ACCα在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞生長的影響

梁寧 王謙 黃倩 李仁志 楊濤 楊懿 黃小軍 何顯力

肝癌是我國發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，其中70%～90%的原發(fā)性肝癌是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1]。目前盡管診療技術(shù)不斷發(fā)展，但HCC患者的5年生存率仍未得到明顯改善［2]，發(fā)病機(jī)制亦未清楚。HANAHAN等［3]詳細(xì)闡述了腫瘤的十大特征，其中之一便是代謝重編程。而在腫瘤細(xì)胞中明顯的代謝特征是脂肪酸從頭合成增加［4]。乙酰輔酶 A 羧化酶 α（acetyl CoA carboxylase alpha，ACCα）是調(diào)控脂肪酸合成的限速酶，也是催化脂肪酸合成的第一步反應(yīng)，可用于乙酰輔酶A的ATP依賴性羧化作用而生成丙二酰輔酶A［5]，在脂肪酸代謝中具有重要作用。本研究通過qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACCα在HCC組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)，同時(shí)采用siRNA下調(diào)HCC細(xì)胞中ACCα的表達(dá)水平，觀察ACCα表達(dá)改變對(duì)HCC細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡能力的影響，為HCC治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人 HCC 細(xì)胞株 SNU-739、SNU-368、HLE、HLF 購自南京科佰生物公司，人HCC細(xì)胞株SNU-878、BEL-7402、MHCC-97L購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清購自BBI Life Sciences公司，青鏈霉素混合液購自中國索萊寶公司，RPMI 1640培養(yǎng)基及DMEM高糖培養(yǎng)基購自中國瑞博公司，Lipofectamine 2000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen公司，Opti-MEM購自美國Gibco公司，BCA蛋白定量試劑盒購自中國Beyotime公司，大分子量蛋白Marker購自美國Thermo Fisher公司，Total RNA Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Kit購自美國Takara公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自中國貝博公司，MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司，β-actin抗體購自北京天德悅公司，ACCα抗體購自美國Abcam公司。

1.2 組織樣本

收集2015年12月至2018年6月于空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院行根治性手術(shù)的30例HCC患者癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本。標(biāo)本由空軍軍醫(yī)大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心組織樣本庫于-80℃冰箱保存。所有患者臨床信息完整、術(shù)前未接受放療或化療等輔助治療、組織質(zhì)量高、病理分型均為HCC，其中男性22例，女性8例，平均年齡61歲。本研究通過空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書并備案。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

人 HCC 細(xì)胞 SNU-739、SNU-368、SNU-878、BEL-7402用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，人HCC細(xì)胞HLE、HLF、MHCC-97L用加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。消化處于對(duì)數(shù)期的SNU-368細(xì)胞，以3×104個(gè)/孔接種于6孔板，至細(xì)胞融合達(dá)75%～85%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將6孔板內(nèi)培養(yǎng)液更換為Opti-MEM培養(yǎng)基（1.5 mL/孔），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱20 min。計(jì)算需轉(zhuǎn)染孔數(shù)量，每孔需8 μL 20 μmol/L siRNA 和 8 μL Lipofectamine 2000 并分別加入250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，將以上2種液體混勻，靜置20 min，取液體500 μL/孔，加入 6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后棄去轉(zhuǎn)染液，更換新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后消化細(xì)胞并收集，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)HCC組織及癌旁正常組織中ACCα mRNA的表達(dá)

根據(jù)Total RNA Kit說明書提取30例HCC患者癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織樣本總RNA，用蛋白定量儀測(cè)定OD值，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將已測(cè)完濃度的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR熒光染料法反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)ACCα mRNA的表達(dá)，GADPH作為內(nèi)參。GADPH上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物：3'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5'；ACCα 上游引物：5'-AGGAAGATGGTGTCCGCTCTG-3'，下游引物：3'-GGGGAGATGTGCTGGGTCAT-5'。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 3 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct計(jì)算ACCα mRNA表達(dá)量，每個(gè)樣本至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot檢測(cè)HCC組織及癌旁正常組織中ACCα蛋白的表達(dá)

