TBRG4在肺腺癌中的作用及其機(jī)制研究

葉 柯，鄭曉麗，葛 紅，李 雪，王 浩

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，河南 鄭州 450000

肺癌是目前臨床上最常見的惡性腫瘤，又稱為原發(fā)性支氣管肺癌。根據(jù)其形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特征，肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞癌（small cell lung cancer，SCLC）。臨床治療肺癌的主要方法有靶向藥物治療、化療、放療及手術(shù)切除等，但目前大多數(shù)治療方法的療效仍較差，5年生存率較低［1］。因此，深入研究肺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及其過程中的關(guān)鍵分子并開展靶向治療，對提高肺癌患者的生存率、改善其生存質(zhì)量具有重要意義。

轉(zhuǎn)化生長因子β調(diào)節(jié)子4（transforming growth factor β regulator 4，TBRG4）是編碼轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的調(diào)節(jié)子。近年來研究發(fā)現(xiàn)TBRG4表達(dá)異常與腫瘤密切相關(guān)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，TBRG4在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者的細(xì)胞系中存在異常擴(kuò)增［3］，同時(shí)，TBRG4在乳腺癌細(xì)胞的增殖等方面發(fā)揮重要作用，但是其在肺癌中的作用尚未闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用免疫組織化學(xué)方法檢測TBRG4在臨床收集的NSCLC患者癌組織及癌旁組織樣本中的表達(dá)，分析其表達(dá)的臨床意義。構(gòu)建TBRG4的RNA干擾（RNA interference，RNAi）載體并轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系NCI-H1299，分析TBRG4在肺癌細(xì)胞增殖及調(diào)亡等生物學(xué)行為中的作用，為初步探討TBRG4基因作為治療肺癌的可能潛在靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本

本研究中所有病例資料的收集以及臨床組織樣本的采集均獲得鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審批并在其監(jiān)督下進(jìn)行。2017年6月—2018年6月采集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的NSCLC患者腫瘤組織標(biāo)本，同時(shí)，采集NSCLC患者距離癌組織5 cm以上的正常肺組織，共63例，為肺葉切除組織。所有NSCLC患者術(shù)前均未接受任何治療。術(shù)后所有臨床樣本均送鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為肺腺癌。同時(shí)記錄相關(guān)的臨床資料和病理資料，結(jié)果見表1，而NSCLC的腫瘤分級和臨床分期依據(jù)第7版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)［4］。

表 1 NSCLC患者臨床特征（N=63）Tab. 1 Clinical characteristics of NSCLC patients (N=63)［n (%)］

1.1.2 主要試劑

慢病毒包裝試劑盒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自美國Biosharp公司，AnnexinVFITC/PI和PI/RNases試劑盒購自美國BD公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，抗IGF2抗體（ab18954）、抗RAP1A抗體（ab115776）和抗TBRG4抗體（ab180775）購自英國Abcam公司，羊抗兔二抗購自美國Cell Signaling Technology公司（#5151）。

1.2 方法

1.2.1 肺癌組織和癌旁組織樣本中TBRG4的表達(dá)

固定后的組織樣本進(jìn)行脫水、透明和浸蠟后切片。再進(jìn)行脫蠟和水化后，用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液浸沒切片，沸水浴20 min，在室溫下自然冷卻，用PBS漂洗3次。用3%的H2O2的雙蒸水滴蓋切片組織，室溫溫育10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗2次。封閉后用TBRG4一抗4 ℃溫育過夜。取出切片用PBS漂洗3次后，滴加HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃溫育30 min。滴加DAB工作液染色5 min后用蒸餾水沖洗。蘇木精染液復(fù)染3 min，蒸餾水沖洗，溫水返藍(lán)5 min，乙醇濃度梯度脫水，二甲苯透明5 min后封片。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行拍照，并根據(jù)切片棕黃色強(qiáng)度及面積來評估染色結(jié)果。

1.2.2 慢病毒感染

收集H1299細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液至96孔板中，培養(yǎng)24 h。吸棄上清液，依次加入試劑盒中的試劑，培養(yǎng)12 h后換液。感染72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，當(dāng)感染效率達(dá)到80%以上時(shí)，選擇該感染條件繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取5×104個(gè)/mL密度的細(xì)胞懸液2 mL至6孔板中培養(yǎng)24 h。棄上清液，加入包含沉默TBRG4基因的小發(fā)夾RNA（small hairpin RNA，shRNA）的慢病毒（5'-GTTCTTCAGCCTGGTACAT-3'）及空載體病毒。將感染成功的細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，感染72 h后，熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)觀察細(xì)胞感染后的情況，若細(xì)胞未出現(xiàn)大量死亡，且生長狀況良好，即可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，并將NCI-H1299細(xì)胞分為對照組（TBRG4-vector組）、干擾組（TBRG4-RNAi組）和未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的空白對照組（Control組）。

