基于foldon介導(dǎo)的寡聚化以提高阿魏酸酯酶催化效率

張雷，雷林超，張光亞，李夏蘭

華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021

阿魏酸酯酶 (Feruloyl esterase E.C 3.1.1.73，F(xiàn)AE) 是羧酸酯酶的一個(gè)亞類，它能水解植物細(xì)胞壁中阿魏酸與多糖之間連接的酯鍵，釋放阿魏酸[1-2]。FAE可以協(xié)同木質(zhì)纖維降解酶，如木聚糖酶、纖維素酶及木質(zhì)素酶，破壞木質(zhì)纖維的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，促進(jìn)木質(zhì)纖維降解[1-4]。但報(bào)道的FAE的催化性能有待提高，需對(duì)酶進(jìn)行改造[5-7]。以定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化為代表的蛋白質(zhì)工程技術(shù)已經(jīng)成功地篩選了具有優(yōu)化特性的酶，但這些方法在改造酶時(shí)仍存在困難，如突變體庫(kù)的建立和大量篩選工作[8]。而通過固定化或化學(xué)修飾，有時(shí)也能提高酶的性能，但存在酶在固定化過程中會(huì)引起酶失活、首次固定化成本高、與大分子底物反應(yīng)較困難等缺點(diǎn)[9]。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，可通過蛋白質(zhì)工程對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造以獲取蛋白質(zhì)的新功能[10]。寡聚化是許多蛋白質(zhì)自我聯(lián)合成寡聚體以獲得功能優(yōu)勢(shì)的一種常用方式[11]。寡聚化能夠?yàn)槟繕?biāo)酶提供多種功能優(yōu)勢(shì)，如提高熱穩(wěn)定性、pH 耐受性、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及催化性能等[12-14]。Foldon是來源于T4噬菌體纖維蛋白C-末端，由27個(gè)氨基酸 (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)組成，該結(jié)構(gòu)域由3個(gè)相同亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基包含1個(gè)β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)[15]。通過基因融合，該結(jié)構(gòu)域可與目標(biāo)酶人工連接以改變其性質(zhì)。幾種工程蛋白的熱力學(xué)穩(wěn)定性，如短膠原纖維[16]、HIV1包膜糖蛋白[17]，均已通過foldon結(jié)構(gòu)域的附著而得到增強(qiáng)。由COMP和foldon誘導(dǎo)形成的寡聚體通?？蓪?dǎo)致熱穩(wěn)定性的提高[11,18]。Can等[13]將foldon與抗凍蛋白進(jìn)行連接后形成寡聚化同型抗凍蛋白且提高了冰晶表面結(jié)合的抗凍蛋白濃度，使其活力顯著增加。本課題組在FAE的C-末端融合foldon，從而誘導(dǎo)酶自發(fā)形成三聚體，構(gòu)成寡聚化阿魏酸酯酶，并對(duì)重組FAE的表達(dá)和其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coliDH5α購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；巴斯德畢赤酵母Pichia pastorisGS115、載體pPIC9K購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶 (SnaBⅠ、NotⅠ、SacⅠ)、T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker (10-170 kDa)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白質(zhì)快速銀染試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；阿魏酸甲酯購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。MD培養(yǎng)基、YPD種子培養(yǎng)基、BMGY種子培養(yǎng)基、BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基按美國(guó)Invitrogen公司的畢赤酵母操作表達(dá)手冊(cè)配制。

1.1.3 主要器材

納米激光粒度儀 (英國(guó)Malvern儀器公司)；200目銅網(wǎng) (中科鏡儀有限公司)；透射電子顯微鏡 (日本電子株式社)；超高效液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫科技有限公司)。

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

在 UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選酶活較高的FAEO42807，該FAE是從黑曲霉Aspergillus nigerCBS120.49中分離得到的[1]。根據(jù)FAEO42807的氨基酸序列，以畢赤酵母標(biāo)準(zhǔn)密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)FAE的基因序列，并在基因序列N端設(shè)計(jì)His標(biāo)簽后，兩端引入SnaBⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)，化學(xué)合成基因序列His-fae。用SnaBⅠ、NotⅠ分別雙酶切合成基因序列His-fae和質(zhì)粒pPIC9K，膠回收雙酶切片段后用T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選出的陽(yáng)性克隆子由Sangon測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K/His-fae。另，將foldon基因與fae序列的C-末端直接融合，用相同方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pPIC9K/Hisfae-foldon?；蚺c蛋白質(zhì)示意如圖1所示。

