基于cSMART技術(shù)檢測ctDNA驅(qū)動基因突變指導非小細胞肺癌精準治療的療效研究

李芳穎 鄂穎 井明晰 徐君南 孫濤

肺癌是我國發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤［1]。得益于精準診治和個體化治療，肺癌患者總體生存近幾年得到顯著改善。肺癌靶向治療實際遵循的原理是在肺癌人群中篩選有表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變的患者，使用 EGFR酪氨酸激活抑制劑（TKI）靶向藥物治療，但EGFR單基因檢測并不適用于指導所有的靶向藥物，可能導致患者因檢測不充分而喪失靶向治療的機會?；驒z測和二代測序的推廣和普及，可預測接受靶向治療或者免疫治療患者的敏感性，從而調(diào)整治療方案［2]。腫瘤組織活檢是腫瘤基因分型的金標準，但在實際臨床診療中，組織活檢往往難以獲得具有代表性的標本?；诃h(huán)化單分子擴增和重測序技術(shù)（cSMART）技術(shù)的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）基因突變檢測，僅需抽取10 mL靜脈血即可檢測，安全、簡便、無創(chuàng)傷，且可避免腫瘤異質(zhì)性導致的檢測結(jié)果偏差［3]。但目前有關(guān)該技術(shù)在臨床實際中應(yīng)用于指導靶向治療的報道尚較少見。本研究基于NSCLC患者cSMART技術(shù)檢測ctDNA基因突變，探討其驅(qū)動基因突變分布及其對靶向治療敏感性的影響，以期為今后的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年7月至2018年12月遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤收治的NSCLC患者107例。所有患者均經(jīng)組織病理學確診，年齡≥18歲，自愿行cSMART技術(shù)檢測，簽署知情同意書。107例患者中因血液樣本量采集不足而測序失敗1例，結(jié)果共檢測106例，其中男性79例，女性27例，中位年齡54歲，Ⅱ期2例，Ⅳ期104例，其中Ⅳ期患者中位治療線數(shù)為三線（一線～六線）。中位隨訪時間為14.0個月（范圍3～29個月）。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本收集及處理 于治療基線晨起空腹采集外周血液10 mL，靜脈穿刺取匹配的10 mL血液樣本，采集于 Streck 管中（Streck Inc，San Francisco，CA）。采用QIAamp循環(huán)核酸試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany）從2 mL純化血漿中制備cSMART檢測用DNA。QubitdsDNA HS檢測試劑盒（Life Technologies，Eugene，OR）檢測純化DNA的濃度。106例患者血漿樣本中，2 mL血漿中DNA的回收量為11.2～1 006.0 ng，中位值為40.6 ng。

