩解氧化應(yīng)激，從而減輕睪丸組織的損傷和細胞凋亡[13]。并且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過上調(diào)Nrf2及其下游抗氧化因子表達來減輕糖尿病大鼠睪丸的病變[7]。在正常生理條件下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1)相互結(jié)合，主要以復(fù)合物的形式存在于細胞質(zhì)中，當機體發(fā)生氧化應(yīng)激時，Nrf2 Ser40位點發(fā)生磷酸化使Nrf2-Keap1復(fù)合物解離，游離的Nrf2轉(zhuǎn)移至細胞核與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，激活Nrf2-ARE信號通路并上調(diào)下游抗氧化因子的表達[6,14,15]；近幾年的研究中，Nrf2已成為多種疾病的新興治療靶點，如神經(jīng)退行性疾病、癌癥、肺纖維化等[16]。本實驗室已證實姜黃素類似物B06對于糖尿病大鼠睪酮的合成也存在影響作用[10]。但這些實驗中治療組往往比較單一，未進行不同藥物或不同藥物劑量的比較分析。本研究在前人的基礎(chǔ)上，提出全新的姜黃素類似物J7，并優(yōu)化分組設(shè)計，共包含3個治療組，能更好地說明J7所具備的治療優(yōu)勢及其理想的治療劑量。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素及其類似物J7可通過上調(diào)Nrf2及其下游抗氧化因子提高糖尿病睪丸的抗氧化能力。此外，通過檢測SOD活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，也證實睪丸存在嚴重的氧化應(yīng)激，而姜黃素及其類似物J7對糖尿病大鼠睪丸氧化應(yīng)激具有抑制作用。

相關(guān)文獻表明，姜黃素藥理作用廣泛，同時具有安全性高，毒性小的優(yōu)點[17,18]。但姜黃素的β-二酮基結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致其不穩(wěn)定及生物利用度不高[19]。而姜黃素類似物J7作為一種經(jīng)過改良的單羧基姜黃素類似物，其穩(wěn)定性及生物利用度上均得到一定提升。本實驗發(fā)現(xiàn)，J+組pNrf2/tNrf2水平顯著高于CUR組及J-組，CAT蛋白水平顯著高于J-組，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示高劑量J7抗糖尿病大鼠睪丸的氧化應(yīng)激損傷的能力較強。

綜上所述，在糖尿病睪丸組織中，相較于傳統(tǒng)藥物姜黃素，J7的療效有優(yōu)于姜黃素的趨勢，它能有效保護睪丸組織結(jié)構(gòu)；并更有效地激活Nrf2-ARE信號通路來降低氧化應(yīng)激損傷。而這也為治療糖尿病睪丸相關(guān)病變，及預(yù)防它的發(fā)生發(fā)展提供一個新方案。