植物紫色酸性磷酸酶的研究進(jìn)展

劉攀道 黃睿 許文茸 羅佳佳 陳志堅(jiān) 劉國(guó)道

摘? 要? 酸性磷酸酶（APase）是酸性條件下（pH < 7.0）能催化磷酸單酯或酸酐裂解從而釋放無(wú)機(jī)磷酸根離子的水解酶類。紫色酸性磷酸酶（Purple acid phosphatase，PAP）是一類特殊的酸性磷酸酶，其具有鮮明的特征，如：酶的提取液呈紫色或粉色、酶活性不受酒石酸鹽抑制、氨基酸序列具有5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域和雙金屬離子催化中心等。已有的研究表明，紫色酸性磷酸酶在植物適應(yīng)低磷脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本文綜述了紫色酸性磷酸酶的生化特性、亞細(xì)胞定位、生物學(xué)功能以及最新研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞? 紫色酸性磷酸酶;有機(jī)磷;低磷脅迫;生物學(xué)功能

中圖分類號(hào)? Q945.78? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

磷（phosphorus，P）是植物生長(zhǎng)發(fā)育的限制性營(yíng)養(yǎng)元素之一，參與植物的多種新陳代謝過(guò)程，如光合作用、能量傳輸、酶活性調(diào)節(jié)、膜磷脂與核酸的合成等[1]。無(wú)機(jī)可溶性磷酸鹽（inorganic phosphate，Pi）是植物根系能從土壤中吸收的主要磷形式，但在大多數(shù)耕作土壤中，Pi的濃度只有0.1～10 μmol/L，遠(yuǎn)低于植物最優(yōu)生長(zhǎng)所需的Pi濃度（1 mmol/L）[2]。全球近70%的耕地存在有效磷缺乏問(wèn)題，特別在酸性土壤中低磷脅迫尤為嚴(yán)重[3]。雖然土壤中Pi濃度低，但土壤中存在大量的有機(jī)磷，約占土壤全磷含量的30%～65%，主要以植酸磷（肌醇六磷酸）、DNA（脫氧核糖核酸）、ATP（腺嘌呤核苷三磷酸）和糖磷酯等形式存在[4]。有機(jī)磷難于被植物直接利用，只有被酸性磷酸酶降解后釋放出的Pi才能被植物根系吸收[5]。目前，已鑒定的參與植物適應(yīng)低磷脅迫的酸性磷酸酶，主要屬于紫色酸性磷酸酶（Purple acid phosphatase，PAP）家族[6]。本文將從生化特征、亞細(xì)胞定位及生物學(xué)功能等方面，系統(tǒng)介紹植物PAP相關(guān)研究領(lǐng)域近年來(lái)取得的進(jìn)展。

1? 植物紫色酸性磷酸酶的鑒定

酸性磷酸酶（Acid phosphatase，APase;E.C. 3.1.3.2）是一類能催化磷酸單酯或酸酐裂解從而釋放無(wú)機(jī)磷酸根離子且最適pH低于7.0的水解酶類[7]。對(duì)水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、菜豆（Phaseolus vulgaris）和柱花草（Stylosanthes guianensis）等的研究表明，增加酸性磷酸酶活性是這些植物中普遍存在的適應(yīng)低磷脅迫機(jī)制[8-13]。利用質(zhì)譜分析技術(shù)，對(duì)低磷脅迫誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的植物酸性磷酸酶蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中絕大部分屬于PAP家族成員，如番茄（Lycopersicon esculentum）的LeSAP1和LeSAP2[14];擬南芥（Arabidopsis thaliana）的AtPAP12和AtPAP 26 [15];菜豆的PvPAP3[12];白花羽扇豆（Lupinus albus）的LaSAP2[16]等。根據(jù)這些被鑒定的植物PAP的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域，通過(guò)生物信息學(xué)分析，已從不同植物中鑒定到大量的PAP或PAP-like蛋白。目前，在全基因組水平，已對(duì)擬南芥、水稻、大豆、玉米和鷹嘴豆（Cicer arietinum）的PAP編碼基因家族進(jìn)行了鑒定，它們分別有PAP家族成員29、26、35、33和25個(gè)[8， 10-11， 17-18]。如圖1所示，將擬南芥29個(gè)PAP和其他植物中一些已報(bào)道功能的PAP進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，并構(gòu)建蛋白進(jìn)化樹(shù)，植物PAP蛋白可以被分為I、II和III共3個(gè)亞家族。I亞家族可進(jìn)一步被分為Ia-1、Ia-2、Ib-1和Ib-2四個(gè)子族;II亞家族可被分為IIa和IIb兩個(gè)子族;III亞家族可被分為IIIa和IIIb兩個(gè)子族（圖1）。

