臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥分布及其碳青霉烯類耐藥基因研究

張薇娜，楊正海，張鵬*

（1.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗(yàn)科）

鮑曼不動(dòng)桿菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，屬于條件致病菌。該菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，主要引起呼吸道感染，亦可引發(fā)菌血癥、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)感染、呼吸機(jī)相關(guān)肺炎等［1］。近年來隨著抗生素的廣泛使用，各類細(xì)菌總體耐藥率在逐年上升［2］，尤其多重耐藥菌株的出現(xiàn)，增加了臨床抗菌治療的難度。鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)院環(huán)境中分布廣泛且長(zhǎng)期存活，極易造成危重患者感染，且住院患者之間的高流動(dòng)性，加速了病原菌的傳播和蔓延，及時(shí)監(jiān)測(cè)病原菌的耐藥總體情況對(duì)于醫(yī)源性感染的爆發(fā)和菌株耐藥發(fā)展顯得十分重要［3］。本研究對(duì)我院2018年住院患者感染的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行耐藥分布和耐藥基因檢測(cè)，以期為臨床合理用藥和醫(yī)院感染控制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 嚴(yán)格按照微生物標(biāo)本的采集規(guī)范，收集2018年1至12月蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院住院患者痰液標(biāo)本。

1.2 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 所有菌株經(jīng)培養(yǎng)分純后均采用法國(guó)bioMerieux VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行菌株鑒定，細(xì)菌鑒定卡批號(hào)（2410667203），質(zhì)控菌株采用衛(wèi)生部臨檢中心提供的大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923。受試菌株經(jīng)確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌后采用最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，細(xì)菌藥敏卡批號(hào)（1100868203）。細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照儀器使用說明書操作，結(jié)果按臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）2017、2018抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.3 耐藥基因擴(kuò)增 使用美國(guó)Bio-Rad Mycycler梯度PCR儀擴(kuò)增鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因，4對(duì)引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。20 μl反應(yīng)體系：dNTP 1 μl，10×buffer 2 μl，Taq 酶 0.5 μl，上下游引物各 1 μl，DNA 模板 2 μl，去離子水 13.5 μl。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共循環(huán)35次，72 ℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA marker對(duì)照確認(rèn)。

表1 PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鮑曼不動(dòng)桿菌的來源及耐藥分布 臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌共68株，重癥醫(yī)學(xué)科檢出率最高，其次為腫瘤科和呼吸內(nèi)科，鮑曼不動(dòng)桿菌在不同科室的感染檢出率構(gòu)成見表2。68株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常見藥物氨曲南、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、頭孢替坦、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、亞胺培南耐藥率分別為95.59%、48.53%、48.53%、48.53%、25.00%、95.59%、100%、48.53%、48.53%，見表3。

表2 2018年蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌來源科室

表3 2018年蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常見抗菌藥物的耐藥率（%）

2.2 碳青霉烯類耐藥基因檢測(cè) 33株耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌中OXA-23陽(yáng)性25株（75.8%）、OXA-24陽(yáng)性0株（0%）、OXA-51陽(yáng)性33株（100%）、OXA-58陽(yáng)性0株（0%），電泳結(jié)果見圖1。將鮑曼不動(dòng)桿菌分為耐碳青霉烯類組（CRAB）和敏感組（CSAB），耐藥基因檢測(cè)結(jié)果對(duì)比見表4，發(fā)現(xiàn)耐藥基因OXA-23在2組比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 部分菌株4種OXA酶基因PCR產(chǎn)物

表4 CRAB與CSAB對(duì)OXA耐藥基因的相關(guān)性分析

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌分布廣泛，主要存在于水體和土壤等潮濕環(huán)境中，該菌粘附力極強(qiáng)，可定植于正常人體皮膚、咽部、胃腸道等分泌物中，致病易感人群為老年患者、新生兒、手術(shù)創(chuàng)傷、氣管切開、廣譜抗菌藥物或免疫抑制劑應(yīng)用者，目前已是引發(fā)院內(nèi)感染的重要致病菌［4］。碳青霉烯類藥物可通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成促使細(xì)胞死亡，因此是治療鮑曼不動(dòng)桿菌的常用抗生素之一，然而由于臨床抗生素的不合理使用，致使耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌數(shù)量逐年增高［5］，臨床針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌治療一直是難題。根據(jù)2017年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率全國(guó)平均水平為56.1%，安徽高達(dá)68.1%［6］，耐藥情況十分嚴(yán)峻。

鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類藥物原因主要是產(chǎn)耐碳青霉烯酶，該酶根據(jù)Ambler分類法可分為3類：A類（絲氨酸蛋白酶）、B類（金屬酶）、D類（苯唑西林酶），鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯酶主要為B、D兩類酶，尤以D類酶能夠水解頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素而致菌株多重耐藥。本研究結(jié)果顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥分布與之前相關(guān)報(bào)道一致，即該菌對(duì)大多數(shù)抗生素呈現(xiàn)耐藥［7-8］。耐藥機(jī)制方面，研究表明OXA-51是鮑曼不動(dòng)桿菌天然存在的苯唑西林酶基因，種屬特異性較高［9］，此外OXA-23、OXA-24、OXA-58等常見耐藥基因也有檢出［10-12］。本研究結(jié)果顯示，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因主要是OXA-23和OXA-51型，檢出率分別為75.8%和100%，而碳青霉烯類敏感鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因主要是OXA-51型，檢出率也為100%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示OXA-23型是我院引起鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的主要因素，OXA-24有報(bào)道主要發(fā)現(xiàn)于歐洲德國(guó)、西班牙等地區(qū)［13］，本研究尚未發(fā)現(xiàn)有OXA-24型，且該型菌株同源性有待進(jìn)一步研究。除碳青霉烯類藥物以外，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類等其他藥物耐藥率也較高，與氨基糖苷類修飾酶、16S rRNA甲基化酶［14］及gyrA、parC基因突變［15］有關(guān)。鑒于鮑曼不動(dòng)桿菌的高耐藥率，近年來頭孢哌酮/舒巴坦、替加環(huán)素、多黏菌素應(yīng)用于臨床藥敏試驗(yàn)，且耐藥率不高［16］，可以考慮為耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌治療的良好選擇［17］，合理使用并加以推廣。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，本研究雖然發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類耐藥基因型主要是OXA-23和OXA-51型，但其他耐藥機(jī)制如產(chǎn)金屬酶［18］、ISAbla片段插入［19］、主動(dòng)外排泵等有待進(jìn)一步研究，且菌株來源時(shí)間僅為一年，沒有該菌在時(shí)間上的縱向比較結(jié)果和耐藥發(fā)展趨勢(shì)，今后可繼續(xù)開展此項(xiàng)研究指導(dǎo)臨床合理用藥和院內(nèi)感染監(jiān)控。

綜上所述，我院鮑曼不動(dòng)桿菌主要分布于重癥醫(yī)學(xué)科和腫瘤科，且耐藥情況十分嚴(yán)重，醫(yī)院應(yīng)強(qiáng)化抗菌藥物分級(jí)使用的管理，減緩多重耐藥菌株的產(chǎn)生，必要時(shí)可聯(lián)合替加環(huán)素、多黏菌素等新型抗菌藥物進(jìn)行治療［20-21］，院內(nèi)感染方面應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行手衛(wèi)生規(guī)范，做好多重耐藥菌的隔離防護(hù)措施，清潔工作環(huán)境并加強(qiáng)耐藥菌篩查，阻止多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)院的定植和傳播。