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    重樓解毒酊微生物限度檢查方法適用性探討

    2019-06-01 02:51:18鈺,洪,莉,琴,曼,俊?
    中成藥 2019年4期
    關(guān)鍵詞:計數(shù)法重樓適用性

    滕 鈺, 徐 洪, 鄒 莉, 李 琴, 羅 曼, 王 俊?

    (1. 貴州省食品藥品檢驗所, 貴州 貴陽 550004; 2. 貴州圣濟堂制藥有限公司, 貴州 貴陽 551400)

    重樓解毒酊屬于獨家批文品種, 是根據(jù)傳承千年的苗族驗方采用現(xiàn)代工藝研制而成, 主要成分有重樓、 艾葉、石菖蒲等, 具有清熱解毒、 散瘀止痛功效[1], 臨床用于肝經(jīng)火毒所致帶狀皰疹、 皮膚瘙癢、 蟲咬皮炎、 流行性腮腺炎[2], 收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局國家中成藥地方標準上升國家標準(皮膚科分冊)。 微生物限度檢查是藥品質(zhì)量控制非常重要的一部分[3], 本研究結(jié)合供試品特性、給藥途徑及限度要求, 依據(jù)2015 年版 《中國藥典》 四部[4]對重樓解毒酊進行了微生物限度檢查方法適用性研究, 從而保障檢驗結(jié)果的準確性和有效性, 提高用藥安全。

    1 儀器與材料

    1.1 樣品 重樓解毒酊, 規(guī)格45 mL/瓶, 批號20170101、20170102、 20170103, 均由貴州圣濟堂制藥有限公司提供。

    1.2 培養(yǎng)基及試劑 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB) (批號17032950)、 沙氏葡萄糖液體 培養(yǎng)基 (SDB) (批號150916)、 甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號1610083)、 胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基(TSA) (批號1703254)、 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA) (批號17031651)、 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號1512232), 均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。 聚山梨酯80 (批號2014112601, 成都市科龍化工 試 劑 廠); pH7.0 氯 化 鈉-蛋 白 胨 緩 沖 液 (批 號3105593, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

    1.3 菌種 白色念珠菌[CMCC (F) 98001]、 金黃色葡萄球菌[CMCC (B) 26003]、 枯草芽孢桿菌[CMCC (B)63501]、 銅綠假單胞菌 [CMCC (B) 10104]、 黑 曲霉[CMCC (F) 98003] 均由中國食品藥品檢定研究院提供。

    1.4 儀器 電子天平[型號PL602-L, 梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司]; 電熱恒溫水浴鍋(型號DK-98-Ⅱ, 天津泰斯特儀器有限公司); 低溫培養(yǎng)箱、 恒溫培養(yǎng)箱(型號BF240, 德國Binder 公司); 生物安全柜 (型號BSC-1300ⅡA/B3, 新加坡藝思高科技有限公司); 集菌儀(型號HTY-601, 浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 菌液制備 按2015 年版《中國藥典》 四部要求制備[4],并參考劉康連等[5]報道的方法。 用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌、 銅綠假單胞菌、 白色念珠菌分別制成濃度不大于10 000、 1 000 cfu/mL 的菌懸液, 將黑曲霉分別制成濃度不大于10 000、 1 000 cfu/mL的孢子懸液, 備用。

    2.2 供試品溶液制備 取本品10 mL, 加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL[4], 置40 ℃水浴中振搖混勻,即得(1 ∶10)。

    2.3 回收比值 計數(shù)法適用性試驗回收比值[6]= (試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)) /菌液組菌落數(shù), 計算結(jié)果在0.5~2 范圍內(nèi)時, 表明方法可行[7]。

    2.4 計數(shù)法適用性

    2.4.1 試驗組

    2.4.1.1 平皿法 向7 份供試品溶液(每份10 mL) 中加入濃度不大于l0 000 cfu/mL 的“2.1” 項下菌液(需氧菌計數(shù)對應金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌、 銅綠假單胞菌、白色念珠菌、 黑曲霉, 霉菌和酵母菌計數(shù)對應白色念珠菌、黑曲霉) 各0.1 mL, 混勻, 使每1 mL 供試品溶液含菌量不大于100 cfu, 取1 mL 注入90 mm 無菌培養(yǎng)皿中, 傾注20 mL 45 ℃左右融化的培養(yǎng)基(需氧菌計數(shù)平皿加TSA,霉菌和酵母菌計數(shù)平皿加SDA), 迅速混勻, 冷卻凝固。

