KaiA調(diào)控藍(lán)藻生物鐘的分子機(jī)制研究進(jìn)展

李金奎，曹春雨，喻玲玲，劉森

1 三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002

2 湖北工業(yè)大學(xué) 教育部發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068

晝夜節(jié)律現(xiàn)象廣泛存在于生物體中，即使簡(jiǎn)單的原核生物藍(lán)藻也表現(xiàn)出晝夜節(jié)律行為。生物體晝夜節(jié)律受到體內(nèi)生物鐘的調(diào)控，藍(lán)藻生物鐘是目前已知的最簡(jiǎn)單的生物鐘，也是生物鐘分子機(jī)制研究中最重要的模型之一。藍(lán)藻生物鐘系統(tǒng)主要包括輸入途徑、核心振蕩器和輸出途徑3部分。核心振蕩器是藍(lán)藻生物鐘的關(guān)鍵部分，它不同于DNA轉(zhuǎn)錄和RNA翻譯所形成的負(fù)反饋振蕩器，屬于翻譯后振蕩器[1]。更為重要的是，藍(lán)藻生物鐘的核心振蕩器是迄今為止唯一能僅通過將其組成蛋白 (KaiA、KaiB、KaiC三種蛋白) 混合在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中即可實(shí)現(xiàn)體外重建的生物振蕩器。因此，藍(lán)藻生物鐘核心振蕩器一直是生物鐘研究的熱點(diǎn)，而解析其組成蛋白KaiA、KaiB、KaiC的結(jié)構(gòu)和闡明其分子機(jī)制具有重要意義。

文中圍繞藍(lán)藻生物鐘核心振蕩器及其組成蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，針對(duì)時(shí)鐘蛋白KaiA調(diào)節(jié)KaiC的酶活性、介導(dǎo)核心振蕩器的時(shí)相重置、與CikA競(jìng)爭(zhēng)KaiB的結(jié)合位點(diǎn)等方面對(duì)近年來(lái)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述 (圖1)。

1 藍(lán)藻生物鐘核心振蕩器簡(jiǎn)介

生物鐘的分子機(jī)制一直以來(lái)都是研究者們感興趣的內(nèi)容。以往的研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋環(huán)路(Transcriptional/translational feedback loop，TTFL)是唯一的生物節(jié)律產(chǎn)生機(jī)制[2]。但在2005年，Kondo等首次證明在藍(lán)藻的生物鐘體系中存在獨(dú)立于基因轉(zhuǎn)錄的生物節(jié)律起搏器[3]——翻譯后振蕩器 (Post-translational oscillation，PTO)[4-5]。后期研究表明，藍(lán)藻的生物鐘由PTO和TTFL兩部分組成，PTO是核心起搏器，TTFL則負(fù)責(zé)生物鐘的輸入和輸出途徑。PTO 和TTFL共同調(diào)節(jié)藍(lán)藻的生物鐘系統(tǒng)[6]。

圖1 KaiA調(diào)控藍(lán)藻生物鐘的分子機(jī)制總體圖示Fig.1 Overall diagram of the molecular mechanism that KaiA regulation cyanobacterial clock.

藍(lán)藻生物鐘PTO部分的核心，由一簇稱為kaiABC的基因所編碼的生物鐘蛋白組成。該基因簇包括kaiA、kaiB和kaiC三個(gè)基因[7]。kaiABC基因簇所編碼的蛋白KaiA、KaiB和KaiC是藍(lán)藻生物鐘核心振蕩器的主要組成成分。藍(lán)藻生物鐘核心振蕩器產(chǎn)生晝夜節(jié)律的計(jì)時(shí)機(jī)制表現(xiàn)在2個(gè)方面：基因簇轉(zhuǎn)錄水平呈高低的節(jié)律性變化；KaiA和KaiB共同作用使KaiC蛋白的磷酸化水平表現(xiàn)出節(jié)律性變化[8]。

2 藍(lán)藻生物鐘核心振蕩器組成蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)