提取30例HCC癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織樣本總蛋白做ACCα癌-癌旁表達(dá)前期驗(yàn)證，消化收集7 種 HCC 細(xì)胞（SNU-739、SNU-368、HLE、HLF、SNU-878、BEL-7402、MHCC-97L）并提取總蛋白篩選后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，消化收集轉(zhuǎn)染ACCα siRNA及陰性對(duì)照的SNU-368細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行ACCα轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每孔蛋白上樣量40 μg，以80 V恒壓電泳約80 min，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%TBST脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶3 000稀釋比例 ACCα、β-actin一抗4℃冰箱孵育過夜；于室溫孵育二抗2 h，ECL顯影。采用ImageJ軟件對(duì)Western blot條帶進(jìn)行灰度分析，蛋白表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參蛋白的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTS法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HCC SNU-368細(xì)胞的增殖能力

分別消化收集轉(zhuǎn)染48 h的SNU368-siCtrl、SNU368-siACCα-1及SNU368-siACCα-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×103個(gè)/100 μL，加入96孔板，分別種8個(gè)復(fù)孔，周圍加同樣體積的完全培養(yǎng)基，相同方法準(zhǔn)備5板待測(cè)樣板，細(xì)胞貼壁后加入20 μL/孔MTS工作液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1 h。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長處檢測(cè)各孔的吸光度（OD）值，記錄數(shù)據(jù)記為 0 h，同樣方法分別于 24 h、48 h、72 h、96 h檢測(cè)剩余4板樣品孔OD值并記錄，繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞活力計(jì)算：將各測(cè)試孔的OD值減去調(diào)零孔OD值，重復(fù)孔的OD值取平均數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HCC SNU-368細(xì)胞周期的分布情況

分別消化收集轉(zhuǎn)染48 h的SNU368-siCtrl、SNU368-siACCα-1及SNU368-siACCα-2細(xì)胞，1×PBS洗滌2次，移入1.5 mL EP管，棄上清液，分別加入75%冰乙醇吹打混勻，于4℃冰箱固定1 h，4℃預(yù)冷1×PBS洗滌，棄上清液。用400 μL 1×PBS重懸細(xì)胞，分別加入Rnase A 溶液 20 μL 37 ℃水浴 30 min，加入 400 μL PI染液，送流式細(xì)胞儀于488 nm激發(fā)波長處進(jìn)行分析。細(xì)胞周期分布百分比由Flowjo軟件分析。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HCC SNU-368細(xì)胞凋亡情況

無EDTA胰酶分別消化收集轉(zhuǎn)染48 h的SNU368-siCtrl、SNU368-siACCα-1 及 SNU368-siACCα-2 細(xì)胞，1×PBS洗滌2次，移入1.5 mL EP管，棄去上清液，分別加入 400 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入 5 μL Annexin V-FITC，輕搖混勻后于4℃冰箱孵育15 min，最后加入10 μL PI混勻后于4℃冰箱避光孵育5 min，立即送流式細(xì)胞儀于488 nm激發(fā)波長處進(jìn)行分析。凋亡細(xì)胞百分比=早期凋亡百分比（B4象限）+晚期凋亡百分比（B2象限）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。單因素方差分析比較各組細(xì)胞增殖率、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡率的差異，若整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析HCC組織和癌旁正常組織ACCα表達(dá)的差異。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織中ACCα蛋白和mRNA的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與相應(yīng)癌旁正常組織相比，HCC組織中ACCα蛋白表達(dá)水平明顯升高，其中ACCα蛋白高表達(dá)24例，表達(dá)無差異3例，低表達(dá)3例，見圖1A。HCC組織和癌旁正常組織ACCα蛋白表達(dá)量分別為3.26±0.81和1.88±0.64，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021）。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HCC和癌旁正常組織中ACCα mRNA表達(dá)量分別為3.41±0.71和 1.74±0.54，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019），見圖1B。

圖1 肝細(xì)胞癌組織及其癌旁正常組織中ACCα的表達(dá)情況Fig.1 Expressionof ACCα inHCC tissuesandadjacent normal tissues

