CD44基因多態(tài)性與宮頸癌及非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性

趙雨笛，譚 芳，嚴(yán)志凌，李盈甫，戴書穎，周紫云，張新文，劉舒媛，史 荔，姚宇峰

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118 ；

2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部醫(yī)療科，云南 昆明 650032；

3.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科，云南 昆明 650118；

4.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；

5.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

由于人口老齡化加劇、生活方式改變、環(huán)境惡化等因素的影響，全球惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率持續(xù)增長，已成為人類死亡的首要原因［1］。除以上環(huán)境因素外，宿主因素尤其是宿主基因中的遺傳多態(tài)性在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［2］。CD44屬于細(xì)胞黏附分子家族中的透明質(zhì)酸黏素（hyaladherin），是一種跨膜糖蛋白，由細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域三個(gè)部分構(gòu)成，是許多細(xì)胞因子、生長因子的受體。CD44由人類第11號染色體短臂上的CD44基因編碼，全長50 kb，由20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子組成［3］。CD44是眾多腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志分子之一［4］，在腫瘤細(xì)胞中，過表達(dá)的CD44已被確認(rèn)與人類許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性［5-12］，包括宮頸癌、肺癌等［13-18］。大量研究結(jié)果顯示，CD44基因中的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與人類多種癌癥的易感性相關(guān)［19-22］。基因的3'UTR區(qū)域在miRNA參與的基因表達(dá)調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，而位于3'UTR區(qū)域的SNP位點(diǎn)可能通過影響miRNA的結(jié)合而影響基因的表達(dá)。因此，本研究選擇了CD44基因3'UTR區(qū)域可能與miRNA結(jié)合相關(guān)［20，23］的兩個(gè)SNP位點(diǎn)（rs13347C＞T、rs8193C＞T），分別研究其與云南漢族人群宮頸癌和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 對象

隨機(jī)選取2012年10月—2016年5月在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院被確診為宮頸癌的患者497例作為宮頸癌病例組，隨機(jī)選取同期被確診為NSCLC的患者483例作為NSCLC病例組，并排除：① 術(shù)前接受放化療等抗腫瘤治療的患者；② 患有其他惡性腫瘤，或合并心血管疾病、糖尿病、肝炎、腎病等疾病的患者；③ 資料不全者。選取同期在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院體檢的人類乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）陰性且無宮頸癌變的健康女性500名作為宮頸癌對照組，選取同期在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院參加體檢的471名健康體檢者作為NSCLC對照組。所有參與者均為居住于云南地區(qū)的彼此無血緣關(guān)系的漢族個(gè)體，并簽署知情同意書。

1.2 樣本基因組DNA提取

采集研究對象靜脈血5 mL（EDTA或肝素鈉抗凝），使用全血基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國QIAGEN公司，貨號51106）提取DNA。并用超微量紫外可見分光光度計(jì)（NanoDrop2000，美國ThermoFisher Scientific公司）檢測DNA的濃度及純度。

1.3 SNP位點(diǎn)基因分型

本研究采用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）對研究對象SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。TaqMan探針分型試劑盒及分型試劑（TaqMan Genotyping Master Mix）購自美國ABI公司（http://www.appliedbiosystems.com）。其中SNP位點(diǎn)rs13347基因分型試劑盒編號為C_ _7619022_10；S N P位點(diǎn)r s 8 1 9 3基因分型試劑盒編號為C_ _2143188_1_。基因分型使用PCR儀為QuantStudio 6（美國ABI公司），PCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，40 ℃長延伸5 min?；蚍中驮囼?yàn)設(shè)陰性對照（以水代替樣本DNA）。基因分型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用QuantStudioTMReal-Time PCR軟件進(jìn)行分析，并選取每個(gè)位點(diǎn)不同基因型的樣本進(jìn)行測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)樣品代表性；采用t檢驗(yàn)分析病例組和對照組間年齡是否存在差異；采用χ2檢驗(yàn)分析病例組和對照組性別是否有差異，并分析病例組和對照組中CD44基因兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率的差異。采用SHEsis軟件計(jì)算SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡關(guān)系［24］，用D'值表示兩個(gè)位點(diǎn)間的連鎖關(guān)系，當(dāng)D'＞0.8時(shí)說明SNP位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖。構(gòu)建存在強(qiáng)連鎖SNP的單倍型，并用χ2檢驗(yàn)分析所構(gòu)建的單倍型在病例組和對照組之間分布頻率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在單倍型分析過程中的多重比較采用Bonferroni進(jìn)行校正。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象基本情況