藍(lán)藻生物鐘核心振蕩器的組成蛋白KaiA、KaiB、KaiC之間存在多種相互作用，從而控制KaiC的磷酸化水平呈現(xiàn)節(jié)律性振蕩。Kai蛋白中的任意兩種均可以相互作用，任何Kai蛋白的缺失將使核心振蕩器喪失功能，3種Kai蛋白同時(shí)存在時(shí)核心振蕩器才能正常運(yùn)行[9]。在此基礎(chǔ)上，研究人員對(duì)KaiA、KaiB和KaiC的空間結(jié)構(gòu)及功能特點(diǎn)進(jìn)行了大量研究。

2.1 核心振蕩器組成蛋白KaiC的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)

KaiC的主要形式為6個(gè)單體組成的同源六聚體結(jié)構(gòu)。每個(gè)KaiC單體具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是C端的CII結(jié)構(gòu)域和N端的CI結(jié)構(gòu)域。KaiC蛋白同時(shí)兼?zhèn)渥约っ?(Autokinase) 和自磷酸酶(Autophosphatase) 活性。激酶可以使KaiC自身亞基相互磷酸化，磷酸酶則推動(dòng)KaiC去磷酸化。激酶和磷酸酶同時(shí)存在是KaiC發(fā)生磷酸化-去磷酸化周期性變化的基礎(chǔ)[10]。KaiC的CII結(jié)構(gòu)域上存在2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別是431位的絲氨酸殘基和432位的蘇氨酸殘基。因此，每個(gè)KaiC單體就具備4種可能的磷酸化狀態(tài)，且能夠按照順序磷酸化[11]。

2.2 核心振蕩器組成蛋白KaiB的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)

KaiB蛋白有單體、二聚體、四聚體甚至多聚體等多種狀態(tài)。在整個(gè)振蕩周期中，KaiB蛋白會(huì)根據(jù)KaiC蛋白磷酸化狀態(tài)的改變形成不同的聚合體。KaiB蛋白在這些不同的聚合體之間轉(zhuǎn)換狀態(tài)，以此來(lái)適應(yīng)KaiC的狀態(tài)進(jìn)而與KaiC結(jié)合[12]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，KaiB蛋白會(huì)在2個(gè)不同的三維折疊之間轉(zhuǎn)換，從而提供時(shí)間延遲并使該振蕩器的時(shí)相與地球旋轉(zhuǎn)的時(shí)相相匹配[13]。

2.3 核心振蕩器組成蛋白KaiA的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)

KaiA蛋白有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：放大振蕩幅度的N端結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生節(jié)律性振蕩的C端結(jié)構(gòu)域，以及將N端和C端連接的中間結(jié)構(gòu)域。

KaiA的N端結(jié)構(gòu)域一般指第1-135位氨基酸殘基。N端一半的結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出與傳統(tǒng)信號(hào)接收結(jié)構(gòu)域類似的折疊。但是與傳統(tǒng)信號(hào)接收結(jié)構(gòu)域相比，KaiA的N端結(jié)構(gòu)域缺乏磷酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)所需的保守Asp殘基，所以KaiA的N端結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是偽受體結(jié)構(gòu)域[14]。

KaiA的C端結(jié)構(gòu)域 (第180-284位氨基酸殘基) 高度保守。該結(jié)構(gòu)域由4個(gè)α螺旋組成，負(fù)責(zé)KaiA的同源二聚化，介導(dǎo)KaiA與KaiC相互作用，促進(jìn)KaiC的磷酸化[15]。

連接N端和C端的中間結(jié)構(gòu)域，包含第136-179位的氨基酸殘基。最近的研究表明中間結(jié)構(gòu)域會(huì)影響KaiA的活性狀態(tài)[16]。