2.2 不同HCC細(xì)胞中ACCα蛋白的表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，HCC SNU-739、SNU-368、HLE、HLF、SNU-878、BEL-7402 和 MHCC-97L 細(xì)胞中 ACCα 蛋白的表達(dá)量分別為 0.90±0.03、0.09±0.05、0.87±0.07、0.21±0.03、0.15±0.04、0.39±0.06 和 0.43±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.640，P＜0.001），其中SNU-368細(xì)胞中ACCα的蛋白表達(dá)水平最高，見圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)不同HCC細(xì)胞中ACCα蛋白的表達(dá)情況Fig.2 Expression of ACCα in different HCC cell lines detected by Western blot

2.3 轉(zhuǎn)染后HCC SNU-368細(xì)胞中ACCα蛋白的表達(dá)水平

本研究設(shè)計(jì)合成2條ACCα干涉片段siRNA，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA方法對(duì)HCC SNU-368細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，48 h后收集細(xì)胞，Western blot驗(yàn)證瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的干涉效果，結(jié)果顯示SNU368-siCtrl組、SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組蛋白表達(dá)量分別為 0.94±0.05、0.28±0.08 和 0.19±0.09，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=63.680，P=0.015），其中 SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組分別與SNU368-siCtrl組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示干涉ACCα的HCC細(xì)胞系構(gòu)建成功，見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HCC SNU-368細(xì)胞中ACCα蛋白的表達(dá)水平Fig.3 Expression of ACCα in HCC SNU-368 cells after transfection detected by Western blot

2.4 下調(diào)ACCα后HCC SNU-368細(xì)胞的增殖能力

MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，SNU368-siCtrl組、SNU368-siACCα-1組和 SNU368-siACCα-2處理 96 h的 OD 值分別為（0.84±0.08）%、（0.49±0.06）%和（0.53±0.06）%，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.140，P=0.001），其中 SNU368-siACCα-1 組和 SNU368-siACCα-2組分別與SNU368-siCtrl組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4A。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，G1期SNU368-siCtrl組、SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組細(xì)胞占比分別為（55.78±0.50）%、（65.38±0.58）%和（63.30±0.44）%，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=298.313，P＜0.01），且SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組分別與SNU368-siCtrl組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004，0.004）。S 期 SNU368-siCtrl組、SNU368-ACCα-1組和SNU368-siACCα-2組細(xì)胞占比分別為（26.24±1.04）%、（18.91±0.36）%和（19.96±0.55）%，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=93.570，P＜0.01），SNU368-siACCα-1組和 SNU368-siACCα-2組分別與SNU368-siCtrl組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004，0.017）。G2/M 期 SNU368-siCtrl組、SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組細(xì)胞占比分別為（17.98±1.39）%、（15.70±0.22）%和（16.74±0.15）%，3 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.831，P=0.390），說明與SNU368-siCtrl相比，SNU368-siACCα-1 及 SNU368-siACCα-2轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞占比明顯增加，S期細(xì)胞占比降低，見圖4B。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，SNU368-siCtrl組、SNU368-siACCα-1 組和 SNU368-siACCα-2組的細(xì)胞凋亡率分別為（6.57±1.19）%、（19.47±1.14）%和（16.73±0.91）%，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=117.500，P=0.005），其中 SNU368-siACCα-1組和SNU368-siACCα-2組分別與SNU368-siCtrl組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，0.003），提示與SNU368-siCtrl相比，SNU368-ACCα-1 及 SNU368-si2轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞總凋亡率明顯增加，且以早期凋亡為主，見圖4C。

圖4 下調(diào)ACCα對(duì)HCC SNU-368細(xì)胞生長的影響Fi g.4 Effects on HCC SNU-368 cells proliferation after downregulation of Accα

