小鼠原代哺乳期乳腺細(xì)胞中TSH對(duì)鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)節(jié)作用

史新竹，申紅梅

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110034；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心地方病控制中心）

哺乳期婦女適宜的碘營(yíng)養(yǎng)，是下一代在胎兒期和出生后早期腦發(fā)育的重要保障。哺乳期婦女碘營(yíng)養(yǎng)不足，勢(shì)必會(huì)給下一代帶來(lái)因碘缺乏所致的各種危害。鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium iodide symporter，NIS）是甲狀腺攝取碘的生理基礎(chǔ)，介導(dǎo)碘轉(zhuǎn)運(yùn)至甲狀腺濾泡細(xì)胞內(nèi)合成甲狀腺激素。NIS也是哺乳期乳腺重要的攝碘蛋白，但僅存在于妊娠期和哺乳期的乳腺中［1］。甲狀腺NIS活性受到促甲狀腺激素（TSH）、碘、雌激素等的影響。TSH主要調(diào)控甲狀腺的功能和碘的攝取，是影響NIS表達(dá)和定位的主要因素，對(duì)NIS基因的表達(dá)起到促進(jìn)作用［2］。目前公認(rèn)的甲狀腺NIS調(diào)控信號(hào)通路是環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA），主要受到TSH調(diào)節(jié)，屬于正向調(diào)節(jié)通路［3］。在一定程度上TSH的磷酸化模式依賴于PKA調(diào)節(jié)完成［4］。乳腺是對(duì)激素非常敏感的器官，內(nèi)分泌功能改變和腺體疾病均能對(duì)其產(chǎn)生直接影響。本課題組前期觀察不同碘水平下哺乳期乳腺攝碘調(diào)節(jié)因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，哺乳期乳腺NIS水平的調(diào)節(jié)因素與甲狀腺相似［5］。為探討TSH對(duì)哺乳期乳腺NIS表達(dá)中發(fā)揮的作用，本研究在原代哺乳期乳腺細(xì)胞中觀察了TSH對(duì)NIS表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 TSH（美國(guó)Sigma公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），PKA抑制劑（H-89）（美國(guó)Cayman Chemical公司），促甲狀腺激素受體（TSHR）抗體、NIS抗體（美國(guó)ABBIOTEC公司）、β-actin單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Odyssey紅外線成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），凝膠電泳儀（美國(guó)Pharmacia Biotech公司），酶標(biāo)儀（上海天呈科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)原代哺乳期乳腺細(xì)胞 BALB/c小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）喂飼普通飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司)，飲用蒸餾水。當(dāng)雌性小鼠體重達(dá)到20 g時(shí)，挑選皮毛光滑無(wú)病雌性小鼠與成熟雄性小鼠按5∶1比例合籠交配。受孕后分籠觀察其生產(chǎn)情況。

提取哺乳期BALB/c小鼠乳腺組織于DMEM/F12培養(yǎng)基中洗滌，制備組織勻漿。膠原酶消化后，置于37℃震蕩孵育箱內(nèi)消化15～20 min，120 r/min。研磨過濾未消化完全的組織，加DMEM/F12培養(yǎng)基于濾液中終止消化，制成細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度，置于培養(yǎng)瓶中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)并鋪滿瓶底90%后傳代。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 第二代細(xì)胞分組干預(yù)。將TSH用去離子水稀釋配制成不同劑量。TSH不同劑量組：分別用不同劑量 TSH（0、0.01、0.03、0.05 μg/ml）干預(yù)細(xì)胞 24 h；沉默分組：50 nmol/L TSHR siRNA組、陰性對(duì)照組和平行空白組；PKA抑制組：H-89抑制PKA 30 min后加入0.03 μg/ml TSH干預(yù)24 h，同步設(shè)置0.03 μg/ml TSH干預(yù)組和空白組。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)原代哺乳期乳腺細(xì)胞NIS mRNA的表達(dá) 無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，PBS洗滌6孔板中細(xì)胞3次，預(yù)冷Trizol裂解細(xì)胞3 min；三氯甲烷分離裂解細(xì)胞，移液器吸取中間清亮水相部分，加入與吸取液體等量異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，留取沉淀；預(yù)冷75%乙醇洗滌RNA并測(cè)定RNA濃度；配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，在PCR梯度儀合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)。

反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃（NIS）／58℃（β-actin）退火20 s，72℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。引物見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.4 Western blot法檢測(cè)NIS蛋白的表達(dá) 細(xì)胞加入裂解液10 min，充分刮取蛋白，12 000 r/min離心20 min，收集上清蛋白，測(cè)蛋白濃度。電泳2 h，PVDF轉(zhuǎn)膜50 min，封閉液封閉1 h。分別用兔抗鼠NIS單抗（1∶400）和單抗β-actin（1∶1 000），4℃過夜。DAB顯色，GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)照相觀察。Gelpro軟件比較目的條帶相對(duì)灰度值。