3 核心振蕩器組成蛋白KaiA的調(diào)控機(jī)制

對(duì)于Kai蛋白相互作用的研究表明，KaiA刺激KaiC發(fā)生磷酸化，而KaiB的主要作用是結(jié)合磷酸化狀態(tài)的KaiC，通過阻止KaiA與KaiC的作用，從而促進(jìn)KaiC去磷酸化[9]。在核心振蕩器的組成蛋白中，KaiC能發(fā)生磷酸化水平的變化，所以KaiC是振蕩器的核心。在整個(gè)振蕩周期中，KaiA直接作用于KaiC來(lái)調(diào)控KaiC的磷酸化狀態(tài)，而KaiB主要是通過影響KaiA來(lái)間接調(diào)控KaiC的磷酸化狀態(tài)[17]。因此，較多的研究集中于闡明KaiA對(duì)核心振蕩器的調(diào)控機(jī)制。

3.1 KaiA通過調(diào)節(jié)KaiC多種酶的活性影響核心振蕩器節(jié)律

KaiC兼具激酶、磷酸酶以及ATP酶等多種酶活性，并通過這些酶活性的共同作用調(diào)控核心振蕩器的節(jié)律[18]。核心振蕩器的節(jié)律表現(xiàn)在KaiC磷酸化水平的高低變化。通過體外重建實(shí)驗(yàn)和復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析，研究人員發(fā)現(xiàn)KaiA通過C末端與KaiC直接作用，這種相互作用能調(diào)節(jié)KaiC多種酶的活性，進(jìn)而改變KaiC磷酸化水平的高低，從而影響核心振蕩器的節(jié)律[19]。

3.1.1 KaiA調(diào)節(jié)KaiC激酶和磷酸酶活性影響核心振蕩器節(jié)律的產(chǎn)生

KaiC的C末端488-497殘基形成的A-Loop區(qū) (簡(jiǎn)稱A環(huán)) 有埋藏和暴露2種狀態(tài)。A環(huán)的埋藏和暴露狀態(tài)決定了KaiC自磷酸酶和自激酶的活性水平，進(jìn)而影響KaiC的磷酸化水平[20]。當(dāng)A環(huán)處于埋藏狀態(tài)，KaiC自磷酸酶活性較高；當(dāng)A環(huán)暴露時(shí)，KaiC自激酶活性占優(yōu)勢(shì)。在解析出的KaiC晶體結(jié)構(gòu)中，A環(huán)處于埋藏狀態(tài)，此時(shí)ATP的γ-磷酸基團(tuán)與磷酸化位點(diǎn)的距離較遠(yuǎn)，KaiC難以發(fā)生磷酸化[21]。所以，KaiC自身的磷酸酶較激酶活性占優(yōu)勢(shì)，KaiC本身具有低水平的自激酶活性。

當(dāng)KaiA、KaiC共同存在時(shí)，KaiA通過C末端直接結(jié)合KaiC的A環(huán)并穩(wěn)定A環(huán)的暴露狀態(tài)。A環(huán)的暴露使ATP更靠近磷酸化位點(diǎn)，KaiC自激酶的活性增加，伴隨KaiC磷酸化水平升高。當(dāng)A環(huán)無(wú)法穩(wěn)定在暴露狀態(tài)，ATP的γ-磷酸基團(tuán)在空間上將遠(yuǎn)離磷酸化位點(diǎn)S431和T432，KaiC自磷酸酶活性占據(jù)優(yōu)勢(shì)，伴隨KaiC磷酸化水平的降低。KaiA的C末端與KaiC的C末端通過結(jié)合和解離作用來(lái)決定KaiC磷酸酶和自激酶活性的傾向，產(chǎn)生KaiC磷酸化水平的高低變化，從而產(chǎn)生振蕩的節(jié)律 (圖2)[22]。通過實(shí)時(shí)量化KaiA與KaiC在亞秒級(jí)時(shí)間尺度上的相互作用后發(fā)現(xiàn)，KaiA對(duì)KaiC激酶的刺激作用為瞬時(shí)動(dòng)態(tài)過程，且KaiC的磷酸化對(duì)KaiA的結(jié)合存在著反饋機(jī)制。隨著KaiC磷酸化水平的升高，KaiA對(duì)KaiC激酶的刺激作用逐漸減弱。通過這種瞬時(shí)動(dòng)態(tài)作用和反饋機(jī)制，可以穩(wěn)定振蕩體系不被體內(nèi)的其他代謝活動(dòng)所干擾[23]。

