胡蘿卜軟腐果膠桿菌CpxP蛋白純化及抑菌功能鑒定

苗蘭天，盧天華，何曉亮，周曉輝

河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050000

胡蘿卜軟腐果膠桿菌屬于革蘭氏陰性菌，是世界十大植物病原菌之一[1]，其亞種 (Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum，PC1) 是植物細(xì)菌性軟腐病的主要致病菌[2]，常危害胡蘿卜、白菜、馬鈴薯等植物[3]。除此之外，在北京市順義區(qū)的芹菜軟腐病[4]、南京市八卦洲的蘆蒿軟腐病[5]、甘肅省嘉峪關(guān)市的洋蔥鱗莖軟腐病[6]、山西市晉中的西葫蘆軟腐病[7]等病害樣品中都分離到PC1菌株，說明病原菌宿主范圍極廣。病原菌通過細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌胞外水解酶，如蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等引發(fā)植物軟腐病[8-9]。目前，PC1菌株的全基因代謝網(wǎng)絡(luò)已成功構(gòu)建，并用于篩選潛在的致病基因[10]。Cpx雙組分調(diào)控系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陰性菌中，包含兩種重要功能蛋白：組氨酸蛋白激酶CpxA和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CpxR，同時(shí)包含一種用于輔助調(diào)控系統(tǒng)的周質(zhì)蛋白CpxP[11]。CpxP可以通過阻礙CpxA的接受域與外界環(huán)境信號(hào)傳導(dǎo)的化學(xué)信號(hào)相接觸，進(jìn)而有效抑制CpxA對(duì)于整個(gè)調(diào)控系統(tǒng)的激活[12]。在沙門氏菌等致病性革蘭氏陰性菌及大腸桿菌模式菌中CpxP的主要功能為通過與CpxA的結(jié)合從而減少CpxA被不恰當(dāng)誘導(dǎo)的機(jī)會(huì)，達(dá)到微調(diào)整Cpx系統(tǒng)的活性，使細(xì)胞不產(chǎn)生過度侵染反應(yīng)[13]。因此，胡蘿卜軟腐果膠桿菌的Cpx雙組分系統(tǒng)對(duì)其致病性的調(diào)控也具有極其重要的作用[14]。目前，國內(nèi)研究較多的是胡蘿卜軟腐果膠桿菌的分離鑒定[15]和其他一些抑菌基因的研究，如clpP[16]、mreB2、flgk[17]等。國外研究較多的是Cpx雙組分調(diào)控和細(xì)菌中其他調(diào)控系統(tǒng)的相互作用關(guān)系[18-19]。但是，CpxP蛋白的外源表達(dá)和抑菌功能在胡蘿卜軟腐果膠桿菌中的研究尚未見報(bào)道。

本研究利用分子克隆技術(shù)，將cpxP基因構(gòu)建于表達(dá)載體pET-15b中，并在大腸桿菌Escherichia coliBL21 (DE3) 中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，經(jīng)二級(jí)純化后進(jìn)行穩(wěn)定性和抑菌功能分析，為蛋白結(jié)晶、結(jié)構(gòu)解析和分子機(jī)理研究提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為預(yù)防和防治胡蘿卜軟腐果膠桿菌提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究中所使用的菌株是胡蘿卜軟腐果膠桿菌亞種 (Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum)，菌種號(hào)為DSM-30169，購于德國微生物菌種保藏中心 (DSMZ)；大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)購于北京全式金生物科技有限公司；大腸桿菌E.coliBL21 (DE3) 購于北京博邁德基因技術(shù)有限公司；pET-15b質(zhì)粒由柏林洪堡大學(xué)Hunke教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑、儀器和培養(yǎng)基

核酸限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ、T4 DNA連接酶均購自賽默飛世爾科技 (中國) 有限公司；DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白marker、抗生素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 購自北京索萊寶科技有限公司；引物合成自華大基因；全波長酶標(biāo)儀購自BioTek伯騰儀器有限公司 (美國)；Ni SepharoseTM6 Fast Flow 和 Sephacryl S-200預(yù)裝柱購自 GE Healthcare公司 (美國)；快速蛋白液相色譜儀(Fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC)購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司 (上海)；新鮮的娃娃菜Brassica pekinensis、馬鈴薯Solanum tuberosum、胡蘿卜Daucus carota購自石家莊南栗市場。培養(yǎng)基為Luria-Bertani培養(yǎng)基。