1.2.2cSMART技術(shù)檢測血清中ctDNA基因突變 經(jīng)cSMART技術(shù)檢測患者血清中EGFR、ALK、KRAS、BRAF、PIK3CA、TP53、ROS1、RET、MET 共 9 種驅(qū)動基因的突變情況。上述DNA采用新型cSMART同步檢測和定量分析設(shè)計的熱點驅(qū)動突變。熱點驅(qū)動的突變變異體包括但不局限于以下常見位點：EGFR G719X（3個變異體，G719A/C/S）、外顯子 19缺失（16變異種）、外顯子20插入（3個變異體）、S768I、T790M、C797S、L858R 和 L861Q；KRAS中 G12A/C/D/R/S/V（6個變異體，G12X）、G13D、Q61E/H/K/L/P/R（6個變異體，Q61X）、A146T/P/V（3 個變異體，A146X）；ERBB2外顯子20插入（5個變異體）；BRAF和ALK融合體中V600D/E/K/R（4個變異體，V600X）。在 EGFR、KRAS、ERBB2、BRAF、ALK基因外顯子序列中定位靶向引物的基礎(chǔ)上，設(shè)計cSMART檢測新突變。cSMART檢測是為檢測驅(qū)動血漿突變設(shè)計，即DNA文庫使用從2 mL血漿中提取的總片段DNA模板構(gòu)建。DNA分子末端修飾30個核苷酸，然后連接50個T'PCR引物。使用熱穩(wěn)定性校正Pfu DNA聚合酶，通過15個PCR周期生成文庫，測序錯誤率約為1/105核苷酸。DNA分子變性成單鏈后，用與PCR適配器互補的端序列合成的橋接寡核苷酸，以及Taq連接酶促進連接介導的循環(huán)。采用四堿基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)編碼設(shè)計橋接寡核苷酸，隨機而獨特地對文庫中的每個等離子體分子進行編碼。然后利用位于突變位點20～48 bp的引物對逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse PCR）擴增環(huán)化單鏈分子內(nèi)的熱點突變，以確保突變檢測的最大靈敏度和特異性。采用40對多重逆轉(zhuǎn)錄引物對9種驅(qū)動基因的熱點突變位點進行定位。逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)生的等位基因在MiSeq平臺（Illumina，San Diego，CA）上進行配對末端測序。相同起始和停止位置的重復或高階讀序列，通過其獨特的條形碼區(qū)分，并且僅計數(shù)一次以糾正PCR偏差。所有符合這些質(zhì)量控制標準的突變分子均被計數(shù)。

1.3 療效評價

治療方案包括吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼等針對EGFR TKI靶向治療34例，克唑替尼等針對ALK TKI靶向治療2例，化療23例，納武單抗針對PD-1的免疫治療1例，貝伐單抗抗血管生成靶向治療聯(lián)合化療14例，無后續(xù)治療4例。采用RECIST 1.1標準評估化療療效，分為完全緩解（CR）：治療后腫瘤病灶完全消失；部分緩解（PR）：腫瘤病灶大小縮小≥30%，且無新病灶出現(xiàn)；疾病穩(wěn)定（SD）：腫瘤病灶大小無明顯變化，包括腫瘤病灶大小縮小不到30%或增大不到20%；疾病進展（PD）：腫瘤病灶大小增大≥20%或出現(xiàn)新病灶。無疾病進展生存期（PFS）定義為自用藥至疾病進展或死亡的時間，總生存期（OS）定義為從用藥或基因檢測時至死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用頻數(shù)表示。Kaplan-Meier法分析生存率并繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基于cSMART技術(shù)檢測NSCLC患者ctDNA 9種基因的突變分布

106例NSCLC患者中基因突變78例（73.58%），無突變28例（26.42%）?；蛲蛔兊?8例患者中，單基因突變 27例（34.62%），雙基因突變 24例（30.77%），3基因突變11例（14.10%），4基因突變5例（6.41%），5基因突變5例（6.41%）。患者中位治療線數(shù)為三線（范圍為Ⅱ期手術(shù)術(shù)后無治療2例，Ⅳ期晚期治療線數(shù)范圍為一線～六線）。

2.2 基于cSMART技術(shù)檢測NSCLC患者ctDNA 9種基因突變頻數(shù)分布

106例NSCLC患者9種基無突變26人次，累計突變160人次，其中EGFR突變共計61人次，ALK突變共計11人次（包括ALK融合和點突變），TP53和KRAS突變分別為54人次和26人次，PIK3CA基因突變5人次，BRAF、MET和ERBB2發(fā)生基因突變各1人次。

2.3 基于cSMART技術(shù)檢測NSCLC EGFR和ALK基因的突變分布

EGFR突變共計61人次，進一步分析EGFR基因突變分布，發(fā)現(xiàn)其常見突變?yōu)?9外顯子缺失和L858R突變，分別占31%和25%。部分患者經(jīng)EGFR TKI治療后，T790M突變占17%，C797S突變占3%，T790M與C797S突變共存1人次。罕見突變G719X、S768I和L861Q突變占13%，所有突變均與其他罕見突變或常見突變（如19外顯子缺失或L858R突變等）合并存在。EGFR 20外顯子插入突變占8%，但無前端氨基酸 763_764插入（可能TKI敏感突變），存在V769_D770in-sASV、D770＞DH 和 N771＞NH 突變。R831H和L707W突變2人次。