上述過程中，KaiB不直接與A環(huán)相互作用，也不影響KaiC自身磷酸化。相反，KaiB通過使KaiA失活而起作用，從而使高磷酸化狀態(tài)KaiC的磷酸酶活性占據(jù)優(yōu)勢(shì)，發(fā)生去磷酸化[24]。

3.1.2 KaiA調(diào)節(jié)KaiC的ATP酶活性影響核心振蕩器的周期

從結(jié)構(gòu)上分析，KaiC的N和C末端結(jié)構(gòu)域均含有典型的Walker’s基序。該基序是一種保守的氨基酸序列，廣泛存在于各種GTP結(jié)合蛋白中，可以結(jié)合ATP[25]。研究表明，KaiC具有弱的ATP酶活性，并且ATP酶的活性會(huì)發(fā)生節(jié)律性波動(dòng)，更為重要的是，KaiC的ATP酶活性對(duì)周期的形成具有重要意義[26-27]。

研究表明，KaiC的去磷酸化通過磷酸化反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)而發(fā)生，振蕩節(jié)律由KaiC可逆自磷酸化反應(yīng)的周期性變化產(chǎn)生[28]。當(dāng)KaiC單獨(dú)存在時(shí)，其ATP酶活性保持恒定。當(dāng)KaiA、KaiC共同存在時(shí)，KaiA刺激KaiC的ATP酶活性升高，加速KaiC結(jié)合的ADP與外源ATP交換來(lái)促進(jìn)正向反應(yīng)。而KaiB會(huì)抑制KaiA的作用致使KaiC的ATP酶活性降低，進(jìn)而保留KaiC結(jié)合的ADP，從而促進(jìn)逆反應(yīng)。因?yàn)镵aiA與KaiC的A環(huán)相互作用，而A環(huán)靠近CII結(jié)構(gòu)域的ATP酶活性位點(diǎn)，所以KaiA可能通過調(diào)節(jié)A環(huán)的狀態(tài)來(lái)影響ATP酶的活性，進(jìn)而決定可逆自磷酸化反應(yīng)的方向[29]。

圖2 KaiA通過影響KaiC的A-Loop調(diào)節(jié)KaiC的酶活性Fig.2 KaiA regulates the enzymatic activities of KaiC by affecting the A-Loop.

綜上所述，KaiA通過調(diào)節(jié)KaiC的ATP酶、激酶和磷酸酶活性來(lái)影響核心振蕩器的節(jié)律。

3.2 KaiA通過活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)換調(diào)控核心振蕩器的時(shí)相

雖然單個(gè)Kai蛋白的結(jié)構(gòu)和功能被廣泛研究，但是Kai蛋白之間動(dòng)態(tài)作用的機(jī)制仍存在眾多疑問。例如，KaiA與未磷酸化的KaiC結(jié)合的分子細(xì)節(jié)，以及KaiC由磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿チ姿峄癄顟B(tài)這一動(dòng)態(tài)過程中KaiA作用的分子機(jī)制均不清楚。近幾年來(lái)的研究在KaiA與KaiC之間的動(dòng)態(tài)相互作用方面取得了一些新的進(jìn)展。

3.2.1 KaiA在Kai復(fù)合物中轉(zhuǎn)變活性狀態(tài)

研究表明，在整個(gè)振蕩周期中，KaiA的活性狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變[30]。KaiC未發(fā)生磷化時(shí)，KaiA處于活性狀態(tài)，通過C末端結(jié)合KaiC刺激KaiC發(fā)生磷酸化[15]。隨著KaiC磷酸化水平的升高，KaiA的刺激能力減弱，當(dāng)磷酸化的KaiC與KaiB結(jié)合時(shí)，KaiA對(duì)KaiC的刺激能力進(jìn)一步減弱[31]。KaiA、KaiB和KaiC在相互作用形成KaiABC三元復(fù)合物后，KaiA轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚誀顟B(tài)，并且非活性狀態(tài)KaiA的出現(xiàn)啟動(dòng)了KaiC的去磷酸化。