2? 紫色酸性磷酸酶的生化結(jié)構(gòu)特征

植物中被鑒定的第一個(gè)PAP蛋白是從菜豆中分離純化的KbPAP[19]。隨后，從哺乳動(dòng)物、真菌和細(xì)菌中也鑒定到了PAP或PAP-like蛋白[20-22]。盡管不同物種之間PAP的蛋白同源性較低，但它們的氨基酸序列均存在5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即DXG、GDXXY、GNH （D/E）、VXXH和GHXH（下劃線表示7個(gè)不變的氨基酸殘基）[23]。這7個(gè)保守的氨基酸殘基參與了Fe3+-X（X表示二價(jià)金屬離子Fe2+、Mn2+或Zn2+）雙金屬離子催化中心的形成[23-24]。在哺乳動(dòng)物中，PAP雙金屬離子催化中心一般為Fe3+-Fe2+（即：二價(jià)金屬離子為Fe2+），而植物PAP的二價(jià)金屬離子是可變的，如菜豆KbPAP（即：PvPAP2）、大豆GmSAP和甘薯（Ipomoea batatas）IbPAP2的催化中心為Fe3+-Zn2+（即：二價(jià)金屬離子為Zn2+）;但甘薯IbPAP1與黃花羽扇豆（Lupinus luteus）LlPPD1的催化中心為Fe3+-Mn2+（即：二價(jià)金屬離子為Mn2+）[25-28]。植物PAP雙金屬中心二價(jià)離子的可變性，表明其催化機(jī)制的復(fù)雜性[23]。

雖然哺乳動(dòng)物PAP和植物的PAP都具有由2個(gè)夾心β折疊（β-α-β-α-β）構(gòu)成的保守催化結(jié)構(gòu)域，但兩者在分子量大小和低聚物結(jié)構(gòu)上卻存在明顯差異[24]。在哺乳動(dòng)物和植物中，均存在一類小分子量PAP（35 ku左右），此類PAP以單體形式存在[23-24]。植物的小分子量PAP屬于III亞家族（圖1）。但除小分子量PAP之外，植物中還存在一類大分子量PAP，包括I亞家族PAP（約55 ku）和II亞家族PAP（約75 ku）（圖1），而哺乳動(dòng)物沒(méi)有大分子量PAP[24]。植物的大、小分子量PAP的差異主要為兩個(gè)方面，一是大分子量PAP通常以二硫鍵或非共價(jià)結(jié)合的方式形成同質(zhì)二聚體或異質(zhì)二聚體，而小分子量PAP則以單體形式存在[23-24];二是大分子量PAP的N-末端存在一個(gè)非催化結(jié)構(gòu)域，而小分子量PAP無(wú)此結(jié)構(gòu)域[7]。目前，植物大分子量PAP的二聚體存在形式和N-末端非催化結(jié)構(gòu)域?qū)λ鼈兊纳飳W(xué)功能有何影響仍不清楚[7]。

3? 紫色酸性磷酸酶的生化酶學(xué)性質(zhì)

植物PAP對(duì)一系列天然或人工合成的磷酸化底物具有廣譜催化活性，包括硝基苯磷酸鹽（ρ-NPP）、磷酸化的能量分子（如ATP和無(wú)機(jī)焦磷酸）、磷酸化的糖類和磷酸化的氨基酸等[6-7]。其中，Ia亞家族的PAP普遍對(duì)ATP和PEP（磷酸烯醇丙酮酸鹽）具有強(qiáng)催化活性，如擬南芥的AtPAP10、AtPAP12、AtPAP25和AtPAP26[29-30];大豆的GmSAP[26];菜豆的KeACP（即：PvPAP1）和KbPAP（即：PvPAP2）[31-32];甘薯的IbPAP1[26];輪花大戟（Euphorbia characias）的EcPAP[33];洋蔥（Allium cepa）的AcPEPP[34]等。與Ia亞家進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA 5軟件，PAP蛋白的前2個(gè)字母表示物種拉丁名簡(jiǎn)寫。

族不同，Ib-1子族的PAP普遍能水解植酸磷底物，即具有植酸酶活性，如擬南芥的AtPAP15和AtPAP23[35-36];水稻的OsPAPhy_b[37];煙草（Nic oti ana tabacum）的NtPAP[38]、大豆的GmPhy[39];玉米的ZmPAPhy_b[37];大麥的HaPAPhy_a和HaPAPhy_b2[37];小麥的TaPAPhy_a1和TaPA Phy_b1[37]。因此，Ib-1子族的PAP也被稱為紫色酸性植酸酶（Purple acid phytase， PAPhy）[37]。