ALK基因突變共計11人次，其中ALK融合6人次，ALK點突變5人次；無ALK融合與ALK點突變共存，存在EGFR或TP53等基因突變與ALK融合或ALK點突變共存,其中ALK融合包括EML4-ALK 3人次、VIT-ALK、CLIP1-ALK和KIF5B-ALK各1人次，ALK點突變包括S1206Y 3人次、G1269A和F1174L各1人次。

2.4 不同基因突變NSCLC患者的生存情況

106例NSCLC患者經(jīng)cSMART技術(shù)檢測ctDNA 9種基因突變后，生存信息完整共71例，中位隨訪時間為14.0個月（3.0～29.0個月）。無基因突變患者的中位PFS為6.0個月（1.5～15.0個月），單基因突變患者中位PFS為4.5個月（1.0～25.5個月），雙基因突變患者中位PFS為5.0個月（1.0～18.0個月），3基因突變患者中位PFS為9.5個月（2.0～29.5個月），4基因突變患者中位PFS為10.5個月（8.0～16.0個月），5基因突變患者的中位PFS為4.0個月（2.0～9.0個月），見圖1。

圖1 不同基因突變NSCLC患者的生存情況Fig.1 Survival prognosis of patients with different driven gene mutations of NSCLC

2.5 基于NCCN指南和9種基因檢測結(jié)果治療的療效

57例生存信息完整且完成后續(xù)治療的NSCLC患者，根據(jù)NSCLC NCCN指南和9種基因檢測結(jié)果選擇治療方案，其中按照指導方案治療的患者歸為規(guī)范治療組（n=39），未按照指導方案治療的患者歸為非規(guī)范治療組（n=18）。規(guī)范治療患者的中位PFS為10.0個月（95%CI：0.36～10.64個月），非規(guī)范治療組中位 PFS為 5.5個月（95%CI：7.46～12.54個月），規(guī)范治療組患者的PFS曲線與非規(guī)范治療組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.420，P=0.011）。見圖 2。

圖2 規(guī)范治療與非規(guī)范治療NSCLC患者的無疾病進展生存曲線Fig.2 Progression-free survival curves of standard or nonstandard treatment patients with NSCLC

2.6 NSCLC EGFR/ALK突變患者的療效

57例生存信息完整且完成后續(xù)治療的患者，選擇其中具有代表性的5例進一步解析。病例1初診為右肺上葉周圍性肺癌，伴縱膈淋巴結(jié)和鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，穿刺病理結(jié)果為腺上皮異型增生癌變，cSMART檢測結(jié)果為EGFR L858R突變合并L707W少見突變，應(yīng)用一代TKI吉非替尼治療，PFS為16個月，目前仍繼續(xù)吉非替尼靶向治療。

病例2初診肺部繼發(fā)性惡性腫瘤cT2N2M1 IV期，雙肺多發(fā)結(jié)節(jié)灶、左側(cè)胸腔積液，縱膈及左側(cè)腋窩淋巴結(jié)腫大，cSMART技術(shù)檢測9種基因結(jié)果顯示EGFR L861Q（豐度 0.02%，1/4 486）和 EML-ALK4融合（豐度0.09%，3/3 473），存在EGFR罕見突變L861Q和EML-ALK融合，且EML-ALK融合的突變豐度略高，可能作為驅(qū)動基因。另外EGFR罕見突變L861Q，易與S861I突變和G719X突變合并存在，阿法替尼對治療療效較好，尤其是對2個罕見突變并存或者單個罕見突變合并常見突變（19外顯子缺失或L858R突變）患者的療效更佳，而該患者僅L861Q單個EGFR突變，且2016年阿法替尼未獲批用于EGFR罕見突變。因此，推薦應(yīng)用針對ALK融合的第一代TKI克唑替尼，但患者自行決定應(yīng)用吉非替尼，2個月后疾病快速進展并死亡。