1.3 基因組DNA的提取

取過夜培養(yǎng)的菌液2 mL，8 000 r/min離心1 min；300 μL TE重懸，450 μL細(xì)胞裂解液于80 ℃孵育5 min裂解細(xì)胞；恢復(fù)室溫后加入30 μL 10 mg/mL RNA酶37 ℃孵育15 min以清除RNA；加入150 μL蛋白沉淀液，高速振蕩1 min，冰浴5 min；13 000 r/min離心5 min處理除去蛋白沉淀，吸取上清液到新的離心管中；加入650 μL異丙醇輕柔顛倒直至出現(xiàn)絮狀白色DNA沉淀；加入450 μL 70%乙醇，12 000 r/min離心5 min棄上清，重復(fù)洗滌1次；干燥離心管，加入50 μL ddH2O水化溶解DNA沉淀并于4 ℃保藏備用。

1.4 重組質(zhì)粒cpxP-pET-15b的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取編碼CpxP (Gene ID:29704421) 蛋白的核苷酸序列，用軟件Primer Premier在蛋白的編碼區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。上游引物序列引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物序列引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)。引物名稱及序列如表1所示。

PCR反應(yīng)體系：基因組1 μL、10 mmol/L F-cpxP2 μL、10 mmol/L R-cpxP2 μL、10×HiFi 聚合酶緩沖液Ⅰ 10 μL、dNTPs 4 μL、HiFi 聚合酶 1 μL、ddH2O補(bǔ)至100 μL體系。PCR程序設(shè)置：94 ℃ 5 min、94 ℃ 40 s、57 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s、72 ℃ 5 min ，共38個(gè)循環(huán)；電泳檢測PCR結(jié)果并進(jìn)行產(chǎn)物回收，將回收片段和pET-15b質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切；使用T4 DNA連接酶過夜連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，對(duì)陽性菌進(jìn)行抽提質(zhì)粒和雙酶切驗(yàn)證；將陽性質(zhì)粒送至華大基因測序，并保藏測序結(jié)果正確的菌至-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)與表達(dá)

將上述構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇后涂布于含有青霉素和氯霉素的雙抗性平板上；挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，用于菌株保藏與種子培養(yǎng)基制備；按2%(V/V) 的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至含有雙抗的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、170 r/min恒溫培養(yǎng)2.5 h至OD600為0.5左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。降低溫度與轉(zhuǎn)速繼續(xù)恒溫培養(yǎng)至OD600為2左右，離心收菌于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組蛋白的分離純化及電泳檢測

用80 mL含有1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)、2.5 mol/L NaCl、10%甘油的細(xì)胞懸浮液重新懸浮細(xì)胞，并使用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，工作時(shí)間30 min。將破碎液置于4 ℃、12 000 r/min高速冷凍離心10 min。取上清液再次置于4 ℃、40 000 r/min超速冷凍離心1 h，得到粗提蛋白樣品；使用鎳離子親和層析柱對(duì)粗提蛋白樣品進(jìn)行純化，設(shè)置不同咪唑濃度的緩沖液進(jìn)行蛋白洗脫。洗脫下來的蛋白進(jìn)行凝膠過濾層析，將純化后蛋白進(jìn)行濃縮處理得到高濃度的蛋白。在純化過程中取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.7 重組蛋白穩(wěn)定性測試

1.7.1 CpxP蛋白熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將CpxP蛋白從-80 ℃解凍后，各取500 μL裝在2個(gè)1.5 mL EP管中。EP管分別標(biāo)記4 ℃和22 ℃。每隔24 h取樣，取樣前需經(jīng)60 000 r/min、30 min超速離心。上清液直接制備樣品，沉淀用等量緩沖液懸浮后制備樣品。從0時(shí)刻開始，連續(xù)取樣6 d，通過SDS-PAGE檢測CpxP蛋白的熱穩(wěn)定性。