本研究共納入宮頸癌病例組497例，宮頸癌對照組500例；NSCLC病例組483例，NSCLC對照組471例（表1）。

表 1 本研究選取病例的臨床特征Tab. 1 The clinical characteristics of the subjects enrolled in this study

2.2 研究樣本的代表性

CD44基因中的SNP位點(diǎn)rs13347（C＞T）、rs8193（C＞T）的基因型分布在宮頸癌病例組和對照組，以及NSCLC病例組和對照組中全部符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），說明本研究中所選擇的樣本是具有群體代表性的隨機(jī)樣本。

2.3 CD44基因SNP位點(diǎn)與宮頸癌和NSCLC的相關(guān)性分析

CD44基因中的兩個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因和基因型在宮頸癌組和對照組中分布特征見表2。結(jié)果顯示，rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）位點(diǎn)等位基因和基因型在宮頸癌組和對照組中的分布頻率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

CD44基因中的兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）位點(diǎn)等位基因和基因型在NSCLC組和對照組中的分布特征見表3。結(jié)果顯示，rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）位點(diǎn)等位基因在NSCLC組和對照組中分布頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020和0.004）；其中rs13347位點(diǎn)等位基因C在NSCLC組的分布頻率顯著高于對照組，可能是NSCLC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素（OR=1.250，95%CI：1.035～1.509），而rs8193位點(diǎn)等位基因C在對照組中的分布頻率顯著高于NSCLC組，可能是NSCLC發(fā)生的保護(hù)性因素（OR=0.768，95%CI：0.641～0.921）。

表 2 CD44基因中SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型在宮頸癌病例組和對照組的分布Tab. 2 Comparison of the allelic and genotypic frequencies distribution of SNPs in CD44 gene among case and control groups of cervical cancer［n(%)］

表 3 CD44基因中SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型在NSCLC病例組和對照組的分布頻率Tab. 3 The allelic and genotypic frequencies of SNPs in CD44 gene between NSCLC case and control groups［n(%)］

2.4 CD44基因SNP位點(diǎn)間連鎖不平衡關(guān)系及單倍型分析

CD44基因SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，在宮頸癌和NSCLC的分析中 rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）之間均存在強(qiáng)連鎖（D'＞0.8）。根據(jù)連鎖不平衡結(jié)果構(gòu)建CD44基因SNP位點(diǎn)rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）的單倍型，并比較分布頻率大于3%的單倍型在病例和對照組中的分布頻率差異。結(jié)果顯示，rs13347和rs8193兩位點(diǎn)單倍型C-C、C-T和T-C在宮頸癌病例組和對照組中的分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在NSCLC病例組和對照組中，rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）兩位點(diǎn)單倍型C-C的分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；單倍型C-T和T-C在NSCLC對照組和病例組中分布頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003和P=0.022），但經(jīng)Bonferroni校正后，單倍型T-C在兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明rs13347C-rs8193T單倍型可能是NSCLC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素（OR=1.316，95%CI：1.096～1.579，表4）。

表 4 CD44基因 SNP 位點(diǎn)單倍型與宮頸癌及NSCLC的相關(guān)性Tab. 4 The haplotype frequencies of SNPs in CD44 gene in case and control groups of cervical cancer and NSCLC［n(%)］

3 討 論

癌癥是全球主要的疾病負(fù)擔(dān)，每年新發(fā)生病例1 000多萬，我國新增病例約占全球的20%［25］，其中肺癌發(fā)病例數(shù)居全球首位，宮頸癌發(fā)病例數(shù)居全球第2位。惡性腫瘤發(fā)生過程中個(gè)體間遺傳因素的差異發(fā)揮著重要作用，基因組SNP是個(gè)體對腫瘤易感性差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)。遺傳學(xué)腫瘤標(biāo)志物已逐漸成為惡性腫瘤早期預(yù)防和診治的重要監(jiān)測指標(biāo)。