病例3為左肺腺癌（混合亞型，以乳頭狀腺癌為主，中低分化），左肺癌術(shù)后9年和骨轉(zhuǎn)移4年，五線治療時基線行基因檢測。病例4為肺癌合并骨轉(zhuǎn)移30個月，病理示腺癌局部伴黏液腺癌，于三線治療基線時行基因檢測。均是多線治療后基因檢測結(jié)果為EGFR敏感（19外顯子缺失和L858R突變）合并EGFR T790M耐藥突變，以及ALK點突變（S1206Y和G1269A）。病例3既往行化療（一線PFS為7個月、三線PFS為6個月，四線PFS為4個月）、放療和吉非替尼（二線PFS為4個月）治療，根據(jù)基因檢測結(jié)果應(yīng)用奧希替尼治療，療效達PR，PFS高達31.5個月，目前仍繼續(xù)奧希替尼治療。病例4根據(jù)基因檢測結(jié)果給予三線GP方案化療，PFS達6個月，OS為11個月。病例5為右肺腺癌，術(shù)后1年余合并骨轉(zhuǎn)移后，一線培美曲塞聯(lián)合卡鉑治療3周期后進展，EGFR單基因檢測顯示EGFR 19外顯子缺失，二線吉非替尼治療PFS為13個月。進展后基因檢測發(fā)現(xiàn)T90M突變，應(yīng)用奧希替尼治療PFS為9個月；再次進展后行cSMART動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果顯示EGFR 19外顯子缺失、T790M突變合并C797S突變，建議奧希替尼聯(lián)合吉非替尼兩個靶向治療，但患者拒絕后行貝伐珠單抗聯(lián)合TC方案治療，PFS為16個月，OS為22個月。

3 討論

腫瘤組織活檢即通過手術(shù)或穿刺獲取腫瘤最有代表性部位的組織作為檢測標本，是腫瘤基因分型的金標準，但由于腫瘤異質(zhì)性，腫瘤組織活檢難以獲得具有代表性的標本，對患者的治療指導價值有限［4]。目前，包括CEA在內(nèi)的腫瘤標志物尚不能評估晚期肺癌的治療療效，而影像學監(jiān)測腫瘤疾病進展至少需化療2～4個療程。因此，臨床上亟待探索NSCLC早期評估靶向或免疫治療療效的生物標志物，以精準指導后續(xù)治療方案。循環(huán)腫瘤細胞（CTC）、ctDNA、外泌體和腫瘤血小板作為液體活檢重要的組成部分，在臨床應(yīng)用越來越廣泛，已成為組織活檢的有效補充，有助于NSCLC的精準診斷和治療［5-6]。