1.7.2 CpxP蛋白pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

使用無菌水，通過HCl溶液和NaOH溶液配制出pH值為4–12的水溶液。取9個(gè)1.5 mL EP管，分別裝450 μL不同pH的水溶液和50 μL CpxP蛋白樣品。混勻后放置于4 ℃冰箱。24 h后超速離心，上清液直接制備樣品，沉淀用等量緩沖液懸浮后制備樣品，通過SDS-PAGE檢測CpxP蛋白的pH穩(wěn)定性。

1.8 重組蛋白的抑菌測試

1.8.1 CpxP蛋白抑菌定性實(shí)驗(yàn)

平板抑菌定性試驗(yàn)：活化的PC1菌液稀釋至1.0×106CFU/mL。取適量的菌液稀釋液均勻涂布在LB平板上。用無菌鑷子夾出牛津杯，小心豎放在平板上的中央位置。用微量移液器吸取蛋白水溶液，滴加到牛津杯中。需將平板在4 ℃冰箱中放置3 h，以便蛋白水溶液可以均勻擴(kuò)散，之后在28 ℃過夜培養(yǎng)。

CpxP蛋白在娃娃菜葉片上抑菌定性試驗(yàn)：取新鮮娃娃菜葉片，酒精消毒后自然晾干。將培養(yǎng)好PC1菌液稀釋到1.0×107CFU/mL，CpxP蛋白液稀釋到1、4、8 mg/mL；菌液和不同濃度的蛋白液1∶1混合于EP管中。依次取10 μL混合液連槍頭一起打入娃娃菜葉中，待混合液完全滲入菜葉中，拔出槍頭；無菌水作為陰性對(duì)照，純菌液作為陽性對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)，實(shí)時(shí)觀察結(jié)果。

1.8.2 CpxP蛋白抑菌定量實(shí)驗(yàn)

CpxP蛋白在胡蘿卜切片上抑菌定量試驗(yàn)：取新鮮胡蘿卜，洗凈后切片，并在每片胡蘿卜中心做出1個(gè)小型凹槽，每片胡蘿卜凹槽大小相同。酒精消毒后自然晾干，將培養(yǎng)好PC1菌液稀釋到1.0×107CFU/mL，CpxP蛋白液稀釋到1、2、4、8 mg/mL；菌液和不同濃度的蛋白液1∶1混合于EP管中。在每一個(gè)凹槽內(nèi)注入30 μL混合液。30 μL無菌水和8 mg/mL蛋白1∶1混合液作為陰性對(duì)照，純菌液作為陽性對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)，實(shí)時(shí)觀察結(jié)果，測量時(shí)每孔測量3組數(shù)據(jù)。

CpxP蛋白在馬鈴薯切片上抑菌定量試驗(yàn)：取新鮮馬鈴薯，洗凈后切片，并在馬鈴薯上做出5個(gè)相同大小的小型凹槽，酒精消毒后自然晾干。將培養(yǎng)好PC1菌液稀釋到1.0×107CFU/mL，CpxP蛋白液稀釋到1、2、4、8 mg/mL；菌液和不同濃度的蛋白液1∶1混合于EP管中。在每一個(gè)凹槽內(nèi)注入30 μL混合液。28 ℃培養(yǎng)，實(shí)時(shí)觀察結(jié)果，測量時(shí)每孔測量3組數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒cpxP-pET-15b的構(gòu)建

以提取的胡蘿卜軟腐果膠桿菌的基因組為模板擴(kuò)增目的基因cpxP。將基因、質(zhì)粒酶切后連接轉(zhuǎn)化，挑取轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證，并提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果如圖1所示，重組質(zhì)粒 (泳道2) 分子量高于pET-15b質(zhì)粒 (泳道1)，且被酶切下的基因片段 (泳道3，約500 bp) 送測序驗(yàn)證結(jié)果與cpxP基因大小相同、相似度為100%，說明構(gòu)建成功。

圖1 雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of double digested products.M:DNA marker;1:pET-15b plasmid;2:recombinant plasmid;3:double digestion of recombinant plasmid.