3 討論

近年來ACCα在腫瘤中的作用受到了廣泛關(guān)注，多項(xiàng)研究表明ACCα在多種腫瘤組織中表達(dá)升高。RIOS GARCIA等［6]研究發(fā)現(xiàn)ACCα在乳腺癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)。在前列腺癌中亦發(fā)現(xiàn)ACCα表達(dá)升高，且干涉ACCα后前列腺癌細(xì)胞的脂酸合成被顯著抑制，同時(shí)腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯和凋亡［7-8]。有研究報(bào)道ACCα可促進(jìn)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖，并抑制細(xì)胞凋亡［9]。在非小細(xì)胞肺癌組織中ACCα表達(dá)同樣升高，而使用ACCα靶向抑制劑ND-646可使腫瘤生長速度變緩，小鼠生存期延長［10]。此外，基因多態(tài)性研究證實(shí)ACCα基因調(diào)控區(qū)PⅢ的多態(tài)性可影響ACCα表達(dá)，且增加了乳腺癌和卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［11]。本課題組前期的流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)ACCα不同基因型可顯著影響肺癌術(shù)后患者的預(yù)后［12]。本研究采用 Western blot和qRT-PCR檢測(cè)30例HCC患者癌組織及其癌旁正常組織中ACCα的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在HCC組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，提示ACCα在HCC組織中高表達(dá)并可能促進(jìn)其惡性進(jìn)展。

細(xì)胞增殖是生命的基本特征，個(gè)體發(fā)育、組織修復(fù)以及種群繁衍都與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，細(xì)胞增殖受多種機(jī)制調(diào)控。腫瘤細(xì)胞最重要的特征是具備無限增殖的能力，即具有“永生化”特征。為驗(yàn)證ACCα對(duì)HCC細(xì)胞生長是否發(fā)揮調(diào)控作用，本研究選取ACCα蛋白表達(dá)水平較高的HCC SNU-368細(xì)胞，進(jìn)一步在體外細(xì)胞水平分析其對(duì)HCC細(xì)胞生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACCα具有顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖的作用，然而目前ACCα促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖的機(jī)制尚未完全闡明。LALLY等［13]發(fā)現(xiàn)ACCα可通過增加脂肪酸的從頭合成促進(jìn)HCC進(jìn)展，而使用ACCα特異性抑制劑ND-654則可抑制HCC發(fā)生。脂肪酸合成對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義，ACCα作為脂肪酸合成的限速酶，可將乙酰輔酶A羧化成丙二酰輔酶A，進(jìn)而參與長鏈脂肪酸的合成［5]。腫瘤細(xì)胞通過合成大量脂肪酸，為其快速分裂增殖提供了充足的脂類大分子物質(zhì)［14]。此外，脂肪酸的多種衍生物，如溶血磷脂酸、人前列腺素E2、磷脂酸等在調(diào)控細(xì)胞生存、增殖和轉(zhuǎn)移等亦發(fā)揮重要作用［4]。CHAKRABORTY 等［15]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)ACCα可抑制脂酸合成，并促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞凋亡。ZHAN等［16]研究報(bào)道ACCα通過促進(jìn)細(xì)胞膜磷脂合成而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。有研究者還報(bào)道ACCα可促進(jìn)肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A在線粒體中的定位，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸氧化，維持腫瘤細(xì)胞在能量應(yīng)激下生存［17]。由此可見，ACCα通過促進(jìn)脂肪酸的從頭合成可能是其促進(jìn)HCC發(fā)展的重要機(jī)制之一。

細(xì)胞周期失控也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖的重要原因。細(xì)胞周期受體內(nèi)外多種因素的共同作用，其中周期蛋白依賴性CDK激酶是細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子。此外各種檢查點(diǎn)也可影響細(xì)胞周期進(jìn)程，如限制點(diǎn)（R點(diǎn)）可調(diào)控細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變。任何理化因素或生物因素均可影響R點(diǎn)的功能，進(jìn)而改變細(xì)胞周期，從而加速腫瘤細(xì)胞的增殖［18]。本研究結(jié)果顯示，干涉ACCα表達(dá)后HCC SNU-368細(xì)胞的生長速度明顯變慢，細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，S期細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞早期凋亡比例顯著上升。SVENSSON等［10]同樣發(fā)現(xiàn)干涉肺癌細(xì)胞ACCα的表達(dá)后，細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯減少，與本研究結(jié)論一致。然而ACCα具體通過何種機(jī)制影響細(xì)胞周期目前尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞SNU-368中ACCα表達(dá)顯著上調(diào)，可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程并抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖，ACCα有望作為HCC治療的潛在靶點(diǎn)。