加米霉素含量測定方法的建立

張聰 姚路路 樊麗博 侯林

摘要[目的]建立用HPLC測定加米霉素含量的方法。[方法]采用高效液相色譜法，色譜柱為XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為磷酸鹽緩沖液（取0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至8.0）-乙腈（30∶70），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃;檢測波長為205 nm。[結(jié)果]加米霉素在0.498 4～1.993 6 mg/mL（r=0.999 9）峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為99.2%，RSD=0.6%。[結(jié)論]該方法重復(fù)性良好，能準確測定加米霉素的含量。

關(guān)鍵詞加米霉素;含量測定;HPLC法

中圖分類號S859.79文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0199-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.062

加米霉素是法國梅里亞公司開發(fā)研制的新一代半合成十五元氮雜環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，其注射液分別于2007、2010和2011年被歐洲藥品局（EMA）、加拿大保健產(chǎn)品與食品管理局（HPFB）和美國食品與藥品管理局（FDA）批準上市[1]，在中國，加米霉素注射液于2017年通過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部進口獸藥注冊在國內(nèi)上市銷售，用于治療和預(yù)防由溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌等主要病原菌引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病[2-3]。

國內(nèi)目前已有多家單位在開展加米霉素的仿制研究[4-6]，由于加米霉素的質(zhì)量標準并未收載于國內(nèi)外獸藥典或各類質(zhì)量標準匯編，因此在加米霉素及其注射液的仿制過程中，需要建立其質(zhì)量控制方法。筆者建立了高效液相色譜法測定加米霉素的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。加米霉素原料，批號20140901、20140902、20140903，由洛陽惠中獸藥有限公司生產(chǎn)。加米霉素對照品，含量98.8%，批號HZD140801;6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素對照品，含量95.0%，批號20170724，均由洛陽惠中獸藥有限公司制備。

1.1.2主要儀器。高效液相色譜系統(tǒng)（Waters e2695型HPLC;2489型紫外檢測器;Empower 2色譜工作站軟件），美國Waters公司;XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國Waters公司;AB265-S電子分析天平，梅特勒托利多公司;Seven easy型酸度計，梅特勒托利多公司。

1.1.3主要試劑。磷酸氫二鉀、磷酸為分析純;乙腈為色譜純;水為超純水。

1.2方法

1.2.1系統(tǒng)適用性溶液的制備。稱取加米霉素與6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含加米霉素1 mg與6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素0.5 mg的混合溶液，即得。

1.2.2對照品溶液的制備。稱取加米霉素對照適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含加米霉素1 mg的溶液，即得。

1.2.3供試品溶液的制備。稱取供試品適量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含加米霉素1 mg的溶液，即得。

1.2.4色譜條件。色譜柱為Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為磷酸鹽緩沖液（取0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至8.0）-乙腈（30∶70）;流速為1.0 mL/min;檢測波長為205 nm;柱溫為30 ℃。

1.2.5方法學考察。

1.2.5.1系統(tǒng)適用性試驗。分別精密吸取空白溶劑、系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液和供試品溶液20 μL，在“1.2.4”色譜條件下，注入高效液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適用性。

1.2.5.2線性關(guān)系考察。精密稱取加米霉素對照品，加流動相溶解制成濃度為4.984 0 mg/mL的溶液，作為對照品儲備液。精密吸取儲備液1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。精密吸取上述系列濃度的對照品溶液各20 μL，從低濃度到高濃度依次進樣分析，記錄色譜圖，以濃度（mg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.2.5.3進樣精密度試驗。取按“1.2.2”方法制備的對照品溶液，精密吸取20 μL，在“1.2.4”色譜條件下，注入高效液相色譜儀進行測定，連續(xù)進樣6次，計算峰面積的RSD。

1.2.5.4重復(fù)性試驗。取同一批號的供試品（批號20140901），按“1.2.3”方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取20 μL，在“1.2.4”色譜條件下，注入高效液相色譜儀進行測定，計算平均含量和RSD。

1.2.5.5中間精密度試驗。取同一批號的供試品（批號20140901），按“1.2.3”方法制備6份供試品溶液，在不同日期由不同人員在不同的高效液相色譜儀上，按“1.2.4”色譜條件進行測定，計算平均含量和RSD。

1.2.5.6穩(wěn)定性試驗。取同一份供試品溶液，按“1.2.4”色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，測定峰面積，計算RSD。

1.2.5.7回收率試驗。取同一批號的供試品（批號20140901）約10 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，分別按照測定濃度的80%、100%、120% 3個水平添加加米霉素對照品，按“1.2.3”方法制備供試品溶液，每個濃度水平平行制備3份，按“1.2.4”色譜條件測定，計算平均回收率和RSD。