2.2 重組蛋白的Ni-NTA純化與分子篩純化

終濃度為1 mmol/L的IPTG可誘導(dǎo)CpxP蛋白在大腸桿菌BL21 (DE3) 高效表達(dá)，蛋白通過鎳離子親和層析純化，如圖2所示，左起泳道NI為未IPTG誘導(dǎo)的重組菌株，泳道Cell為菌株誘導(dǎo)后超聲破碎離心的上清液，對(duì)比NI可知，Cell中含有目的蛋白，泳道D為上清穿出液，蛋白膠中未見目的蛋白條帶，表明CpxP蛋白已經(jīng)完全結(jié)合到了鎳柱上，而且蛋白量并沒有超過鎳柱的承載量。經(jīng)過緩沖液1和2的沖洗，可以洗脫非特異性結(jié)合在鎳柱上的雜蛋白，之后再用較高濃度的咪唑洗脫目的蛋白。當(dāng)咪唑濃度提升到150 mmol/L時(shí)可以洗脫大部分結(jié)合在鎳柱上的目的蛋白，隨著濃度提升到500 mmol/L可完全將目的蛋白洗脫，收集后濃縮，進(jìn)行下一步純化。

使用Sephacryl S-200預(yù)裝柱進(jìn)行純化。如圖3A所示，在軟件界面只顯示一個(gè)收集峰，無其他的雜峰出現(xiàn)，輸出峰的管數(shù)為28–39，取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖3B所示，結(jié)果顯示目的蛋白條帶出現(xiàn)在22 kDa附近，且蛋白條帶的大小和預(yù)測的蛋白分子量是相似的。SDS-PAGE顯示無其他雜蛋白出現(xiàn)，表明經(jīng)親和層析及凝膠過濾層析兩步純化后獲得了高純度的CpxP蛋白，純度可達(dá)99%。

圖2 CpxP蛋白鎳離子親和層析分析Fig.2 Analysis of CpxP protein by nickel ion affinity chromatography.M:low molecular weight protein marker;NI:non-induced control;Cell:inducing supernatant of induced recombinant bacteria;D:flow-through after nickel-chelating affinity column;W:the last drop of buffer 2 eluate;E1-2,E1-3,E1-4:buffer 3 protein eluate;E2-2,E2-3:buffer 4 protein eluent.

圖3 CpxP蛋白凝膠過濾層析分析Fig.3 Analysis of CpxP protein by gel filtration chromatography.(A) Gel filtration chromatography peak map of CpxP protein.(B) SDS-PAGE verification of gel filtration chromatography results.M:low molecular weight protein marker;28–39:protein sample of tube 28–39.

2.3 重組蛋白的穩(wěn)定性測試

蛋白熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖4A所示，CpxP蛋白水溶液在4 ℃和22 ℃條件下放置6 d，SDS-PAGE顯示沉淀和上清液條帶并無明顯變化，每24 h上清液的減少量和沉淀的增加量為0，說明其基本無降解，熱穩(wěn)定性較好。

蛋白pH穩(wěn)定性結(jié)果如圖4B所示，CpxP蛋白水溶液在不同pH值條件下處理24 h，蛋白電泳檢測條帶并沒有出現(xiàn)明顯的降解情況，說明CpxP蛋白對(duì)pH值的變化并不敏感，pH值穩(wěn)定性較好。

2.4 重組蛋白的抑菌測試

在定性抑菌實(shí)驗(yàn)中，平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果如圖5A所示，空白對(duì)照 (a孔和c孔) 并沒有出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，而加入蛋白水溶液 (b孔和d孔) 的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，隨著蛋白量增加，抑菌圈擴(kuò)大，判斷CpxP蛋白對(duì)胡蘿卜軟腐果膠桿菌有抑制作用。CpxP蛋白在娃娃菜葉片上的抑菌試驗(yàn)結(jié)果如圖5B所示，在相同的侵染時(shí)間下，隨著蛋白的濃度增大，侵染面積會(huì)減小，呈現(xiàn)反比例關(guān)系。在蛋白濃度為8 mg/mL的情況下，病原菌被完全抑制。