1.2.3 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔密度將3組細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后換含有10 μL CCK-8試劑的100 μL培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中溫育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm檢測每孔吸光度（D）值。同時(shí)，分別在24、48、72和96 h時(shí)測得各組細(xì)胞的D值。并根據(jù)所測得D值繪制3組細(xì)胞的生長曲線。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

將3組生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約1 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每隔3 d觀察1次細(xì)胞狀態(tài)，視細(xì)胞狀態(tài)更換培養(yǎng)基，2周后出現(xiàn)肉眼可見的成團(tuán)細(xì)胞集落，即可終止培養(yǎng)。用PBS清洗細(xì)胞1次后加入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，再用0.1%結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色15 min，用PBS清洗后拍照并計(jì)數(shù)。細(xì)胞克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡。將3組細(xì)胞以5×105個(gè)/mL的密度接種到6孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次后，加入1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞的密度約為1×106個(gè)/mL。取100 μL至流式管中，分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻后室溫避光溫育15 min，再加入400 μL×結(jié)合緩沖液采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。

1.2.6 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用PI/RNase單染檢測細(xì)胞周期，制備細(xì)胞懸液并以5×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，在培養(yǎng)箱中溫育過夜。消化收集細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS洗滌2次。棄上清液，每管逐滴加入1 mL預(yù)冷的70%的乙醇，吹打混勻，-20 ℃避光過夜。固定24 h后1 000 r/min離心5 min。吸棄上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1～2次。加入500 μL的PI/RNase染液染色，室溫避光溫育15 min，用300目尼龍網(wǎng)過濾后，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白水平

用PBS清洗細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀分析（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液，在冰上裂解30 min。12 000 r/min，4 ℃低溫離心15 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)測得濃度調(diào)整上樣量后在10%的分離膠中進(jìn)行電泳。電泳完后，采用濕轉(zhuǎn)方法在200 mA恒流條件下將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將PVDF膜置于閉液封閉2 h 后，用一抗在4 ℃條件下溫育過夜。取出PVDF膜用洗膜緩沖液（Tris-buffered saline with Tween 20，TBST）洗滌3次，用二抗在室溫下溫育2 h。取出PVDF膜后用TBST洗滌3次后用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TBRG4在NSCLC患者癌組織和癌旁組織中表達(dá)情況的比較

NSCLC患者癌組織中TBRG4的陽性表達(dá)率顯著高于其在癌旁組織中的陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此可見，在NSCLC患者癌組織中TBRG4蛋白水平升高（圖1，表2）。

圖 1 TBRG4在NSCLC患者癌組織和癌旁組織中表達(dá)比較Fig. 1 Comparison of the expression of TBRG4 in cancer tissues and paracancerous tissues of NSCLC patients

表 2 TBRG4在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Tab. 2 The expression of TBRG4 in cancer tissues and paracancerous tissues

2.2 慢病毒感染后H1299中TBRG4蛋白的表達(dá)量

慢病毒感染后H1299中TBRG4蛋白的表達(dá)量結(jié)果見圖2，TBRG4-RNAi組中TBRG4蛋白的表達(dá)量顯著性低于TBRG4-vector組和Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明H1299細(xì)胞中TBRG4的shRNA慢病毒感染成功，敲低了TBRG4的表達(dá)量。

2.3 TBRG4敲低抑制H1299細(xì)胞的生長

為了探究TBRG4敲低對H1299細(xì)胞生長的影響，本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法連續(xù)4 d觀察細(xì)胞的生長情況，結(jié)果見圖3，與TBRG4-vector組和Control組相比，TBRG4-RNAi組細(xì)胞增殖明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明下調(diào)TBRG4的表達(dá)后抑制了H1299細(xì)胞的增殖能力。

圖 2 各組細(xì)胞中TBRG4蛋白的表達(dá)量Fig. 2 Expression of TBRG4 protein in each group of cells

圖 3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞增殖能力Fig. 3 CCK-8 assay to detect the proliferation of cells in each group

2.4 TBRG4敲低抑制H1299細(xì)胞克隆形成

結(jié)果見圖4。TBRG4-RNAi組細(xì)胞形成集落數(shù)目顯著性低于與TBRG4-vector組和Control組形成的集落數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明抑制TBRG4的表達(dá)能夠減弱H1299細(xì)胞的克隆形成能力。

2.5 TBRG4敲低促進(jìn)H1299細(xì)胞的凋亡

本實(shí)驗(yàn)研究了TBRG4敲低后是否對細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果見圖5，與TBRG4-vector組相比，BRG4-RNAi組細(xì)胞凋亡率顯著性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明TBRG4敲低后能促進(jìn)H1299細(xì)胞的凋亡。

2.6 TBRG4敲低導(dǎo)致H1299細(xì)胞周期停滯于G0/G1期

TBRG4敲低導(dǎo)致H1299細(xì)胞周期的影響結(jié)果見表3。結(jié)果表明，TBRG4-RNAi組S期和G2/M期的細(xì)胞百分比較Control組和TBRG4-vector組明顯下降，G0/G1期的細(xì)胞百分比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，TBRG4敲低會導(dǎo)致H1299細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。

