白千層精油的化學(xué)成分與抑菌活性研究

向亞林 余細(xì)紅 趙曉峰 張茂新

摘? 要? 為研究白千層精油的化學(xué)成分及其對(duì)植物病原真菌的抑菌活性，為環(huán)境友好型農(nóng)藥的研發(fā)及白千層的綜合應(yīng)用提供理論依據(jù)。本文采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析了白千層精油的化學(xué)成分，并用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了白千層精油對(duì)4種植物病原真菌的抑菌活性。從白千層精油中分離鑒定出74種化學(xué)成分，占總含量的97.28%，其主要化學(xué)成分是左旋-α-蒎烯（2.07%）、β-月桂烯（1.05%）、1，8-桉葉素（67.29%）、萜品烯（2.52%）、芳樟醇（2.36%）、α-松油醇（7.93%）和（+）-g-桉葉油醇（1.26%）等。進(jìn)一步研究表明，白千層精油在5.0～10.0 ?L/mL濃度范圍對(duì)立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)抑制率為100%;處理2 d時(shí)，白千層精油在2.5～10.0 ?L/mL濃度下對(duì)小孢擬盤(pán)多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)71.59%以上，其抑菌作用均隨著處理濃度的增加而增強(qiáng)，隨著白千層精油處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)3種植物病原菌表現(xiàn)出較好的持效性。白千層精油對(duì)立枯絲核菌、小孢擬盤(pán)多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，在農(nóng)用抗菌劑應(yīng)用中有較好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞? 白千層;精油;化學(xué)成分;植物病原真菌;抑菌活性

中圖分類(lèi)號(hào)? S793.931? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

白千層（Melaleuca leucadendron Linn.），屬桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬（Melaleuca）植物，原產(chǎn)于澳大利亞新南威爾士北海岸[1]，目前我國(guó)廣西、廣東、福建、海南等地均有較大規(guī)模的引種栽培。文獻(xiàn)資料顯示，白千層屬植物次生化合物具有多種生物活性。臧文霞等[2]發(fā)現(xiàn)白千層的石油醚萃取物對(duì)胃癌細(xì)胞、人肺腺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的體外增殖較好的抑制作用;李燕婧等[3]報(bào)道互葉白千層（Melaleuca alternifolia Linn.）醇提物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗過(guò)敏等藥理作用，且毒性小?，F(xiàn)在廣為使用的為白千層屬植物精油（常稱(chēng)茶樹(shù)油），其屬天然油脂，具有消毒、殺菌抑菌、抗病毒、防霉、消炎止痛、化痰止咳等多種活性，可以高效、無(wú)毒、無(wú)刺激地殺死多種真菌和細(xì)菌，對(duì)某些病毒也有抑制作用，廣泛應(yīng)用于藥品、日用衛(wèi)生制品、皮膚保健品、化妝品、食品香料等諸多領(lǐng)域[4-14]。

在防治植物病害的過(guò)程中，長(zhǎng)期大量的使用化學(xué)合成農(nóng)藥會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染、農(nóng)殘超標(biāo)，生態(tài)平衡受損、生物多樣性下降等一系列的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題，因此篩選開(kāi)發(fā)與環(huán)境友好的植物源農(nóng)藥是必然趨勢(shì)。不少的研究報(bào)道證實(shí)植物精油對(duì)農(nóng)業(yè)植物病原真菌有抑菌抗菌作用[15-20]，植物精油可以作為新一代植物源農(nóng)藥開(kāi)發(fā)研究的方向。目前白千層屬植物精油對(duì)細(xì)菌的作用研究較多，互葉白千層精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌以及白色念珠菌等具有較強(qiáng)的抗菌活性[21-25]。本文旨在研究白千層精油的化學(xué)成分及其對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani K?hn）、小孢擬盤(pán)多毛孢菌[Pestalotiopsis microspora （（Y2-4））]、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzac Cavgra）和香蕉枯萎病菌[Fusarium oxysporum f. sp. cubense（ （E. F. Smith）） Snyder et Hansen]等4種植物病原真菌的抑制作用，以期為白千層屬植物精油的綜合開(kāi)發(fā)利用和綠色生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