在定量抑菌實(shí)驗(yàn)中，CpxP蛋白在胡蘿卜切片上的抑菌試驗(yàn)在28 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h，結(jié)果如圖6A所示，a和f分別為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組b、c、d、e隨著蛋白濃度增大，胡蘿卜軟腐果膠桿菌的侵染面積下降。統(tǒng)計(jì)病斑直徑和抑菌率如圖6B所示，陽性對(duì)照的平均病斑直徑為18.90 mm，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹? mg/mL時(shí)，平均病斑直徑降低為14.03 mm，抑菌率達(dá)到了44.89%。說明CpxP蛋白對(duì)胡蘿卜軟腐果膠桿菌有明顯抑制作用。

圖4 CpxP蛋白穩(wěn)定性分析Fig.4 Analysis of CpxP protein stability.(A) Stability of CpxP protein at 4 °C and 22 °C.(B) Stability of CpxP protein under different pH conditions.

圖5 CpxP蛋白抑菌定性試驗(yàn)結(jié)果分析Fig.5 Analysis of antibacterial qualitative test results of CpxP protein.(A) Plate antibacterial test results.a:50 μL sterile water;b:50 μL protein aqueous solution;c:100 μL sterile water;d:100 μL protein aqueous solution.(B) Effects of different infestation time on the leaf of the doll.e:infestation for 18 h;f:infestation for 30 h;g:infestation for 42 h;well 1:10 μL PC1 bacterial solution with water;well 2:10 μL sterile water;well 3–5:10 μL PC1 bacterial solution with 1,4,8 mg/mL protein,respectively.

圖6 CpxP蛋白在胡蘿卜切片上抑菌定量試驗(yàn)結(jié)果分析Fig.6 Analysis of antibacterial quantitative test results of CpxP protein on carrot slice.(A) Quantitative test results of carrot slice bacteriostatic test.a:15 μL PC1 bacterial solution with 15 μL sterile water;b–e:15 μL PC1 bacterial solution with 1,2,4,8 mg/mL protein,respectively;f:15 μL sterile water with 15 μL 8 mg/mL protein.(B) Carrot slice bacteriostatic quantitative test rot diameter and inhibition rate statistical results.

CpxP蛋白在馬鈴薯切片上的抑菌試驗(yàn)在28 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h，結(jié)果如圖7A所示，a為陽性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組b、c、d、e隨著蛋白濃度增大，胡蘿卜軟腐果膠桿菌的侵染面積同樣出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)病斑直徑和抑菌率如圖7B所示，陽性對(duì)照的平均病斑直徑為21.33 mm，說明胡蘿卜軟腐果膠桿菌更易侵染馬鈴薯，但是從抑菌率上看CpxP蛋白在馬鈴薯切片上的效果要好于在胡蘿卜切片上的效果。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹? mg/mL時(shí)，平均病斑直徑降低為13.59 mm，抑菌率達(dá)到59.41%。

圖7 CpxP蛋白在馬鈴薯切片上抑菌定量試驗(yàn)結(jié)果分析Fig.7 Analysis of antibacterial quantitative test results of CpxP protein on potato slice.(A) Quantitative test results of potato slice bacteriostatic test.a:15 μL PC1 bacterial solution with 15 μL sterile water;b–e:15 μL PC1 bacterial solution with 1,2,4,8 mg/mL protein,respectively.(B) Potato slice bacteriostatic quantitative test rot diameter and inhibition rate statistical results.