1.3 重組FAE在畢赤酵母中的表達(dá)和純化

重組質(zhì)粒用SacⅠ線性化，電轉(zhuǎn)化至P.pastorisGS115感受態(tài)后，涂布于MD平板上篩選重組子，取MD平板上生長(zhǎng)良好的菌落用牙簽點(diǎn)種至YPD搖瓶中，過夜培養(yǎng)后提取其基因組DNA，利用通用引物5?AOX、3?AOX進(jìn)行PCR鑒定。重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)參見畢赤酵母操作表達(dá)手冊(cè)。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，粗酶液用鎳層析柱進(jìn)行純化，純化后用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，SDS-PAGE分析純化后的酶液。

圖1 基因與蛋白質(zhì)示意圖Fig.1 A schematic of gene and corresponding protein structures.Olig-FAE is a trimer structure formed by the monomer pre-olig-FAE while protein is expressed;multi-FAE contains both mon-FAE and olig-FAE.

1.4 重組FAE酶活力測(cè)定

高效液相色譜法測(cè)定FAE酶活力[19]?？瞻讓?duì)照為煮沸失活的酶液。酶活力單位為在25 ℃、pH 6.0的條件下1 min生成1 μmol阿魏酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.5 重組FAE酶學(xué)性質(zhì)的研究

以下實(shí)驗(yàn)所用的酶液，mon-FAE 酶活力為(251±7.61) U/L，比活為 (0.36±0.011) U/mg，multi-FAE 酶 活 力 (441±12.7) U/L，比 活 為(1.63±0.045) U/mg。

1.5.1 最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

取250 μL酶液保溫5 min后，加入250 μL阿魏酸甲酯溶液 (由pH值為6.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液配制)，在40-65 ℃中反應(yīng)10 min，測(cè)定重組FAE的酶活力。以所測(cè)的最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.2 溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

將酶液置于30-50 ℃下保溫12 h，每隔3 h取樣測(cè)定殘留酶活力，以保溫0 h所測(cè)定的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.3 最適反應(yīng)pH值的測(cè)定

取250 μL酶液于50 ℃保溫5 min后，加入250 μL 的阿魏酸甲酯溶液 (0.2 mol/L 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值在3.0-8.0之間)，50 ℃下反應(yīng)10 min，測(cè)定重組FAE的酶活力。以所測(cè)的最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.4 pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

將酶液置于0.2 mol/L、pH值為3.0-8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，50 ℃保溫2 h，取250 μL保溫酶液，向其加入250 μL阿魏酸甲酯溶液，50 ℃下反應(yīng)10 min，測(cè)定重組FAE殘留酶活力，以各pH值的0 h酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.5 金屬離子對(duì)重組FAE酶活力的影響

將酶液與含有10 mmol/L的各種金屬離子(Na+，K+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Cu2+，Mg2+，Ca2+，Zn2+)的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液 (pH 6.0) 混合，于50 ℃保溫2 h，測(cè)定殘留酶活，以不添加金屬離子所測(cè)得的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5.6 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

米氏常數(shù)的測(cè)定：取8支試管，每管都加好200 g/L阿魏酸酯甲酯溶液和0.2 mol/L、pH 6.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，在25 ℃下預(yù)熱3 min，用同一管酶液依次加樣，依次在酶作用1-30 min時(shí)測(cè)定酶活力，然后算出酶活力與反應(yīng)時(shí)間的比值，在一定時(shí)間內(nèi)比值保持穩(wěn)定，則在此時(shí)間內(nèi)酶作用為一級(jí)反應(yīng)，此時(shí)間即可確定為測(cè)Km值和Vmax的反應(yīng)時(shí)間。用不同濃度的底物，在0.2 mol/L、pH 6.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖體系中，25 ℃下反應(yīng)一定時(shí)間，測(cè)定酶活，計(jì)算相應(yīng)的反應(yīng)速度，利用米氏方程雙倒數(shù)法求得Km值及Vmax。

1.6 重組FAE蛋白粒徑的測(cè)定

重組FAE的粒徑大小由納米激光粒度儀測(cè)定[20]。配置的參數(shù)：散射角173°、HeNe激光器633 nm、輸出功率10 mW，使用內(nèi)置溫度將樣品控制在特定溫度 (25-65 ℃)，并在進(jìn)行測(cè)定之前將樣品在相應(yīng)溫度下穩(wěn)定5 min；粒徑大小為樣品顆粒大小平均值。