白千層原液精油：原料源自越南，由英國(guó)雪莉派思香薰有限公司（The UK sShirley pPrice aAromatherapy Ltd.）生產(chǎn)。

供試菌種：立枯絲核菌，由廣東省微生物菌種保藏中心提供;小孢擬盤(pán)多毛孢菌，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣州實(shí)驗(yàn)站鄭麗博士提供;水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院植物病理室李敏慧博士提供。供試病菌用PDA培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)）培養(yǎng)備用。

儀器與設(shè)備：Agilent 7890B-5977A氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司;LRH-250A生化培養(yǎng)箱，上海常思工貿(mào)有限公司;DGX-9143BC-1電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司;YXQ- LS-50SII立式高壓滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;FA2004電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;SW-CL-2FD凈化工作臺(tái)，上海譜振生物科技有限公司等。

1.2? 方法

1.2.1? 白千層精油化學(xué)成分分析? 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對(duì)白千層精油進(jìn)行化學(xué)成分分析，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測(cè)試中心完成。樣品的處理：取1 μL揮發(fā)油，用無(wú)水乙醚稀釋成1 mL溶液，采用GC-MS對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行分析。GC條件：石英毛細(xì)管柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）程序升溫，起始溫度為40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫速率，升溫到260 ℃，然后保持至完成分析，載氣為He（99.99%），柱流量 1. 0 mL/min，壓力28.8 kPa，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流。MS條件：EI源，電子能量為70 eV，接口溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃，采集質(zhì)量范圍35～-500 amu。樣品經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜分析，各分離組分采用NIST14譜庫(kù)檢索（匹配度大于90%），并結(jié)合人工解析和參考文獻(xiàn)加以確認(rèn)其化學(xué)成分。相對(duì)含量采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算。

1.2.2? 白千層精油抑菌活性測(cè)定方法? 用瓊脂稀釋法結(jié)合菌絲生長(zhǎng)速率法[26]，測(cè)定白千層精油對(duì)供試病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。用移液槍準(zhǔn)確吸取適量精油與0.1%吐溫--80無(wú)菌水溶液混合，充分乳化后加入到10 mL已冷卻至50 ℃的PDA培養(yǎng)基中，配制得到2.5、5.0、7.5、10.0 ?L/ml 4個(gè)濃度處理，反復(fù)振蕩搖勻后小心倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，制備不同濃度的PDA培養(yǎng)平板。以?xún)H加入0.1%吐溫--80無(wú)菌水溶液的PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照處理。取在PDA平板上預(yù)先培養(yǎng)的供試病原菌，從菌落邊緣用直徑8 mm的無(wú)菌打孔器切取菌餅，并將其移植到上述不同體積分?jǐn)?shù)的精油平

板和空白對(duì)照中央。每個(gè)處理3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 d。從第2 d開(kāi)始，用相交垂直線法每2 d測(cè)量一次供試菌菌落的直徑，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。按下列公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

參照馬萱等[27]方法，通過(guò)抑制率的大小判定白千層精油對(duì)各菌落的抑菌活性等級(jí)：相對(duì)抑制率達(dá)70%以上為較強(qiáng)抑制;相對(duì)抑制率達(dá)40%～ 70%為中等強(qiáng)度抑制;相對(duì)抑制率達(dá)40%以下為較弱抑制。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理，SAS軟件統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)（DMRT，p<0.05）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 白千層精油化學(xué)成分GC-MS分析

通過(guò)GC-MS分析白千層精油的化學(xué)成分，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)對(duì)比和檢索圖譜分析，鑒定出74種化學(xué)成分，并計(jì)算出各成分的相對(duì)含量，鑒定出匹配度90%以上的化合物含量占總揮發(fā)油成分的97.28%。測(cè)得的化學(xué)成分涵蓋了烯、醇、酮類(lèi)。由表1可知，白千層精油中較大峰的保留時(shí)間分別在7.427、9.104、10.616、11.153、12.372、15.079和26.195 min，其化學(xué)成分分別是左旋-α-蒎烯（2.07%）、β-月桂烯（1.05%）、1，8-桉葉素（67.29%）、萜品烯（2.52%）、芳樟醇（2.36%）、?α-松油醇（7.93%）和（+）-g-桉葉油醇（1.26%），這7種化合物總含量占到總揮發(fā)油成分的84.48%。