IIb亞家族的PAP具有核苷酸水解酶活性，根據(jù)其催化活性是否依賴金屬離子激活又可被分為兩類。第一類被命名為PPD（Diphosp honu cleo tide phosphatase/ phosphodiesterase，雙磷酸核苷磷酸酶/磷酸二酯酶），其催化活性依賴金屬離子激活，對(duì)綁定于核苷二磷酸的焦磷酸鍵及其他一些有機(jī)磷底物的磷酸二酯鍵具有高親和力，如黃花羽扇豆的LlPPD1和紫云英（Astragalus sinicus）的AsPPD1[28， 40];另一類被命名為NPP（Nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterases，核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶），其能催化核苷酸或核苷酸糖類的焦磷酸鍵/磷酸二酯鍵水解，但與PPD不同，NPP的催化活性不依賴于金屬離子激活，如：水稻的OsNPP1（即：OsPAP27b）、OsNPP2（即：OsPAP1b）和OsNPP6（即：OsPAP27a）[41]。此外，IIIb亞家族也有2個(gè)PAP被生化表征，即擬南芥的AtPAP17（即：AtACP5）和菜豆的PvPAP3，其中PvPAP3對(duì)ATP具有較強(qiáng)水解活性[12]。

近年來(lái)，關(guān)于PAP生化酶學(xué)特性的研究，除底物特異性外，對(duì)PAP抑制劑與催化劑的研究也取得了諸多進(jìn)展。PAP具有酸性磷酸酶的共性，即酶活性受其催化降解產(chǎn)物Pi的反饋抑制，菜豆的PvPAP3、番茄的LeSAP1、擬南芥的AtPAP25和AtPAP26均具有此特征[12， 14， 30]。但是，PAP也有其他酸性磷酸酶不具備的特性，即PAP的活性不受L-酒石酸鹽抑制[24]。此外，一些二價(jià)金屬離子對(duì)PAP的催化活性具有激活作用，如：Mg2+能增強(qiáng)PvPAP3、AtPAP26、LeSAP1和LeSAP2的催化活性[12， 14-15];而Mn2+能增強(qiáng)AcPEPP和TaPAPhy_a1催化活性[34-37]。

4? 植物紫色酸性磷酸酶的亞細(xì)胞定位

利用原位雜交、熒光蛋白標(biāo)記分析、蛋白質(zhì)譜分析等研究方法，來(lái)源于不同植物的PAP被證實(shí)能定位于細(xì)胞質(zhì)、液泡、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞核、細(xì)胞壁、葉綠體、線粒體、質(zhì)外體、過(guò)氧化物酶體[7]（圖2）。這些已被驗(yàn)證亞細(xì)胞定位的PAP中，定位于細(xì)胞壁、質(zhì)外體或者根系分泌蛋白質(zhì)組的PAP最多，即屬于細(xì)胞分泌蛋白，如擬南芥的AtPAP10、AtPAP12、AtPAP25、AtPAP2 6 [15， 29-30];大豆的GmSAP和GmPAP1-like[42-43];水稻的OsPAP10c和OsPAP21b[44-45]等（圖2）。其次，已有多個(gè)PAP被報(bào)道定位于細(xì)胞質(zhì)膜，如少根紫萍（Spirodela oligorrhiza）的SoPAP[46];紫云英的AsPPD1[40];菜豆的PvPAP1和PvPAP3[12-47];柱花草的SgPAP7、SgPAP10和SgPAP26[48]（圖2）。值得注意的是，一些PAP被證明具有多細(xì)胞器靶向定位的特征，如AtPAP26除定位于細(xì)胞壁外，也存在于液泡中[49];AtPAP7共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過(guò)氧化物酶體[50];AtPAP2依賴于C-末端的一段疏水性多肽靶向葉綠體外膜、線粒體外膜或細(xì)胞質(zhì)膜[51-52]（圖2）。PAP亞細(xì)胞定位的多樣性暗示著其在植物生命活動(dòng)中可能發(fā)揮著多樣化的生物學(xué)功能。