在振蕩周期中，Kai蛋白以各種組合發(fā)生相互作用，重復(fù)裝配和分解形成同源和異源多聚Kai復(fù)合物。在磷酸化開始階段，KaiA迅速并反復(fù)與KaiC接觸促進(jìn)KaiC磷酸化，這種反復(fù)作用形成了動(dòng)態(tài)的KaiAC復(fù)合物，此時(shí)KaiA處于活性狀態(tài)。當(dāng)高磷酸化水平的KaiC出現(xiàn)后，KaiC結(jié)合KaiB。KaiC與KaiB的結(jié)合則使KaiA逐漸失去活性狀態(tài)，KaiC的去磷酸化階段開始啟動(dòng)[24]。當(dāng)穩(wěn)定的KaiABC三元復(fù)合物形成時(shí)，該復(fù)合物會(huì)阻止KaiA與KaiC的反復(fù)作用，KaiA呈現(xiàn)為非活性狀態(tài)[32]。當(dāng)KaiC的磷酸化水平回降時(shí)，KaiB與KaiC分離，KaiA也被分離出來(lái)并恢復(fù)活性狀態(tài)(圖3)[30]。在體外振蕩期間，KaiA有節(jié)律性地在不同的復(fù)合物中轉(zhuǎn)變活性狀態(tài)[33]。

圖3 KaiA在活性態(tài)與非活性態(tài)之間轉(zhuǎn)換進(jìn)而調(diào)控核心振蕩器的時(shí)相Fig.3 KaiA converts between active and inactive states to regulate the phase of the core oscillator.

3.2.2 活性態(tài)KaiA與KaiC形成動(dòng)態(tài)變化的結(jié)合構(gòu)象介導(dǎo)KaiC的磷酸化

研究者們?cè)贙aiA與未磷酸化的KaiC結(jié)合介導(dǎo)KaiC發(fā)生磷酸化的分子機(jī)制上存在著不同的觀點(diǎn)。KaiC的C末端氨基酸序列無(wú)固定構(gòu)象，是一段無(wú)序區(qū)域，而KaiA通過其C末端結(jié)構(gòu)域與KaiC的該無(wú)序區(qū)域結(jié)合。電子顯微鏡分析KaiAC復(fù)合物的結(jié)果顯示：KaiA與KaiC的結(jié)合可以是“tethered”模型或者是“engaged”模型。在tethered模型中，KaiA被KaiC的C末端捕獲，但沒有與KaiC的CII結(jié)構(gòu)域的圓頂結(jié)構(gòu)直接接觸。在engaged模型中，KaiA接近并與KaiC-CII的圓頂結(jié)構(gòu)直接接觸[34]。通過NMR測(cè)定的KaiAC復(fù)合物的結(jié)構(gòu)顯示：KaiC的C末端衍生肽采用無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象結(jié)合在KaiA同源二聚體的C末端結(jié)構(gòu)域之間的凹陷空間中[35]。通過X射線測(cè)定的KaiAC復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示：KaiC的C末端衍生肽采用α螺旋構(gòu)象與KaiA結(jié)合[15]。幾種技術(shù)測(cè)定的結(jié)構(gòu)完全不同，無(wú)法確定KaiA-KaiC相互作用的正確模型。