2.2? 白千層精油對(duì)4種植物病原真菌的抑菌活性

從圖1和表2可以看出，白千層精油處理對(duì)小孢擬盤(pán)多毛孢菌、立枯絲核菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。從圖1可以看出，處理6 d，對(duì)照處理的小孢擬盤(pán)多毛孢菌、立枯絲核菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌菌絲體幾乎長(zhǎng)滿了整個(gè)培養(yǎng)皿（（圖1中A0、B0、C0、D0）圖1中A0、B0、C0、D0），而白千層精油各濃度處理的4種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)均明顯小于對(duì)照（（圖1中A1～A4、B1～B4、C1～C4、D1～D4）圖1中A1～A4、B1～B4、C1～C4、D1～D4）。

從表2可以看出，白千層精油對(duì)立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)具有更強(qiáng)的抑菌活性。白千層精油處理2 d，在2.5～10.0 ?L/mL濃度處理的菌絲生長(zhǎng)抑制率均達(dá)到100%。在2.5～5.0 ?L/mL時(shí)，白千層精油除了2.5 ?L/mL濃度處理的菌絲生長(zhǎng)抑制率降為85.87%外，其他濃度處理對(duì)立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率均為100%，表現(xiàn)出很好的抑菌持效性。

處理2 d時(shí)，白千層精油在2.5～10.0 ?L/mL濃度下對(duì)小孢擬盤(pán)多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)71.59%以上，其抑菌作用均隨著處理濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的濃度效應(yīng)。隨著白千層精油處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)3種植物病原菌仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。處理4～6 d時(shí)，白千層精油除了2.5 ?L/mL濃度處理外，其余各濃度處理的菌絲生長(zhǎng)抑制率均在70.82%以上，表現(xiàn)出對(duì)小孢擬盤(pán)多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌等3種植物病原菌較好的抑菌持效性。

從表2可以看出，白千層精油處理2 d時(shí)，2.5 ?L/mL下4種病原真菌間的抑菌作用差異顯著，對(duì)立枯絲核菌的抑制率達(dá)100%;5.0 ?L/mL下立枯絲核菌與另外3種病原真菌間的差異顯著;7.5 ?L/mL、10.0 ?L/mL對(duì)4種病原真菌表現(xiàn)出完全抑制效果。處理4 d和6 d時(shí)，仍以對(duì)立枯絲核菌的抑制效果最佳，不同病原真菌間的抑制效果存在不同差異。