1.7 重組FAE透射電子顯微鏡分析

將5 μL適量濃度蛋白質(zhì)樣品滴加到碳支持膜涂覆的200目銅網(wǎng)格上并溫育5 min，過量的蛋白質(zhì)樣品用濾紙進(jìn)行印記干燥。網(wǎng)格用兩個(gè)20 μL水洗滌并印記干燥，25 μL 2%乙酸鈾酰滴30 s，印記干燥后使用透射電子顯微鏡在100 kV下觀察樣品，并使用CCD照相機(jī)記錄電子顯微照片。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組FAE轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定與篩選

分別以pPIC9K/His-fae和pPIC9K/His-faefoldon的基因組為模板，用5?AOX1和3?AOX1引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物用1%的凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。以pPIC9K/His-fae轉(zhuǎn)化子基因組為模板進(jìn)行PCR，泳道1、2、4、6-8得到一條約800 bp的His-fae片段，顯示目的基因His-fae已經(jīng)成功整合到這些轉(zhuǎn)化子基因組中，以pPIC9K/His-fae-foldon轉(zhuǎn)化子基因組為模板進(jìn)行PCR，泳道11、15-18得到一條約900 bp的His-fae-foldon片段，顯示目的基因His-fae-foldon已經(jīng)成功整合到這些轉(zhuǎn)化子基因組中。

2.2 重組FAE的表達(dá)和純化

挑取上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，按照1.3進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，測(cè)定其酶活力，挑選實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)酶活力最高的轉(zhuǎn)化子。取其發(fā)酵上清液純化后進(jìn)行SDS-PAGE分析。對(duì)于pPCI9K/His-fae，如圖3A所示，pPCI9K/His-fae發(fā)酵上清液純化后，40 kDa處得到一條清晰條帶，而且?guī)缀鯖]有雜條帶，初步說明mon-FAE得到成功表達(dá)。圖3A顯示mon-FAE的表觀相對(duì)分子質(zhì)量明顯大于其理論值(29.97 kDa)，主要原因是FAE蛋白序列的N端有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，而畢赤酵母表達(dá)外源蛋白時(shí)，會(huì)對(duì)其進(jìn)行糖基化修飾，從而使相對(duì)分子質(zhì)量增大[21]。對(duì)于pPCI9K/His-fae-foldon，如圖3B所示，pPCI9K/His-fae-foldon發(fā)酵上清液純化后，SDS-PAGE結(jié)果顯示的pre-olig-FAE表觀相對(duì)分子質(zhì)量明顯大于其理論值 (33.04 kDa)；olig-FAE表觀相對(duì)分子質(zhì)量明顯大于其理論值99.12 kDa，其原因與mon-FAE表觀分子質(zhì)量大于其理論值原因相同。且理論上，pPCI9K/His-fae-foldon上清發(fā)酵液應(yīng)僅在三聚體位置即110 kDa處出現(xiàn)一條條帶，而pPCI9K-/His-fae-foldon發(fā)酵上清液在單體 (pre-olig-FAE) 45 kDa處和三聚體 (olig-FAE)110 kDa處均出現(xiàn)條帶，原因可能是由于空間位阻效應(yīng)，導(dǎo)致部分pre-olig-FAE未寡聚化，仍以pre-olig-FAE單體存在。

圖2 重組FAE轉(zhuǎn)化子的PCR電泳圖Fig.2 Electrophoresis map of the PCR analysis of recombinant FAE.Lane M：marker;lane 1-8：pPIC9K/His-fae transformants as template;lane 9：pPIC9K/His-fae plasmid as template;lane 10：sterile water as control;lane 11-18：pPIC9K/His-fae-foldon transformants as template;lane 19：pPIC9K/His-fae-foldon plasmid as template.

圖3 SDS-PAGE分析產(chǎn)物表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant FAE.(A)pPCI9K/His-fae.(B) pPCI9K/His-fae-foldon.

