HOXC8在人肝門部膽管癌中的表達及臨床意義

徐冬云 王娟 李可 于觀貞 俞文隆 徐永茂

Homebox（HOX）基因是由183個核苷酸組成的保守序列，通過編碼一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，特異性調(diào)控靶基因，進而影響胚胎發(fā)育及細胞增殖等。近年來，多種實體腫瘤及白血病均發(fā)現(xiàn)HOX基因表達失調(diào)，且與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移、誘導血管生成等生物學行為及預后密切相關［1-2]。HOXC8是HOX基因簇的重要成員，在多種實體瘤組織中過高或過低表達，如食管癌［3]、乳腺癌［4]、非小細胞肺癌［5]等，但其在肝門部膽管癌中的表達及臨床價值鮮有報道。本研究采用免疫組化法檢測HOXC8在人肝門部膽管癌組織中的表達，并探討其表達與臨床病理特征和預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集東方肝膽外科醫(yī)院2003年1月至2005年5月收治的49例肝門部膽管癌患者及其對應癌旁正常組織的石蠟標本。所有患者均經(jīng)病理組織學檢查確診，術前均未行放化療，其中男性25例，女性24例；中位年齡59歲（31～79歲），年齡≤55歲35例，＞55歲14例；腫瘤大小≤3 cm 18例，＞3 cm 31例。TNM分期依據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）第7版，T分期：T1～3期7例，T4期42例；N分期：N0期16例，N1～2期33例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期20例，Ⅲ/Ⅳ期29例。分化程度：中/高分化37例，低/未分化12例；所有腫瘤組織病理診斷均為膽管腺癌，肝細胞癌、肉瘤、淋巴瘤等均排除。本研究經(jīng)我院倫理委員會審查批準（批準文號：2019005），患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

SP免疫組化試劑盒、多聚-L-賴氨酸及DAB試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司，HOXC8抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 免疫組化染色

切片、烘片、常規(guī)脫蠟、水化、PBS沖洗，檸檬酸修復液中微波修復。根據(jù)SP法阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉各10 min，滴加HOXC8（sc-49823；稀釋比例1∶100）一抗，4 ℃孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木素復染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。PBS替代一抗作陰性對照。

1.4 結果判斷

于光鏡下觀察切片，每例切片隨機選取5個高倍鏡視野行結果判讀，由2名以上病理醫(yī)師確認結果。HOXC8陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細胞質(zhì)。評分采用二級計分法：⑴按陽性細胞所占比例計數(shù)，其中陽性細胞數(shù)≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計 2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；⑵按染色強度分類，其中無陽性細胞計0分，淡黃色計1分，黃或深黃色計2分，褐或棕褐色計3分。將兩者計分相乘，乘積≥3分為陽性表達［6]。

1.5 隨訪

通過電話、書信和查詢醫(yī)院病案等方式隨訪。隨訪截至2011年2月28日。49例患者隨訪資料完整，隨訪1～59個月，中位隨訪時間為37個月。總生存期（OS）定義為手術當日至患者死亡或末次隨訪的時間。疾病進展時間（TTP）定義為手術當日至患者術后腫瘤復發(fā)的時間。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0及GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學分析和繪圖。計數(shù)資料采用χ2檢驗：單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗；多因素生存分析采用Cox比例風險回歸模型。以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HOXC8在人肝門部膽管癌組織及癌旁正常組織中的表達

HOXC8主要染色于腫瘤細胞質(zhì)，陽性染色為淡黃、棕黃乃至深褐色，彌漫性分布，癌旁正常細胞中呈淡黃色或不著色見圖A1～A3、B1～B3。HOXC8在肝門部膽管癌組織中的陽性表達率為57.1%（28/49），高于癌旁正常組織的陽性表達率42.9%（21/49），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），其相對表達量見圖1C。

2.2 HOXC8表達與肝門部膽管患者臨床病理特征的關系

HOXC8表達與肝門部膽管癌患者腫瘤浸潤深度（P=0.001）、淋巴結轉(zhuǎn)移（P=0.011）、TNM 分期（P=0.044）相關，而與年齡、性別、腫瘤大小及分化程度無關（P＞0.05）。見表 1。

圖1 HOXC8在肝門部膽管癌組織及癌旁正常組織中的表達Fig.1 Expression of HOXC8 in hilar cholangiocarcinoma and adjacent non-cancerous tissues

表1 HOXC8表達與肝門部膽管癌患者臨床病理特征的關系Tab.1 Correlation between the expression of HOXC8 and clinico pathological parameters of patients with hilar cholan giocarcinoma

2.3 HOXC8表達與預后的關系

圖2 HOXC8與肝門部膽管癌患者預后的關系Fig.2 Relationship between expression of HOXC8 and prognosis of patients with hilar cholangiocarcinoma