3 討論

CpxP存在于細(xì)胞的周質(zhì)空間，結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)二聚體構(gòu)型，是由兩個(gè)“左手狀”單體相互纏繞而形成的功能蛋白[12,20]。Stefanie 等[21]發(fā)現(xiàn)Cpx雙組分系統(tǒng)可以影響細(xì)菌毒力的強(qiáng)弱，但在不同的菌株中有著不同的外在表現(xiàn)。研究表明將鼠傷寒沙門氏菌中的cpxA信號(hào)接收域敲除后，該菌對(duì)真核細(xì)胞的入侵能力明顯減弱，cpxA的缺失突變株使該菌在小鼠體內(nèi)的存活率大大降低[22]。Irina等[23]研究發(fā)現(xiàn)缺失Cpx系統(tǒng)后，尿道致病性大腸桿菌的毒力降低，同時(shí)侵染力和對(duì)抗生素的抗性也出現(xiàn)同步下降的趨勢(shì)。但是杜克嗜血桿菌的cpxAR突變株對(duì)人類的感染力明顯增強(qiáng)[24]，說明原本存在的Cpx系統(tǒng)的激活能夠有效增加其致病力。而在胡蘿卜軟腐果膠桿菌中，Cpx雙組分調(diào)控系統(tǒng)的激活也應(yīng)是依靠外界環(huán)境信號(hào)的刺激，如膜壓力變化、pH值變化等。在沙門氏菌等一些致病革蘭氏陰性菌中，當(dāng)CpxA蛋白的輸入域接收到外界刺激，其會(huì)自磷酸化，之后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至CpxR蛋白上使其構(gòu)象改變，從而激活CpxR蛋白，CpxR蛋白控制著病菌的一些毒力基因(hilD、hilA、icmR)表達(dá)[13,25]，使得菌株獲得侵染性。但是，課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)[12]，大腸桿菌中過表達(dá)的CpxP蛋白可以下調(diào)Cpx雙組分的應(yīng)激調(diào)控。原因在于CpxP蛋白的二聚體構(gòu)象如同“帽子”一般，“扣在”了CpxA蛋白上，這種作用結(jié)果是由正負(fù)電荷結(jié)合帶來的，使得CpxA的輸入域不能夠同信號(hào)分子相接觸，從而適時(shí)關(guān)閉Cpx調(diào)控系統(tǒng)，以致CpxA/R蛋白不能被激活，不能控制下游的毒力基因的表達(dá)。此時(shí)菌體外在的表現(xiàn)為侵染性降低，CpxP蛋白表現(xiàn)出抑菌效果。由其抑菌機(jī)理可知，CpxP蛋白是間接參與調(diào)控Cpx雙組分的蛋白，其抑菌作用是抑制Cpx雙組分系統(tǒng)激活開關(guān)的結(jié)果[26]。本研究通過表達(dá)高純度的CpxP蛋白的體外抑菌實(shí)驗(yàn)，確定了CpxP蛋白的體外應(yīng)用也可起到對(duì)胡蘿卜軟腐果膠桿菌的抑制作用，其抑菌機(jī)理可能是可透過菌體外膜通過抑制其雙組分系統(tǒng)的激活從而達(dá)到其抑菌效果的。

植物軟腐病常見的物理防治有翻耕土壤，破壞病原菌生存環(huán)境或輪作種植、及時(shí)清除害病植株、管控施肥并嚴(yán)防蟲害等[27]，清除病原菌附著體，切斷病原菌傳播路徑，對(duì)于預(yù)防植物軟腐病的發(fā)生有著極大的幫助。目前，不得不承認(rèn)化學(xué)防治依舊是防治植物軟腐病的主要手段，但是化學(xué)藥劑的長時(shí)間大量施用對(duì)大自然的生態(tài)環(huán)境和人類的生命安全也造成了威脅?？股胤乐畏椒ǘ嘁娪诩∶顾亍⒀趺顾?、十眾霉素、麥芽糖酯酶等[28]，但是長久如此，病菌耐藥性增加，防治的效果會(huì)越來越差。所以尋求合適的生物防治方法尤為迫切，CpxP蛋白的體外抑菌實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，為將來的農(nóng)業(yè)應(yīng)用提供了參考。

4 結(jié)論

本研究利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒cpxP-pET-15b，并在大腸桿菌表達(dá)菌株中實(shí)現(xiàn)了CpxP重組蛋白的高效異源表達(dá)，并通過鎳離子親和層析和凝膠過濾層析得到了高純度重組蛋白。同時(shí)，驗(yàn)證了CpxP蛋白擁有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。抑菌試驗(yàn)中，CpxP蛋白在胡蘿卜切片上的抑菌率為44.89%，在馬鈴薯切片上的抑菌率為59.41%。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究該蛋白的空間結(jié)構(gòu)、抑菌機(jī)理提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為軟腐病的預(yù)防和防治提供了新的思路。