1.3.5 TSHR基因沉默 使用優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，lipo2000用無(wú)血清的優(yōu)化培養(yǎng)基稀釋，孵育5 min后與siRNA混和，室溫孵育20 min，形成siRNA-lipo2000混和物。將siRNA-lipo2000混合液加入細(xì)胞，混和。置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，5 h后換成正常優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多個(gè)總體均數(shù)差異比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的TSH對(duì)原代哺乳期乳腺細(xì)胞NIS mRNA和蛋白表達(dá)的影響 4組NIS mRNA的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.51，P＜0.05），0.05 μg/ml TSH組的NIS mRNA表達(dá)量最高。4組NIS蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

表2 不同劑量TSH組NIS mRNA的表達(dá)水平比較（±s）

表2 不同劑量TSH組NIS mRNA的表達(dá)水平比較（±s）

注：與0.05 μg/ml TSH組比較，1）P＜0.05

F P TSH（μg/ml）0.05 0.03 0.01 0 n5 5 5 5 NIS mRNA 2.09±0.89 1.22±0.261）0.86±0.271）0.96±0.061）6.510.00

圖1 TSH不同劑量組NIS蛋白表達(dá)

2.2 TSHR siRNA沉默TSHR基因?qū)IS蛋白表達(dá)的影響 TSHR siRNA組、陰性對(duì)照組和空白組的NIS蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 沉默TSHR基因后NIS蛋白的表達(dá)

2.3 抑制PKA對(duì)哺乳期乳腺細(xì)胞NIS蛋白表達(dá)的影響 PKA抑制組、TSH組和空白組的NIS蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.45，P＜0.01），PKA抑制組NIS蛋白表達(dá)水平明顯低于TSH組和空白組（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 抑制PKA后NIS蛋白表達(dá)（±s）

表3 抑制PKA后NIS蛋白表達(dá)（±s）

注：與PKA抑制組比較，1）P＜0.05

組別PKA抑制組TSH組空白組n3 3 3 NIS蛋白0.29±0.05 0.41±0.021）0.39±0.011）F P 8.450.01

圖3 抑制PKA后NIS蛋白的表達(dá)

3 討論

NIS主要位于甲狀腺細(xì)胞基底外側(cè)膜上，介導(dǎo)碘的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，生產(chǎn)足夠的甲狀腺激素。有研究證實(shí)NIS在多個(gè)組織中表達(dá)，但僅在甲狀腺和哺乳期乳腺中處于高表達(dá)狀態(tài)［6］，這與哺乳期乳腺需碘量增大密切相關(guān)。

乳腺哺乳期攝碘量大幅增加，NIS在哺乳期乳腺細(xì)胞基底外側(cè)膜表達(dá)，從血液中吸取碘化物到乳汁中，高效積累碘化物。甲狀腺攝碘受到TSH嚴(yán)格調(diào)控，刺激NIS半衰期延長(zhǎng)。本研究應(yīng)用不同劑量TSH作用于哺乳期乳腺細(xì)胞，觀察到高濃度TSH對(duì)哺乳期乳腺細(xì)胞NIS的表達(dá)有一定調(diào)節(jié)作用，低濃度TSH作用不明顯。本研究還對(duì)與TSH結(jié)果的關(guān)鍵蛋白TSHR進(jìn)行沉默，但未觀察到細(xì)胞NIS水平的顯著變化。TSHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體，一旦與配體TSH結(jié)合，即起到連接細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境，向細(xì)胞內(nèi)部傳遞TSH所攜帶信息的作用。有研究顯示在哺乳期乳腺細(xì)胞中存在TSHR表達(dá)［7］，提示乳腺中NIS很可能受到TSH影響。此次TSHR沉默后未觀察到NIS水平變化，其原因可能是沉默過程中產(chǎn)生了RNA干擾的脫靶現(xiàn)象［8］，當(dāng)siRNA與靶位點(diǎn)序列完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，復(fù)合體直接切割靶標(biāo)mRNA，導(dǎo)致其被快速降解，其他可能原因需進(jìn)一步探討。

本研究抑制PKA活性后，抑制組NIS蛋白表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組，提示PKA作為重要的蛋白激酶在哺乳期乳腺細(xì)胞NIS調(diào)節(jié)過程中，起到上調(diào)NIS表達(dá)的作用。PKA是一種普遍存在于動(dòng)物體內(nèi)的蛋白激酶，且蛋白酶抑制劑可與PKA催化亞基結(jié)合抑制PKA活性。甲狀腺中TSH主要通過cAMP/PKA信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及NIS表達(dá)，PKA刺激NUE（NIS上游增強(qiáng)子），改變NIS表達(dá)［1］。

綜上所述，高濃度TSH對(duì)小鼠哺乳期乳腺細(xì)胞NIS表達(dá)具有一定調(diào)節(jié)作用；蛋白激酶PKA可上調(diào)NIS表達(dá)。