單因素分析顯示，HOXC8陽性表達患者中位OS為12個月，明顯低于HOXC8陰性表達患者的46個月（P＜0.001），見圖2A；HOXC8陽性患者中位TTP 亦明顯較低表達者短（9個月 vs 39個月，P＜0.001），見圖2B。肝門部膽管癌患者腫瘤浸潤深度（P=0.006）、淋巴結轉(zhuǎn)移（P=0.018）及術式（P=0.002）與術后疾病進展時間有關，見表2。COX多因素回歸分析顯示，HOXC8是影響肝門部膽管癌患者預后的獨立因素（P=0.039），而腫瘤浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移及術式均不是肝門部膽管癌患者的獨立預后因素。見表3。

3 討論

肝門部膽管癌亦稱高位膽管癌、Klatskin瘤，是原發(fā)于肝總管與左、右肝管結合部的膽管細胞癌，發(fā)生率占肝外膽管癌的50%～70%［7]。因肝門部膽管癌起病隱匿，早期診斷困難，易侵犯周圍肝動脈、門靜脈，手術根治切除率低，預后極差，5年生存率不足10%［8]。即使行根治性腫瘤切除術，術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍居高不下，術后放化療、光動力治療、靶向治療及免疫治療等多種輔助治療手段貫穿肝門部膽管癌患者治療始終，亦收效甚微，故尋找肝門部膽管癌早期診斷標志物和基因治療新靶點尤為重要。目前，相對于其他實體瘤，有關肝門部膽管癌的分子腫瘤標志物報道較少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PKM2在肝門部膽管癌中表達上調(diào)，且是其獨立預后因子和治療靶點，機制可能與PKM2調(diào)節(jié)SDC2表達和神經(jīng)侵犯有關［9]。

表2 影響肝門部膽管癌患者生存的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of survival in patients with hilar cholangiocar cinoma

圖3 影響肝門部膽管癌術后疾病進展的單因素和多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analysis of postoperative disease progression in patients with hilar cholangioc arcinoma

HOXC8是位于12號染色體的HOXC簇基因之一，早期研究顯示，HOXC8作為驅(qū)動基因參與了軟骨發(fā)育［10-11]。隨著研究深入，研究者發(fā)現(xiàn)HOXC8在多種人類腫瘤中高表達，且在促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥中扮演重要角色。CHENG等［12]通過免疫組化法檢測50例骨肉瘤患者HOXC8蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)其在62.0%的癌組織中呈高表達，且HOXC8表達與低分化或未分化相關，生存分析顯示HOXC8高表達患者預后不良。HUANG等［13]研究發(fā)現(xiàn) HOXC8在宮頸癌組織和宮頸癌細胞中表達均增加，siRNA下調(diào)HOXC8表達可顯著抑制宮頸癌細胞生長。同樣，沉默HOXC8可抑制上皮性卵巢癌細胞增殖、遷移和誘導凋亡，可能與增加ZAC1的表達有關［14]。ZHANG等［15]研究報道與正常乳腺組織相比，HOXC8在晚期乳腺癌中表達水平明顯升高，且與乳腺癌患者較差的遠端無轉(zhuǎn)移生存率關系密切，并指出HOXC8可激活CDH11的轉(zhuǎn)錄從而促進乳腺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移。HOXC8亦可作為轉(zhuǎn)錄抑制劑抑制EMB的表達，從而促進乳腺癌細胞的生長和遷移［16]。但SHAH等［17]發(fā)現(xiàn)HOXC8在所有乳腺分子亞型的干細胞/祖細胞中均持續(xù)下調(diào)，可能是候選的乳腺腫瘤抑制基因，上調(diào)HOXC8表達，可減少乳腺癌干細胞數(shù)量和抑制乳腺癌細胞增殖，而下調(diào)其表達，則增加干細胞的自我更新，阻止維甲酸誘導的分化，促進乳腺腫瘤發(fā)生。此外，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)肝癌Hep G2細胞中HOXC8的表達，可延緩G1-S相變，抑制肝癌細胞增殖，并降低其對奧沙利鉑的抗性，表明HOXC8的表達可能影響了肝癌對奧沙利鉑的化療敏感性［18]。上述研究表明HOXC8可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而其作用機制復雜。

本研究采用免疫組化法檢測HOXC8在49例肝門部膽管癌組織中的表達，結果顯示HOXC8在腫瘤組織的陽性表達率高于癌旁正常組織，且HOXC8表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，進一步單因素生存分析顯示，HOXC8陽性表達患者的中位OS及中位TTP均明顯較陰性患者差，多因素分析顯示HOXC8是肝門部膽管癌患者的獨立預后因子。上述結果表明，隨著腫瘤進展，HOXC8表達逐步上調(diào)，且HOXC8高表達患者預后較差，提示HOXC8可能作為促癌基因參與肝門部膽管癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體調(diào)控機制仍需深入研究。XU等［18]在肝細胞癌研究中亦發(fā)現(xiàn)HOXC8表達上調(diào)，且與組織學分級呈正相關，與本研究結果一致。

綜上所述，HOXC8高表達與肝門部膽管癌的轉(zhuǎn)移和預后差密切相關，有可能成為肝門部膽管癌的預后標志物和潛在治療靶點。但本研究樣本量較少，今后需進一步擴大樣本量深入研究，明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用及調(diào)控機制。