比較了mon-FAE和multi-FAE的酶活力及比活性 (表1)，發(fā)現(xiàn)multi-FAE的酶活力和比活力相比mon-FAE有小幅度提高。這些結(jié)果表明foldon在FAE的C-末端融合有利于提高FAE的酶活力及比活力。

2.3 FAE寡聚化過程的研究

文獻(xiàn)報(bào)道，foldon結(jié)構(gòu)域與蛋白進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)，寡聚化的蛋白極易受到溫度的影響，并在40 ℃開始發(fā)生少量解聚，當(dāng)溫度上升至60 ℃以上時(shí)，寡聚化結(jié)構(gòu)蛋白完全解聚，當(dāng)溫度介于二者之間時(shí)，寡聚蛋白部分解聚，兩種蛋白同時(shí)存在[22]，本課題組也證明了此結(jié)果。在本實(shí)驗(yàn)過程中，為考察olig-FAE在不同溫度條件下的解聚情況，分別將目標(biāo)蛋白與蛋白上樣緩沖液按5∶1 (V/V)混合并在25 ℃、40 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、100 ℃條件下分別水浴5 min后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明環(huán)境溫度為25 ℃時(shí)，45 kDa處的蛋白條帶為由于空間位阻作用未形成寡聚化結(jié)構(gòu)的pre-olig-FAE，且蛋白條帶較細(xì)；110 kDa處為形成寡聚化結(jié)構(gòu)的olig-FAE，該溫度下，olig-FAE還未發(fā)生解聚。當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，45 kDa處的蛋白條帶pre-olig-FAE相比于25 ℃時(shí)的蛋白條帶較粗，說明olig-FAE開始發(fā)生部分解聚，且隨著溫度的升高，45 kDa處的蛋白條帶pre-olig-FAE逐漸加粗，說明olig-FAE解聚量不斷增加。在60 ℃及以上溫度時(shí)110 kDa處的蛋白條帶olig-FAE已完全消失，SDS-PAGE顯示僅有一條45 kDa的條帶，說明寡聚化酶完全解聚。但實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)，解聚過程中在45 kDa單體位置有2條非?？拷臈l帶 (圖4)，因此，將經(jīng)鎳柱純化后的濃度為1 mg/mL的酶液送樣至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行MOTIF/TOF質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示僅在425 174.0出現(xiàn)一個(gè)峰，故判定圖4單體位置的兩條非?？拷臈l帶為同一物質(zhì)。

表1 重組酶的酶活性測(cè)定Table 1 Enzyme activity of the recombinant FAE

圖4 olig-FAE隨溫度變化聚集情況SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE of olig-FAE aggregation as temperature change.M：protein molecular weight marker;lane 1：25 °C;lane 2：40 °C;lane 3：55 °C;lane 4：60 °C;lane 5：65 °C;lane 6：70 °C;lane 7：100 °C.

使用動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 對(duì)不同溫度時(shí)重組FAE的粒徑進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示在25 ℃時(shí)分別在6.57 d.nm處以及52.74 d.nm處有2個(gè)峰，且隨溫度的升高6.57 d.nm處的粒徑出峰值變化不大，范圍在6.5-8.5 d.nm之間，而52.74 d.nm處的粒徑出峰值會(huì)隨著溫度的變化而逐漸變小，由于寡聚化結(jié)構(gòu)foldon隨溫度的升高而逐漸解聚，平均粒徑逐漸變小，所以判斷該處為olig-FAE出峰處，olig-FAE隨溫度變化的粒徑結(jié)果見圖5。從圖中可以看出，隨著溫度升高，olig-FAE的平均粒徑逐漸變小，且溫度升高至65 ℃時(shí)，olig-FAE的平均粒徑由25 ℃時(shí)的52.74 d.nm降低為10.62 d.nm，與mon-FAE所測(cè)得的平均粒徑 (9.54±2.12) d.nm相近，證明65 ℃時(shí)olig-FAE已全部解聚為單體結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)還采用透射電子顯微鏡圖像進(jìn)一步探究在25 ℃時(shí)olig-FAE的蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)，為了便于觀察olig-FAE的蛋白結(jié)構(gòu)，將樣品稀釋至0.15 mg/mL，電鏡結(jié)果如圖6所示。圖6中顯示在負(fù)染色液包裹范圍中有接近球形形態(tài)的顆粒聚集在一起，形成寡聚化結(jié)構(gòu)。

2.4 重組FAE的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

探究在40-65 ℃時(shí)酶反應(yīng)的最適溫度，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，mon-FAE與multi-FAE最適溫度均為50 ℃，且50 ℃之前，兩者的酶活均較高，相對(duì)酶活都在90%以上。超過50 ℃后，兩者的酶活力下降均較快，可能是隨著溫度的升高，酶出現(xiàn)失活現(xiàn)象。

圖5 溫度對(duì)olig-FAE粒徑的影響Fig.5 Effect of temperature on the particle size of olig-FAE.

圖6 Olig-FAE的TEM圖像Fig.6 TEM image of olig-FAE.