CD44廣泛表達(dá)于各類細(xì)胞表面，包括淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、中胚層細(xì)胞。CD44的過表達(dá)會(huì)干擾細(xì)胞的凋亡作用，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力［26］。Dasari等［27］在印度人群宮頸癌研究中發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清中CD44水平顯著增加，這說明CD44的異常表達(dá)可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，CD44基因多態(tài)性與多種惡性腫瘤之間有著密切的聯(lián)系，比如肺癌、胃腸癌、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病、甲狀腺癌和卵巢癌等癌癥中CD44的表達(dá)均顯著升高［28-32］。研究發(fā)現(xiàn)基因中的SNP位點(diǎn)可能通過多種方式對基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，其中位于基因3'-UTR區(qū)域的SNP位點(diǎn)可能通過干擾miRNA的結(jié)合而干擾miRNA對靶基因表達(dá)的調(diào)控［33］。因此本研究選取了位于CD44基因3'-UTR區(qū)域的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分析其與云南漢族人群NSCLC、宮頸癌的相關(guān)性。其中rs13347（C＞T）位點(diǎn)位于CD44基因3'-UTR區(qū)域，可通過影響hsa-miR-509-3P對CD44的調(diào)控而影響CD44的表達(dá)［20,34-35］。Shi等［36］的研究發(fā)現(xiàn)，該多態(tài)性位點(diǎn)與亞洲人尤其是中國人群患某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)性有關(guān)，包括膽囊癌、鼻咽癌、乳腺癌和急性髓細(xì)胞性白血病等［8,20,34-35,37］。Tulsyan等［38］在北印度人群的研究中未發(fā)現(xiàn)CD44 rs13347與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，CD44基因中的rs13347位點(diǎn)可能與云南漢族人群NSCLC具有相關(guān)性，而與云南漢族人群宮頸癌無相關(guān)性。綜合以上研究資料發(fā)現(xiàn)，rs13347在不同研究中發(fā)揮的作用存在不一致，造成這種不一致結(jié)果的原因可能是由于不同研究選取的人群不同造成的，通過Ensemble數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)rs13347位點(diǎn)等位基因及基因型在不同人群中的分布頻率差異較大（http://asia.ensembl.org/index.html）；另一個(gè)可能的原因是不同疾病的發(fā)病機(jī)制不同，所以同一SNP位點(diǎn)在不同疾病中發(fā)揮的作用可能不同。本研究選取的CD44基因中的另一個(gè)SNP位點(diǎn)rs8193(C＞T)與疾病的相關(guān)性的研究較少，本研究結(jié)果顯示，CD44基因上rs8193（C＞T）位點(diǎn)與云南漢族人群宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間無關(guān)聯(lián)性，但該位點(diǎn)可能與云南漢族人群NSCLC的易感性相關(guān)。3'UTR區(qū)域可以通過控制mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率參與轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的基因調(diào)控。而rs8193位于CD44基因3'UTR中轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域，因此，有研究者推測轉(zhuǎn)錄因子與位于CD44基因3'UTR區(qū)域的rs8193多態(tài)性位點(diǎn)結(jié)合的變化使得CD44基因的轉(zhuǎn)錄活性受到影響［23,39］。

本研究分析了CD44基因中兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖不平衡關(guān)系，構(gòu)建了兩個(gè)位點(diǎn)的單倍型，并對分布頻率大于3%的單倍型在病例組和對照組中的分布差異進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，C-T單倍型與云南漢族人群NSCLC的易感性相關(guān)。該結(jié)果與等位基因和基因型分析結(jié)果中rs13347和rs8913等位基因在NSCLC發(fā)生過程中發(fā)揮的作用相一致。

綜上所述，本研究中CD44基因中的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs13347和rs8193可能與云南漢族人群宮頸癌的易感性無關(guān)。但在NSCLC的分析中，多態(tài)性位點(diǎn)rs13347基因型C/C可能是肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素；rs8193位點(diǎn)基因型C/C可能是NSCLC發(fā)生的保護(hù)因素，單倍型C-C則可能與NSCLC風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。這兩個(gè)位點(diǎn)位于CD44基因的3'UTR區(qū)域，其中rs13347是hsa-miR-509-3P的結(jié)合序列，而rs8193可能位于轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子結(jié)合區(qū)域，兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均可能會(huì)對CD44的表達(dá)產(chǎn)生影響，從而與腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。但研究結(jié)果仍存在著爭議，因此后期會(huì)通過增加樣本量進(jìn)一步分析兩個(gè)SNP位點(diǎn)與宮頸癌和肺癌的相關(guān)性。