本課題組利用“second-site suppressor”策略來(lái)研究KaiA和KaiC的相互作用機(jī)制，使用蛋白質(zhì)序列分析以及誘變研究的手段，將所得數(shù)據(jù)與之前所報(bào)道的數(shù)據(jù)相結(jié)合，并建立了數(shù)學(xué)模型解釋。本課題組的研究提出，KaiA和KaiC的固有無(wú)序尾部在結(jié)合過程中通過構(gòu)象選擇和誘導(dǎo)擬合經(jīng)歷顯著的結(jié)構(gòu)變化，兩者間的作用為動(dòng)態(tài)過程，形成不同的結(jié)合構(gòu)象[4]。這包含了之前所用技術(shù)測(cè)定的結(jié)合構(gòu)象。因?yàn)镵aiC的C末端尾部是一個(gè)本質(zhì)上無(wú)序區(qū)域，它可以采用不同的構(gòu)象與蛋白質(zhì)配偶體結(jié)合。所以，KaiC的C末端尾部在與KaiA作用時(shí)具有不同的構(gòu)象是合理的。NMR結(jié)構(gòu)中測(cè)定的構(gòu)象可能是正在進(jìn)行“蛋白質(zhì)捕獲”這一過程，X射線測(cè)定的折疊構(gòu)象可能是真正發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)。通過這種方式，KaiA與KaiC的相互作用可以被精細(xì)調(diào)節(jié)，并具有高特異性。

3.2.3 KaiA通過自我構(gòu)象抑制切換活性狀態(tài)介導(dǎo)KaiC的去磷酸化

近兩年的研究也報(bào)道了KaiBC復(fù)合物使KaiA失活的具體細(xì)節(jié)。KaiA的中間結(jié)構(gòu)域曾被認(rèn)為起放大振幅和作為KaiB結(jié)合位點(diǎn)的作用[36-37]，而本課題組通過設(shè)計(jì)不同形式的KaiA蛋白，并結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)分析，提出KaiA的中間結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生不對(duì)稱的構(gòu)象變化，并使KaiA在活性和非活性形式之間發(fā)生可逆性轉(zhuǎn)換[38]。在KaiC磷酸化期間，KaiA二聚體的C末端結(jié)構(gòu)域使用對(duì)稱位點(diǎn)結(jié)合KaiC的CII結(jié)構(gòu)域的C末端序列。KaiC磷酸化水平的升高促使KaiBC復(fù)合物的形成，進(jìn)而和KaiA形成KaiABC復(fù)合物。晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)指出，KaiA二聚體在與KaiBC復(fù)合物結(jié)合時(shí)經(jīng)歷較大的構(gòu)象變化，KaiA中間結(jié)構(gòu)域的β折疊發(fā)生旋轉(zhuǎn)，并與KaiB的一個(gè)β折疊形成反向平行的β折疊結(jié)構(gòu)。同時(shí)，KaiA中間結(jié)構(gòu)域的α螺旋向下旋轉(zhuǎn)到自身二聚體界面上的KaiC結(jié)合位點(diǎn)，從而阻斷KaiC蛋白CII結(jié)構(gòu)域的C末端多肽與KaiA的結(jié)合[30]。因此，通過遠(yuǎn)程變構(gòu)機(jī)制，KaiA上的2個(gè)KaiC結(jié)合位點(diǎn)在自我抑制構(gòu)象中被有效阻斷，伴隨KaiC去磷酸化階段的啟動(dòng)。

本課題組的研究結(jié)果與晶體結(jié)構(gòu)及核磁共振的數(shù)據(jù)共同表明，KaiA處于活性和非活性構(gòu)象的動(dòng)態(tài)平衡中，KaiB會(huì)誘導(dǎo)KaiA的自我構(gòu)象抑制。因此，KaiA通過自我構(gòu)象抑制的方式切換活性狀態(tài)從而調(diào)控振蕩器的時(shí)相。

