HPLC 法測定新疆軟紫草屬4 種植物根中萘醌類成分

丁文歡， 燕雪花， 葛 亮， 徐海燕?

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室， 新疆 烏魯木齊 830054； 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830054）

《中國藥典》 中紫草來源于紫草科軟紫草屬植物新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst.、 黃花軟紫草Arnebia guttata Bunge 的干燥根[1］， 為新疆道地藥材， 被譽(yù)為“涼血之圣藥”[2］， 主要活性成分為萘醌色素類——紫草素及其衍生物， 其含有量對于考量藥材品質(zhì)而言尤為重要， 這類物質(zhì)主要有抗炎、 抗菌、 抗病毒、 抗癌、 保護(hù)腎臟、 抑制細(xì)胞色素等作用[3-11］， 測定方法包括分光光度法、 薄層掃描法、 高效液相色譜法、 電化學(xué)法[12-21］。 受藥材來源、傳統(tǒng)民族醫(yī)藥藥用習(xí)俗等影響， 紫草在市場上出現(xiàn)魚目混雜的現(xiàn)象， 市售紫草無論源自新疆或國外， 其正品均源于軟紫草屬， 該屬共約25 種， 分布在新疆的有新疆紫草A．euchroma、 黃花軟紫草A． guttata、 天山軟紫草A． tschimganica、 硬萼軟紫草A． decumbens、 紫筒花A． obovata[22］， 天山軟紫草、 硬萼軟紫草雖未被《中國藥典》 收錄， 但其性狀特征顯示， 2 種植物的根分別與新疆紫草、 黃花軟紫草相似， 均呈現(xiàn)紫紅色， 推測可能含有紫草素， 但未見有關(guān)其具體成分及含有量的報道。 本研究測定了新疆紫草、 黃花軟紫草、 天山軟紫草、 硬萼軟紫草4 種植物根中7 種萘醌類成分的含有量， 為擴(kuò)大該植物新藥源提供了參考。

1 材料

1.1 儀器 MS105DU 型電子天平（十萬分之一， 瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ5200DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試藥 β， β′-二甲基丙烯酰紫草素（15102821）、 左旋紫草素（15102721）、 去氧紫草素（15062422）、 乙酰紫草素（15120431） 對照品由上海同田生物技術(shù)有限公司提供； β-乙酰氧基異戊酰紫草素（P05M7F14235） 由上海源葉生物技術(shù)有限公司提供； 異丁酰紫草素（wkq16101302）由四川省維克奇生物科技有限公司提供； 2-甲基丁基酰紫草素（AV51-LDQR） 由日本化成工業(yè)株式會社提供。 乙腈、 甲酸為色譜純； 石油醚（60～90 ℃） 為分析純； 水為艾科超純水。

1.3 樣品 藥材采自新疆， 由新疆醫(yī)科大學(xué)中藥資源教研室徐海燕副教授鑒定為紫草科軟紫草屬新疆紫草Arnebiaeuchroma （采自霍城）； 黃花軟紫草Arnebia guttata （采自阿圖什）； 天山軟紫草Arnebia tschimganica （采自和靜）； 硬萼軟紫草Arnebia decumbens （采自昌吉） 的干燥根， 粉碎過4 號篩， 備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 分別取左旋紫草素、 乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、 去氧紫草素、 異丁酰紫草素、β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、 2-甲基丁基酰紫草素對照品2、 10、 10、 1、 10、 5、 25 mg， 置25 mL 量瓶中， 乙腈定容， 得貯備液。 分別取除2-甲基丁基酰紫草素外其余6 種貯備液適量， 置同一10 mL 量瓶中； 取2-甲基丁基酰紫草素貯備液3.5 mL， 置10 mL 量瓶中， 即得。