ctDNA是由腫瘤細胞釋放到血漿中的單鏈或雙鏈DNA片段，大小為160～180 bp，攜帶與腫瘤組織一致的分子遺傳信息。腫瘤組織活檢為侵入性，且耗時費力，因此基于ctDNA的液體活檢成為一種替代或互補的方法［7]?；赾SMART技術(shù)的昂科益非小細胞肺癌基因突變檢測，僅需抽取患者10 mL靜脈血液即可進行基因檢測，安全、簡便、無創(chuàng)傷，且可避免腫瘤異質(zhì)性導致的檢測結(jié)果偏差。采用和瑞自主研發(fā)的DNA富集檢測技術(shù)cSMART，檢測靈敏度達3/10 000，平均測序深度達40000x，可絕對定量檢測患者攜帶的多個藥物相關(guān)基因突變，指導靶向用藥，保證用藥的準確性和有效性［4，8]。PéCUCHET 等［7]利用高通量測序技術(shù)進行ctDNA檢測，發(fā)現(xiàn)其可有效評估晚期NSCLC患者預后。本研究基于cSMART技術(shù)檢測106例NSCLC 患者血清中 EGFR、ALK、KRAS、BRAF、PIK3CA、TP53、ROS1、RET、MET共9種驅(qū)動基因的突變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因突變78例，無突變28例，值得注意的是，無突變28例中包括2例術(shù)后輔助治療患者，且隨著分期ctDNA量有所差異，靶向治療如奧希替尼有效治療后ctDNA含量亦下降，提示液體活檢ctDNA測定基因突變在術(shù)后輔助和靶向治療有效后易發(fā)生基因突變陰性，因此應(yīng)在治療基線行液體活檢基因突變檢測。驅(qū)動基因突變的78例患者中，單基因突變27例，雙基因突變24例，3基因突變11例，4基因突變5例，5基因突變5例。106例NSCLC患者累計突變186人次，其中EGFR突變最多，共計61人次，其分布較我國常見報道略低［9]，而ALK突變共計11人次，高于我國常見ALK突變發(fā)生率，造成這些差異可能與本研究統(tǒng)計EGFR、ALK人次而非例數(shù)有關(guān)。此外，TP53和KRAS突變各占28%和13%，罕見突變PIK3CA、BRAF、MET和 ERBB2發(fā)生基因突變各占3%、1%、1%和1%。后續(xù)隨訪中，57例患者生存信息完整且完成后續(xù)治療，根據(jù)NSCLC NCCN指南和ctDNA檢測結(jié)果指導患者治療方案，結(jié)果發(fā)現(xiàn)按照指導方案規(guī)范治療的患者中位PFS明顯較非規(guī)范治療患者長，提示檢測ctDNA識別驅(qū)動突變，對實現(xiàn)NSCLC精準治療具有重要的臨床應(yīng)用價值，與多項研究［9-10]結(jié)果一致。

本研究進一步解析5例具有代表性患者的基因突變與治療的療效，其中病例1提示EGFR L858R突變合并L707W少見突變應(yīng)用一代EGFR TKI療效較好。病例2針對驅(qū)動基因突變?yōu)镋GFR罕見突變L861Q和EML-ALK融合，且EML-ALK融合的突變豐度略高，選擇針對ALK融合的第二代TKI布加替尼（針對ALK和EGFR兩個靶點）療效更佳。此外，不同ALK TKI抑制劑除了ALK融合靶點外，附加的靶點有所不同（克唑替尼：ROS1；阿萊替尼：RET和LTK；布加替尼：EGFR突變和ROS1；色瑞替尼：IGFR1、IR 和 ROS1；Enterctinib：NTRKs和 ROS1；勞拉替尼：ROS1和ALK點突變G1202R），提示初診基因突變檢測結(jié)果為多個驅(qū)動基因合并，需要考量突變豐度以及靶向治療的靶點。病例3和病例4均為多線治療后基因檢測結(jié)果為EGFR敏感（19外顯子缺失和L858R突變）合并EGFR T790M耐藥突變，以及ALK點突變（S1206Y和G1269A），值得思考的是，T790M突變?yōu)槌Ｒ姷哪退幫蛔儯瑧?yīng)用三代TKI奧希替尼療效較好。另外C797S作為T790M應(yīng)用奧希替尼的耐藥突變，可考慮奧希替尼聯(lián)合一代TKI或嘗試貝伐珠單抗聯(lián)合化療等。

綜上所述，基于cSMART技術(shù)測定ctDNA識別NSCLC的基因突變具有簡便、無創(chuàng)和動態(tài)監(jiān)測的優(yōu)勢，其中EGFR及ALK為NSCLC患者常見驅(qū)動基因突變，針對其靶向治療療效較好，在臨床上具有促進NSCLC精準治療的價值。期待基于cSMART技術(shù)測定ctDNA的基因突變助力NSCLC的精準治療，改善患者的生存和生活質(zhì)量。