5? 紫色酸性磷酸酶參與植物適應(yīng)低磷脅迫

通過(guò)分子生物學(xué)、正向或反向遺傳學(xué)等研究方法，多個(gè)胞外PAP（定位于質(zhì)外體、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)膜或根系分泌蛋白）已被證明在植物適應(yīng)低磷脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[6]。將擬南芥根系分泌的3個(gè)主要PAP基因（AtPAP10、AtPAP12和AtPAP26）突變，將導(dǎo)致突變體對(duì)DNA和ADP的利用能力降低[29， 53];超量表達(dá)水稻的OsPAP10a、OsPAP10c和OsPAP21b，能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)外源ATP的利用[44-45， 54];我們課題組的研究中，利用菜豆毛根轉(zhuǎn)基因體系，分別超量表達(dá)GmPAP1-like、PvPAP1、PvPAP3、SgPAP7、SgPAP10和SgPAP26，能顯著提高轉(zhuǎn)基因材料對(duì)外源dNTP的利用能力[43， 47-48]。此外，少數(shù)幾個(gè)植物PAP被證明參與外源植酸磷的活化利用，包括截形苜蓿的MtPHY1、大豆的GmPAP4和GmPAP14[55-57]。除胞外PAP外，胞內(nèi)PAP也被認(rèn)為參與了植物對(duì)低磷脅迫的適應(yīng)，如AtPAP26被證明參與衰老葉片液泡中貯存磷的活化利用[58]。

6? 紫色酸性磷酸酶的其他生物學(xué)功能

植物PAP除了在低磷脅迫下參與有機(jī)磷活化利用之外，已被證實(shí)還具有其他生物學(xué)功能。在Ia亞家族中，煙草的NtPAP12通過(guò)催化細(xì)胞壁中的α-木糖苷酶和β-葡糖苷酶脫磷酸化參與細(xì)胞壁的生物合成[59];AtPAP5參與調(diào)控?cái)M南芥的抗病性[60];GmPAP3參與調(diào)控大豆的耐鹽性[61]。在Ib-1亞家族中，多個(gè)PAPhy被證明在種子或花粉萌發(fā)過(guò)程中，參與植物組織中儲(chǔ)藏植酸磷的活化，如AtPAP15、GmPhy、HaPAPhy_a、TaPAPhy_a1和TaPAPhy_b1等[37， 39， 62]。此外，AtPAP15還被報(bào)道參與抗壞血酸的合成[35]。在II亞家族中，AtPAP2被證實(shí)參與調(diào)控植物的碳代謝，超量表達(dá)AtPAP2能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥、馬鈴薯（Solanum tuberosum）和亞麻薺（Camelinasativa）的生物量[51， 63-64];AsPPD1參與調(diào)控紫云英根瘤的形成[40];OsNPP1則對(duì)水稻地上部淀粉的積累有負(fù)調(diào)控作用[41]。

7? 展望

雖然近年來(lái)植物PAP相關(guān)的研究已取得諸多進(jìn)展，但仍有許多科學(xué)問(wèn)題有待更加深入的探索，主要包括以下幾個(gè)方面：（1）植物PAP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究。目前，僅擬南芥的AtPHR1和水稻的OsPHR2這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分別被證明靶向AtPAP10與OsPAP21b的啟動(dòng)子，正調(diào)控PAP基因的表達(dá)[45， 65]。鑒定調(diào)控植物PAP的轉(zhuǎn)錄因子將有助于解析植物適應(yīng)低磷脅迫的分子網(wǎng)絡(luò)。（2）植物PAP蛋白的翻譯后修飾研究。已純化的植物PAP蛋白中普遍存在N-糖基化修飾的現(xiàn)象，如KeACP、AtPAP25、AtPAP26、LlPPD1、LeIAP、LeSAP1和LeSAP2等[6-7]。N-糖基化修飾對(duì)植物PAP的功能發(fā)揮有何調(diào)控作用將是今后的研究重點(diǎn)之一。（3）植物體內(nèi)PAP靶標(biāo)底物的鑒定。當(dāng)前對(duì)PAP的底物特異性研究，主要基于體外實(shí)驗(yàn)，絕大多數(shù)PAP在植物活體內(nèi)直接催化的底物仍未鑒定，這阻礙了全面解析PAP的生物學(xué)功能[7]。PAP除了能水解有機(jī)磷底物供給植物所需的磷素營(yíng)養(yǎng)外，一些PAP已被證明具有蛋白磷酸酶功能，如AtPAP25通過(guò)調(diào)控蛋白的脫磷酸化參與擬南芥適應(yīng)低磷脅迫[30]。此外，多個(gè)植物PAP除酸性磷酸酶活性外，已被證明具有堿性過(guò)氧化物酶活性，如菜豆的KeACP、番茄的LeIAP、擬南芥的AtPAP17和AtPAP26等[14， 24， 31， 66]。但PAP的堿性過(guò)氧化物酶活性在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能仍不清楚。隨著生命科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，這些問(wèn)題有望在將來(lái)的研究中被解決。

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