圖7 重組FAE的最適溫度Fig.7 Effect of temperature on the activity of recombinant FAE.

將重組FAE在30-55 ℃保溫0、3、6、9、12 h后，測(cè)定其殘余酶活，結(jié)果如圖8所示。mon-FAE及multi-FAE在30-55 ℃溫度下，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力均逐漸下降。30-40 ℃保溫12 h后，酶活力為初始酶的70%左右，且multi-FAE與mon-FAE酶活力相比較高一些，在40 ℃以后，multi-FAE及mon-FAE的酶活力均下降較快，且在50 ℃保溫3 h后，基本喪失酶活。

圖8 重組FAE的溫度穩(wěn)定性Fig.8 Effect of temperature on the stability of recombinant FAE.(A) mon-FAE.(B) multi-FAE.

2.4.2 最適pH及pH穩(wěn)定性的測(cè)定

重組酶的最適pH結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，mon-FAE的最適pH值為6.0；multi-FAE的最適pH值為5.0。重組酶的pH值穩(wěn)定性結(jié)果如圖10所示。由圖10可知，pH值為3.0-6.0時(shí)，隨著pH增大，mon-FAE的穩(wěn)定性隨之增大，pH值為6.0時(shí)，mon-FAE的pH穩(wěn)定性最高，pH值大于6.0時(shí)，mon-FAE穩(wěn)定性逐漸下降；pH值為3.0-5.0時(shí)，隨著pH增大，multi-FAE的穩(wěn)定性隨之增大，pH值為5.0時(shí)，multi-FAE的pH穩(wěn)定性最高，pH值大于5.0時(shí)，multi-FAE的穩(wěn)定性逐漸下降。multi-FAE對(duì)pH值較敏感，這可能是因?yàn)閜H值影響了FAE的寡聚化程度，從而影響了酶的穩(wěn)定性[23]。

圖9 重組FAE的最適pHFig.9 Effect of pH value on the activity of recombinant FAE.

圖10 重組FAE的pH穩(wěn)定性Fig.10 Effect of pH value on the stability of recombinant FAE.

2.4.3 金屬離子對(duì)重組FAE的影響

金屬離子對(duì)重組酶活力的影響見表2，對(duì)于mon-FAE，Mn2+、Mg2+有促進(jìn)作用，K+、Ca2+、Fe3+、Cu2+對(duì)其有一定的抑制作用，而Zn2+對(duì)其有顯著的抑制作用。對(duì)于multi-FAE，Mn2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Cu2+對(duì)其有促進(jìn)作用，K+對(duì)其有一定的抑制作用。

表2 金屬離子對(duì)重組FAE的影響Table 2 Influences of metal ions chemicals on the activity of the FAE

2.4.4 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

由于olig-FAE隨溫度升高會(huì)逐漸解聚為pre-olig-FAE，故在25 ℃測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)，見表3。其中multi-FAE的Km(1.03±0.02) 與mon-FAE(4.55±0.07) 相比較小，說明multi-FAE的底物親和力較mon-FAE有所提高，且提高倍數(shù)為3.42倍；multi-FAE的kcat/Km(3.94±1.12) 與mon-FAE(0.46±0.063) 相比較大，說明multi-FAE的催化效率較mon-FAE有明顯提高，且提高倍數(shù)為7.57倍；同時(shí)，multi-FAE的kcat、Vmax較mon-FAE均有所提高。其他研究人員的報(bào)道也存在類似的結(jié)果，例如，Yang等[24]將寡肽與堿性淀粉酶的N-末端融合，AmyK-p1的比活性和催化常數(shù) (kcat) 分別增加4.1倍和3.5倍，他們認(rèn)為提高催化效率和比活性的主要原因是由肽的活性部位周圍誘導(dǎo)更大的靈活性，同時(shí)寡聚化酶與底物的“鄰近效應(yīng)”，使酶的活性中心部位更集中，其底物濃度也大大高于溶液中的底物濃度，從而提高其催化效率。

表3 重組FAE動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定Table 3 Determination of kinetic parameters of recombinant FAE

3 討論

阿魏酸酯酶可在工農(nóng)業(yè)、食品制造、醫(yī)藥等領(lǐng)域都發(fā)揮巨大的作用。為了商業(yè)應(yīng)用，已有很多提高FAE酶催化性能的報(bào)道，并與本文研究結(jié)果相比，結(jié)果見表4。