2.2 供試品溶液制備 取藥材粉末約1.0 g， 精密稱定，置錐形瓶中， 加入石油醚（60～90 ℃） 50 mL， 稱定質(zhì)量，超聲30 min， 冷卻， 石油醚（60 ～90 ℃） 補(bǔ)足減失質(zhì)量，過濾； 量取續(xù)濾液（新疆紫草10 mL， 黃花軟紫草、 天山軟紫草、 硬萼軟紫草各30 mL）， 蒸干， 殘渣加乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中， 乙腈定容至刻度， 搖勻， 即得。 色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.3 色 譜 條 件[1，23］Agilent-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）， 流動相乙腈-0.05% 甲酸 （70 ∶30）； 體積流量1 mL／min； 檢測波長275 nm； 柱溫30 ℃； 進(jìn)樣量10 μL。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取除2-甲基丁基酰紫草素外其余6 種貯備液適量， 置5 個10 mL 量瓶中， 乙腈定容并混勻； 精密吸取2-甲基丁基酰紫草素貯備液0.1、 2.0、 4.0、6.0、 8.0 mL， 置5 個10 mL 量瓶中， 乙腈定容并混勻。 分別吸取各質(zhì)量濃度對照品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下測定， 以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）， 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸， 結(jié)果見表1， 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5 精密度試驗 取供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次， 測得7 種萘醌類成分峰面積RSD 分別為0.35%、 0.22%、 0.53%， 1.70%、 0.28%、 0.45%、0.24%， 表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下于0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 24 h 測定， 測得7 種萘醌類成分峰面積RSD 分別為1.52%、 0.45%、 1.27%、 1.84%、0.70%、 1.12%、 0.48%， 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取藥材粉末6 份， 精密稱定， 按“2.2”項下方法制備供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下測定，測得7 種萘醌類成分含有量RSD 分別為1.67%、 1.99%、1.84%、 1.02%、 2.05%、 1.92%、 2.07%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 以乙腈為溶劑配制圖1 中1 ～6 成分的對照品溶液， 質(zhì)量濃度分別為0.161、 3.040、 1.332、0.160、 1.761、 1.034 mg／mL。 取 藥 材 粉 末12 份， 每 份0.25 g， 精密稱定并置錐形瓶中， 其中6 份分別加入以上對照品溶液1.0 mL， 另外6 份分別精密加入4.000 mg／mL 2-甲基丁基酰紫草素對照品溶液1.0 mL， 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下測定， 測得回收率 （RSD） 分別為99.75% （0.42%）、 99.17%（0.92%）、 99.12%（0.71%）、 98.63% （1.94%）、 97.37%（1.64%）、 99.07% （0.70%）、 98.37% （1.08%）。

2.9 樣品含有量測定 取4 種樣品各3 份， 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下測定，計算含有量， 結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g）

4 種軟紫草屬植物根中均含有萘醌類成分， 不同種間存在差異。 在“2.3” 項色譜條件下， 新疆紫草的萘醌類成分總量最高， 為46.745 5 mg／g， 其次是黃花軟紫草， 含有量最低的為硬萼軟紫草， 為17.331 4 mg／g， 推測可能是硬萼軟紫草為一年生草本植物， 其余幾種均為多年生草本植物， 各成分在植物體內(nèi)的蓄積不同。 新疆紫草、 黃花軟紫草均含有7 種成分， 天山軟紫草檢測到除去氧紫草素外的6 種成分， 硬萼軟紫草未檢測到β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、 β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧。 2015 年版《中國藥典》規(guī)定， 紫草中含β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧不得少于0.30%， 本研究發(fā)現(xiàn)新疆紫草、 黃花軟紫草及天山軟紫草中該成分均符合藥典規(guī)定。 7 種萘醌類成分中， 各基源軟紫草中分布情況不同， 可作為藥典收錄品種與其他非收錄品種間的鑒別依據(jù)。

3 討論

因2-甲基丁基酰紫草素含有量僅為88.0%， 從色譜圖中可以看出它會對其他6 種待測成分產(chǎn)生干擾， 故本研究中該成分的線性關(guān)系考察、 加樣回收率試驗均單獨(dú)進(jìn)行。

本研究采用HPLC 法同時測定4 種軟紫草屬植物根中7種成分含有量， 方法簡單快速， 重復(fù)性好， 結(jié)果穩(wěn)定可靠?！吨袊幍洹?僅對β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧進(jìn)行定量分析， 而本研究同時測定7 種萘醌類成分， 可提高藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 能用于紫草及同屬其他植物的鑒別及質(zhì)量評價。

然而， 本實驗每種紫草僅測定了一批樣品， 對幾種紫草中各成分含有量的高低尚不能得出定論。 若要比較其差異， 則需要擴(kuò)大樣本量， 考察不同生長期、 生長環(huán)境的影響， 以期為紫草質(zhì)量控制及擴(kuò)大新藥源提供參考依據(jù)。