圖 4 各組細(xì)胞克隆形成能力比較Fig. 4 Comparison of cell colony forming ability of each group

圖 5 各組細(xì)胞凋亡率比較Fig. 5 Comparison of apoptosis rates in each group

表 3 各組細(xì)胞周期比較Tab. 3 Comparison of cell cycle of each group(±s，%)

表 3 各組細(xì)胞周期比較Tab. 3 Comparison of cell cycle of each group(±s，%)

**: P＜0.01, compared with the Control group; ##: P＜0.01, compared with the TBRG4-vector group; #: P＜0.05, compared with the TBRG4-vector group

Group G0/G1 S G2 Control 40.31±0.67 39.02±0.78 20.67±0.55 TBRG4-vector 41.24±0.52 38.23±0.64 20.53±0.48 TBRG4-RNAi 51.58±0.58**，## 36.17±0.45**，# 12.25±0.42**，##

2.7 TBRG4敲低激活10號染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）信號通路相關(guān)蛋白

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TBRG4敲低激活了PTEN蛋白，上調(diào)了RAP1A及IGF2等下游基因的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示TBRG4敲低后通過激活PTEN信號通路相關(guān)蛋白從而調(diào)控H1299細(xì)胞的生物學(xué)行為。

圖 6 各組細(xì)胞信號通路蛋白表達(dá)情況比較Fig. 6 Comparison of protein expression in cell signaling pathways of each group

3 討 論

在臨床治療肺癌的過程中，研究發(fā)現(xiàn)使用靶向藥物治療可延長部分患者的生存期［5］，但由于耐藥性及不良反應(yīng)等問題，生存率仍低于15%［6］。因此，探究肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中新的機(jī)制及關(guān)鍵分子，并開展靶向治療對臨床尋找有效的肺癌治療方案具有重要意義。RNAi是一種可以使目的基因沉默的調(diào)控方式，主要通過外源性小分子干擾RNA或內(nèi)源性小分子RNA而實(shí)現(xiàn)［7-9］。慢病毒載體免疫原性較低，可感染細(xì)胞將攜帶的外源基因片段整合進(jìn)宿主基因組中，因此被廣泛地應(yīng)用于基因工程［10-14］。

TBRG4基因位于7p14-p13，編碼TGF-β調(diào)節(jié)子。研究表明，TBRG4在參與細(xì)胞周期素CLN1和CLN2的調(diào)控及維持其穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要的作用［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TBRG4在NSCLC患者的肺癌組織中高表達(dá)，表明其可能參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用帶有GFP的慢病毒載體對TBRG4基因進(jìn)行特異性干擾，從而探討TBRG4基因敲減對肺癌細(xì)胞系H1299細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

TBRG4可調(diào)控細(xì)胞周期蛋白CLN1和CLN2的轉(zhuǎn)錄及維持其穩(wěn)定性，抑制TBRG4基因會導(dǎo)致某些線粒體mRNA不穩(wěn)定［16］。研究發(fā)現(xiàn)，TBRG4蛋白在多發(fā)性骨髓瘤患者髓外腫瘤組織［17］、原代乳腺癌細(xì)胞中［18］的表達(dá)顯著升高，而在正常乳腺細(xì)胞系16N中表達(dá)降低，并且其表達(dá)與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中TBRG4蛋白呈高表達(dá)，而在癌旁組織中低表達(dá)，因此該基因可能參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了TBRG4敲低慢病毒載體，探究抑制TBRG4的表達(dá)對H1299細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低TBRG4基因能夠抑制H1299細(xì)胞的增殖及細(xì)胞克隆形成能力，促進(jìn)其凋亡，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。

PTEN是繼p53后新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，其是第一個(gè)具有脂質(zhì)和蛋白的雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN的主要功能是通過調(diào)控多種信號通路從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、黏附以及促進(jìn)細(xì)胞分化、凋亡、衰老，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)等［19］。同時(shí)，研究表明，PTEN表達(dá)下調(diào)促進(jìn)NSCLC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［20-22］。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TBRG4基因敲低激活了PTEN，進(jìn)一步上調(diào)了RAP1A及IGF2等下游基因，從而抑制H1299細(xì)胞的增殖及細(xì)胞克隆形成能力，并促進(jìn)其凋亡。本研究共納入63例肺腺癌患者樣本，而小樣本量所得結(jié)果可能存在偏差。本研究中有限的樣本量提示TBRG4的表達(dá)與肺腺癌的臨床病理學(xué)特征相關(guān)，下一步我們將增加樣本量，同時(shí)引入其他類型的肺癌樣本（如肺鱗狀細(xì)胞癌樣本），再檢測TBRG4的表達(dá)，分析其與臨床的相關(guān)性，以闡明TBRG4在肺癌中的作用及臨床意義。

綜上所述，TBRG4在肺癌細(xì)胞的增殖、調(diào)亡方面具有重要的生物學(xué)功能，其可能作為治療肺癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，但其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。