3? 討論

本文研究采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用（GC-MS）手段分離鑒定出白千層精油含有74種化學(xué)成分，占總揮發(fā)油量的97.28%，其主要化學(xué)成分是1， 8-桉葉素（（67.29%））、α-松油醇（（7.93%））、萜品烯（（2.52%））、芳樟醇（（2.36%））、左旋-α-蒎烯（（2.07%））、（+）-g-桉葉油醇（（1.26%））和β-月桂烯（（1.05%））等。本文白千層精油檢出的成分及其含量與文獻(xiàn)存在一定差異，劉布鳴等[28]從白千層揮發(fā)油中檢出確認(rèn)了35種成分，其主要化學(xué)成分為松油醇-4（（33.58%））、α-松油烯（（10.12%））、1， 8-桉葉素（（6.08%））、γ-松油烯（（18.05%））、β-月桂烯（（1.05%））等;董曉敏等[29]從廣西產(chǎn)白千層的揮發(fā)性成分中確認(rèn)了47種成分，主要化學(xué)成分包括1， 8-桉葉素（（40.64%））、α-蒎烯（（14.74%））、α-松油醇（（8.71%））、愈創(chuàng)木醇（（4.30%））、石竹烯（（3.63%））、喇叭茶醇（（2.14%））、石竹烯氧化物（（1.92%））、β-蒎烯（（1.69%））等;?？诋a(chǎn)的白千層枝和葉的揮發(fā)油主要成分和含量也存在差異，白千層枝的揮發(fā)油中以芳樟醇（（3.79%））、桉葉油醇（（2.31%））、β-松油醇（（2.22%））、α-杜松醇（（2.19%））、β-蒎烯（（2.13%））、α-松油醇（（1.78%））、α-蒎烯（（1.04%））、松油醇-4（（1.02%））、綠花白千層醇（（1.01%））等為主，而白千層葉揮發(fā)油主要成分為松油醇-4（（27.43%））、1， 8-桉葉素（（19.37%））、α-松油醇（（8.27%））、石竹烯（（3.79%））、β-蒎烯）（1.39%））、α-蒎烯（（1.24%））等[30]。這些差異的存在可能與白千層產(chǎn)地環(huán)境、栽培時(shí)間、采集時(shí)間、采集部位、測(cè)定條件等有一定關(guān)系。本精油中1， 8-桉葉素的相對(duì)含量高達(dá)67.29%，而松油醇-4（（即4-萜品醇））只有0.78%，故屬于桉型茶樹(shù)油[31]。1， 8-桉葉素廣泛用于食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域，具有明確的藥用價(jià)值和一定的消耗量[32];研究發(fā)現(xiàn)1， 8-桉葉素在50 μg/mL對(duì)沙門(mén)氏菌（Salmonella enteritidis）有抑制效果，是茶樹(shù)油的主要抑菌成分[33];鐘振聲等[22]認(rèn)為1， 8-桉葉素為抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的有效物質(zhì)。α-松油醇對(duì)多種革蘭氏菌和多種真菌具有較強(qiáng)的抑制作用[34-36]，如α-松油醇能明顯抑制意大利青霉菌絲體生長(zhǎng)[37]。實(shí)驗(yàn)證明芳樟醇有顯著的抑菌活性[38-39]，天然芳樟醇對(duì)柑橘炭疽病菌、蘋(píng)果炭疽菌、番茄灰霉菌和小麥赤霉菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性[40-41]，薰衣草精油組分芳樟醇對(duì)抑制金黃色葡萄球菌貢獻(xiàn)最大[42]。α-蒎烯對(duì)白念球菌有明顯的抑菌和殺菌作用[43]，研究發(fā)現(xiàn)20 ?L/mL的1s-α-蒎烯可完全抑制大腸桿菌;50 ?L/mL的1s-α-蒎烯、β-月桂烯可完全抑制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)[44]。

本文研究結(jié)果表明，白千層精油對(duì)立枯絲核菌、小孢擬盤(pán)多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌等4種植物病原菌的生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌作用隨精油濃度的增大而增強(qiáng)，且具有較好的持效性。白千層精油處理立枯絲核菌，在5.0～10.0 ?L/mL濃度范圍均可完全抑制立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng);在7.5～10.0 ?L/mL濃度范圍可完全抑制小孢擬盤(pán)多毛孢菌菌絲的生長(zhǎng);在10.0 ?L/mL濃度時(shí)可完全抑制水稻稻瘟菌菌絲的生長(zhǎng)。其余濃度處理下，白千層精油對(duì)立枯絲核菌、小孢擬盤(pán)多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌等4種植物病原菌的生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制作用。張麗等[19]和朱德明等[17]的研究結(jié)果顯示互葉白千層精油對(duì)芭蕉炭疽菌、香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌具有良好的抑菌效果，能顯著性抑制芭蕉炭疽菌菌絲生長(zhǎng)，可導(dǎo)致其分生孢子內(nèi)部構(gòu)造發(fā)生改變。陶鳳云等[18]研究結(jié)果表明白千層精油對(duì)水稻惡苗菌、尖孢鐮刀菌和水稻紋枯菌等3種植物真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用顯著。由此可見(jiàn)，白千層精油抗菌抑菌活性具有一定的廣譜性，可作為開(kāi)發(fā)新型抗菌抑菌劑的來(lái)源材料。

本文開(kāi)展了白千層精油化學(xué)成分研究分析和其對(duì)4種常見(jiàn)植物病原真菌的抑菌活性測(cè)試，但白千層精油對(duì)其他植物病原菌的抑菌活性、最小抑菌濃度、殺菌機(jī)理以及白千層精油中存在抑菌活性的單體化合物篩選確定等方面問(wèn)題還需要在后續(xù)工作進(jìn)行深入研究。

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