3.3 KaiA與CikA競(jìng)爭(zhēng)KaiB同一結(jié)合位點(diǎn)影響核心振蕩器的信號(hào)傳輸

3.3.1 信號(hào)傳輸?shù)鞍證ikA的結(jié)構(gòu)和功能

CikA蛋白在核心振蕩器的信號(hào)輸入和輸出途徑中都發(fā)揮重要作用，它與信號(hào)輸出蛋白SasA屬于同一蛋白激酶家族，是組氨酸蛋白激酶和自磷酸化酶[39]。CikA具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：GAF結(jié)構(gòu)域，組氨酸蛋白激酶 (HPK) 結(jié)構(gòu)域和偽受體(PSR) 結(jié)構(gòu)域。CikA的N端結(jié)構(gòu)域與信號(hào)接受結(jié)構(gòu)域類似，提示該結(jié)構(gòu)域可能起接收信號(hào)的作用。CikA的C端PsR結(jié)構(gòu)域會(huì)封閉HPK結(jié)構(gòu)域上的磷酸化位點(diǎn)，從而阻礙了CikA發(fā)生磷酸化。當(dāng)PsR結(jié)構(gòu)域與S-KaiC (KaiC僅在S431位點(diǎn)磷酸化)相互作用時(shí)，HPK結(jié)構(gòu)域的限制將被解除，CikA發(fā)生磷酸化。磷酸化的CikA充當(dāng)RpaA的磷酸酶進(jìn)而影響基因的節(jié)律性表達(dá)[40]。

3.3.2 KaiA與CikA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合KaiBC復(fù)合物的相同位點(diǎn)

CikA可以感知細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，并且通過與KaiABC蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合，重置基于KaiABC的晝夜節(jié)律振蕩器[41]。KaiB與KaiC的混合物可以激活使RpaA去磷酸化的CikA的磷酸酶活性，間接說明了KaiBC復(fù)合物可以與CikA結(jié)合[13]。晶體結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)證實(shí)了CikA的PsR接收域直接與 KaiBfs-KaiC 復(fù)合物相互作用(KaiBfs為折疊轉(zhuǎn)換態(tài)的KaiB)。KaiBfs-KaiC復(fù)合物也會(huì)與KaiA相互作用，將KaiA穩(wěn)定在自我抑制構(gòu)象，鎖定KaiA處于非活性的狀態(tài)。在形成的PsR-KaiB-KaiC三元復(fù)合物中，CikA的PsR結(jié)構(gòu)域的β2折疊和KaiBfs的β2折疊相互平行作用。在KaiA-KaiB-KaiC三元復(fù)合物中，KaiBfs使用相同的β2折疊來(lái)結(jié)合KaiA的β2折疊。突變KaiBfs的β2鏈中的關(guān)鍵殘基，同時(shí)降低了其與KaiA及PsR結(jié)構(gòu)域的相互作用[30]。

3.3.3 KaiA與CikA的競(jìng)爭(zhēng)影響振蕩器信號(hào)的傳輸

如上所述，KaiA和CikA的PsR結(jié)構(gòu)域結(jié)合在KaiB的相同結(jié)合位點(diǎn)。KaiBfs-KaiC會(huì)實(shí)現(xiàn)對(duì)KaiA的滅活，進(jìn)而啟動(dòng)KaiC的去磷酸化。CikA通過與KaiA競(jìng)爭(zhēng)KaiB上的同一位點(diǎn)來(lái)激活使RpaA去磷酸化的磷酸酶活性。通過這種競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，可以將KaiC去磷酸化的信息傳輸?shù)较掠巍?/p>

KaiA和CikA的N端在結(jié)構(gòu)上均屬于類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在振蕩器的輸入途徑中，兩者的N端結(jié)構(gòu)域都對(duì)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)敏感[42]。而在輸出途徑中，KaiA和CikA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一位點(diǎn)，KaiB和SasA也是如此。SasA和CikA又會(huì)在輸出途徑中共同調(diào)節(jié)RpaA的活性進(jìn)而影響下游的節(jié)律信號(hào)。因此，信號(hào)輸入、中心振蕩器和信號(hào)輸出形成緊密耦合。