1.2.6樣品測定。取3批供試品，按“1.2.3”方法制備供試品溶液并測定，計算加米霉素的含量。

2結(jié)果與分析

2.1方法學考察

2.1.1系統(tǒng)適用性試驗。圖1表明，在“1.2.4”色譜條件下，加米霉素與6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素的分離度符合要求，空白溶劑在加米霉素對照品相應(yīng)的保留時間處無干擾。

2.1.2線性關(guān)系考察。按“1.2.5.2”方法操作，以濃度（mg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線如圖2所示，計算得出線性回歸方程為y=2.64×106x+26 344（r=0.999 9），表明加米霉素濃度在0.498 4～1.993 6 mg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3進樣精密度試驗。按“1.2.5.3”方法操作，計算得出峰面積的RSD為0.3%，表明儀器精密度良好。

2.1.4重復(fù)性試驗。按“1.2.5.4”方法操作，計算得出平均含量為99.8%，RSD為0.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5中間精密度試驗。按“1.2.5.5”方法操作，計算得出平均含量為99.8%，RSD為0.1%，表明該方法中間精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗。按“1.2.5.6”方法操作，計算峰面積的RSD為1.2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7回收率試驗。由表1可見，平均回收率為99.2%，RSD為0.6%，表明該方法準確度良好。

2.2樣品測定按“1.2.6”方法操作，計算得出3批樣品中加米霉素含量分別為99.8%、99.7%和99.6%。

3討論

3.1色譜條件的選擇加米霉素結(jié)構(gòu)與阿奇霉素、泰拉霉素類似，均屬于十五元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，因此在其含量測定方法的建立過程中，參考并比較了《獸藥質(zhì)量標準匯編（2006—2011年）》[7]泰拉霉素含量測定色譜條件（KH2PO4-甲醇-乙腈系統(tǒng)）及《歐洲藥典》8.0[8]和《中國藥典》2010年版[9]阿奇霉素含量測定色譜條件（K2HPO4-乙腈系統(tǒng)），最終以《中國藥典》2010年版[9]阿奇霉素含量測定色譜條件為基礎(chǔ)，以加米霉素峰的保留時間和分離度為指標，通過對K2HPO4溶液的pH及其與乙腈的比例進行優(yōu)化，確定了加米霉素的含量測定條件。

3.2系統(tǒng)適用性考察方法的確定加米霉素為紅霉素A肟（E型）經(jīng)異構(gòu)化反應(yīng)，再經(jīng)重排、還原、丙基化反應(yīng)制備生成[10]。由于紅霉素A肟（E型）在相同反應(yīng)條件下經(jīng)重排、還原、丙基化可生成6-N-丙基-N去甲基阿奇霉素，其結(jié)構(gòu)與加米霉素的差別僅在于十五元環(huán)上N位置的不同，2種產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似，易于混淆。高效液相色譜法可以通過保留時間的不同對兩者進行鑒別，但對色譜條件要求較高，否則兩者不能良好分離導致色譜峰重疊，因此在系統(tǒng)適用性考察中規(guī)定6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素和加米霉素的分離度應(yīng)符合要求，以求可以有效鑒別并測定加米霉素含量。

3.3耐用性試驗分別考察柱溫±5 ℃、流速±0.2 mL/min、流動相比例±2%、磷酸鹽緩沖液pH±0.2及色譜柱型號的變化對含量測定的影響，以系統(tǒng)適用性及加米霉素含量為考察指標，考察色譜條件的耐用性。結(jié)果表明，柱溫、流速、流動相比例、流動相pH發(fā)生微小變化時，系統(tǒng)適用性均符合要求，對含量測定結(jié)果的影響較小;對色譜柱的型號進行了考察，分別使用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters XTerra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行系統(tǒng)適用性考察，使用Waters XTerra C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）時加米霉素峰與6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素峰完全重疊，而使用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）時，系統(tǒng)適用性考察分離度大于1.5，因此方法規(guī)定采用Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

4結(jié)論

該研究建立了高效液相色譜法測定加米霉素的含量，該方法可對加米霉素及其異構(gòu)體6-N-丙基-N-去甲基阿奇霉素進行有效的鑒別，方法學考察表明該方法專屬性、精密度、重復(fù)性良好，可準確測定加米霉素的含量，為其質(zhì)量控制了良好的方法。

47卷3期張 聰?shù)燃用酌顾睾繙y定方法的建立

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