文獻(xiàn)[25]報(bào)道應(yīng)用DNA改組策略和定向突變后，催化效率提高12.8倍。文獻(xiàn)[26]報(bào)道應(yīng)用PoPMuSiC算法預(yù)測(cè)氨基酸取代的折疊自由能變化，通過定點(diǎn)誘變?nèi)〈?個(gè)氨基酸，雙突變體D93G/S187F顯示出kcat/Km增加了9倍。文獻(xiàn)[28]報(bào)道進(jìn)行兩輪隨機(jī)誘變獲得熱穩(wěn)定突變體M6，M6的kcat/Km值提高1.9倍。文獻(xiàn)[29]報(bào)道使用MODIP和DbD兩種計(jì)算工具來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中可能存在的用于熱穩(wěn)定性改善的二硫鍵，引入額外的二硫橋?qū)AE實(shí)施改造，并使用分子動(dòng)力學(xué)模擬來設(shè)計(jì)額外的二硫橋，選擇一個(gè)殘基對(duì)A126-N152突變?yōu)榘腚装彼?。突變型AuFaeA的最適溫度提高了6 ℃，半衰期在55 ℃和60 ℃分別提高12.5倍和10倍，催化效率 (kcat/Km) 與野生型AuFaeA相似。文獻(xiàn)[30]報(bào)道利用介孔二氧化硅材料作為固定支持物，通過物理吸附將FAE固定在介孔二氧化硅上，并通過改變支持孔徑、固定緩沖液和pH來優(yōu)化固定條件，實(shí)現(xiàn)最大負(fù)載和最大活性，在10次酯交換反應(yīng)后，保留了其20%以上的活性，Km不受固定化的影響，但是kcat減少了10倍。值得一提的是本文報(bào)道的基于foldon引導(dǎo)的寡聚化FAE 25 ℃半衰期提高55.5%，Km減小了3.42倍，催化效率提高了7.57倍。文獻(xiàn)中這些方法雖在不同程度上提高了酶活性，但是定點(diǎn)誘變需要對(duì)酶結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系有清楚的了解[32]，定向進(jìn)化需要一種簡(jiǎn)單而有效的高通量篩選方法[33]，化學(xué)修飾可能通過改變活性位點(diǎn)中的活性構(gòu)象或必需殘基而引起酶活性的意外喪失[34]。

表4 分子工程改造對(duì)FAE性質(zhì)的影響Table 4 The effect of molecular engineering on the properties of FAE

本文的方法條件溫和，操作簡(jiǎn)單，并不需要從突變文庫(kù)篩選目標(biāo)酶。與mon-FAE相比，multi-FAE底物親和力以及催化效率顯著提高，這可能是由于寡聚化結(jié)構(gòu)域foldon具有高固定濃度從而減少焓相互作用，加速了催化效率[16]，且寡聚化酶分子的局部濃度增加，也加速了活性位點(diǎn)和底物的接觸[35]。但是很遺憾，因?yàn)榭臻g位阻作用，pre-olig-FAE未完全形成寡聚化，pre-olig-FAE與olig-FAE中都含有His標(biāo)簽，且兩者的相對(duì)分子質(zhì)量相差僅僅66 kDa，表達(dá)量也有限，本實(shí)驗(yàn)室目前還無法將olig-FAE純化，但multi-FAE因含有寡聚化的olig-FAE，與mon-FAE相比，酶催化效率已有很大的提高。本課題組前期也將foldon結(jié)構(gòu)域與分子量較小且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的木聚糖酶和地衣多糖酶分別在原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行融合表達(dá)，酶的kcat/Km分別提高了4.2倍和3.0倍[36]。此次，本課題組將foldon結(jié)構(gòu)域與分子量較大且結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜的FAE在真核表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)，結(jié)果表明，目標(biāo)酶催化效率有很大提高，進(jìn)一步表明該方法有望成為一個(gè)提高酶催化性能的通用且高效的方法，其操作簡(jiǎn)單，無需事先詳細(xì)了解酶的3D結(jié)構(gòu)，具有良好的應(yīng)用前景，值得深入研究。

4 結(jié)論

mon-FAE以及pre-olig-FAE在P.pastorisGS115中成功表達(dá)，且含有由foldon引發(fā)寡聚化FAE的multi-FAE較mon-FAE的比活、底物親和力以及催化效率顯著提高。與mon-FAE相比，multi-FAE的最適溫度及溫度穩(wěn)定性未受到太大影響。綜上所述，foldon結(jié)構(gòu)域可提高FAE催化性能，是一種改造酶的簡(jiǎn)單高效方法。