4 總結(jié)與展望

生物鐘的分子機(jī)制被廣泛研究，目前可將其分為TTFL和PTO這2種。相比TTFL，PTO更為廣泛存在，在古菌、細(xì)菌、真核生物 (包括人)中都有發(fā)現(xiàn)[43]。因此，PTO機(jī)制可能是物種間更為保守的生物振蕩機(jī)制。最早確認(rèn)的PTO，是藍(lán)藻中基于KaiA、KaiB、KaiC三個(gè)蛋白質(zhì)的生物鐘體系[3]。KaiABC體系并不是廣泛存在跨物種保守的PTO。相比KaiABC，以過氧化物氧還蛋白為核心的氧化-還原節(jié)律性循環(huán)組成的PTO更為廣泛和保守存在[44]。但是，KaiABC是目前唯一能在體外重現(xiàn)的PTO體系，并且生物鐘系統(tǒng)的自我維持性、周期性及溫度補(bǔ)償性都可以在KaiABC中重現(xiàn)。所以，對(duì)生物鐘PTO機(jī)制的研究中，藍(lán)藻生物鐘是最有利的研究模型之一。

雖然藍(lán)藻生物鐘是目前已知的最簡(jiǎn)單的生物鐘，但由KaiA、KaiB、KaiC蛋白組成的藍(lán)藻生物鐘核心振蕩器的動(dòng)態(tài)機(jī)制十分復(fù)雜。目前對(duì)KaiA作用機(jī)制的研究揭示了其影響輸入、輸出信號(hào)，并調(diào)控核心振蕩器，維持生物振蕩的精確與穩(wěn)定。對(duì)KaiA作用機(jī)制的研究仍存在一些需要解決的問題：例如KaiA的單體-二聚體轉(zhuǎn)變是否在振蕩系統(tǒng)中起重要作用；KaiA的N端結(jié)構(gòu)域在動(dòng)態(tài)周期中發(fā)揮怎樣的功能；外界信號(hào)是否通過調(diào)控KaiA的N端結(jié)構(gòu)域達(dá)到對(duì)該振蕩體系進(jìn)行調(diào)控；KaiA如何通過與細(xì)胞的代謝活動(dòng)相關(guān)聯(lián)進(jìn)而穩(wěn)定核心振蕩器。對(duì)于這些問題的解決，可能需要通過生物學(xué)、物理學(xué)、數(shù)學(xué)分析等各種手段獲取Kai蛋白在動(dòng)態(tài)作用過程中的相關(guān)信息。利用X射線晶體衍射和電鏡三維重構(gòu)技術(shù)測(cè)定生物鐘蛋白的三維結(jié)構(gòu)有助于我們了解生物鐘蛋白相互作用的分子細(xì)節(jié)。生物鐘蛋白的進(jìn)化樹分析也能幫助我們理解不同物種間生物鐘的潛在聯(lián)系和機(jī)制。

這些問題的解決不僅對(duì)理解藍(lán)藻的生物鐘運(yùn)行機(jī)制有重要意義，同時(shí)能以此為基礎(chǔ)去研究更為復(fù)雜的真核生物如哺乳動(dòng)物的生物鐘，進(jìn)而為生物鐘的應(yīng)用提供科學(xué)的指導(dǎo)。比如，哺乳動(dòng)物因生物鐘的紊亂造成肝臟代謝的異常，可以根據(jù)哺乳動(dòng)物生物鐘所處的時(shí)相特點(diǎn)給與相應(yīng)劑量的藥物治療。腸道細(xì)菌也有明顯的生物節(jié)律，腸道細(xì)菌的代謝紊亂將加重營(yíng)養(yǎng)吸收方面的負(fù)擔(dān)，理解腸道細(xì)菌的生物節(jié)律將能為食物的攝取和營(yíng)養(yǎng)的吸收提供科學(xué)的依據(jù)。穩(wěn)定的生物節(jié)律能讓植物更好地進(jìn)行光合作用，適應(yīng)土壤環(huán)境，從而提高植物農(nóng)作物的產(chǎn)量，對(duì)生物鐘系統(tǒng)與外界環(huán)境信號(hào)聯(lián)系機(jī)制的研究將為生物鐘系統(tǒng)的穩(wěn)定提供清晰的見解。所以，生物鐘系統(tǒng)的研究在疾病預(yù)防、農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)乃至進(jìn)化層面具有重大意義。