    2.4.1.2 薄膜過濾法 向7 份供試品溶液(每份10 mL)中加入濃度不大于l 000 cfu/mL 的“2.4.1.1” 項下5 株菌液各0.1 mL, 混勻, 使每1 mL 供試品溶液含菌量不大于10 cfu, 全部過濾, 用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗10 次(每次100 mL), 將濾膜面朝上貼于預制平板上(需氧菌計數(shù)對應TSA, 霉菌和酵母菌計數(shù)對應SDA)。 2種方法均每株菌平行制備2 個平皿, 按藥典規(guī)定條件培養(yǎng)并計數(shù)。

    2.4.2 菌液對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品溶液, 按“2.4.1” 項下方法操作[8]。

    2.4.3 供試品對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代菌液, 按“2.4.1” 項下方法操作[8]。

    2.4.4 陰性對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品溶液, 不加試驗菌, 其他操作同“2.4.1” 項[6]。

    2.4.5 不同計數(shù)法比較 采用平皿、 薄膜過濾法的回收比值(均取2 位有效數(shù)字), 見表1。 5 種試驗菌7 個試驗組的回收比值均在0.5~2 范圍內(nèi), 表明本品對金黃色葡萄球菌、 銅綠假單胞菌、 白色念珠菌、 黑曲霉生長均有一定抑制作用; 其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強, 采用平皿法時, 其回收比值已接近范圍下限0.5。 另外, 采用薄膜過濾法時5 株菌回收比值均有不同程度的提高, 表明該方法更能消除該品種的抑菌活性。

    表1 不同計數(shù)法適用性試驗結(jié)果

    2.5 控制菌檢查方法適用性

    2.5.1 金黃色葡萄球菌

    2.5.1.1 試驗組 常規(guī)法為取供試品溶液10 mL, 接種至100 mL TSB 培養(yǎng)基, 加入金黃色葡萄球菌 (不大于100 cfu/mL) 混勻, 34 ℃下培養(yǎng)18 h, 取其培養(yǎng)物劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基, 34 ℃下培養(yǎng)18 h[4], 觀察結(jié)果; 稀釋法為在200 mL TSB 培養(yǎng)基中加入10 mL 供試品溶液, 其他操作同常規(guī)法。

    2.5.1.2 供試品對照組 不加試驗菌, 增菌培養(yǎng)時間為24 h,選擇、 分離培養(yǎng)時間為72 h[4], 其他操作同“2.5.1.1” 項。

    2.5.1.3 陰性對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品, 其他操作同“2.5.1.2” 項。

    2.5.2 銅綠假單胞菌

    2.5.2.1 試驗組 常規(guī)法為取供試品溶液10 mL, 接種至100 mL TSB 培養(yǎng)基, 加入銅綠假單胞菌(不大于100 cfu/mL)混勻, 34 ℃下培養(yǎng)18 h, 取其培養(yǎng)物劃線接種至溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基, 34 ℃培養(yǎng)18 h[4], 觀察結(jié)果; 稀釋法為在200 mL TSB 培養(yǎng)基中加入10 mL 供試品溶液, 其他操作同常規(guī)法。

    2.5.2.2 供試品對照組 不加試驗菌, 增菌培養(yǎng)時間為24 h,選擇、 分離培養(yǎng)時間為72 h[4], 其他操作同“2.5.2.1” 項。

    2.5.2.3 陰性對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品, 其他操作同“2.5.2.2” 項。

    2.5.3 控制菌檢查方法適用性 當TSB 體積為200 mL 時,試驗組能檢出相應陽性對照菌, 見表2, 表明用培養(yǎng)液稀釋法(TSB 200 mL) 能消除該品種對金黃色葡萄球菌、 銅綠假單胞菌的抑菌作用。

    表2 控制菌檢查方法適用性試驗結(jié)果

    3 討論

    在對重樓解毒酊進行微生物檢查方法適用性研究時主要存在2 個問題, 一方面由于該制劑中含有艾葉、 石菖蒲、重樓等多種抑菌成分[9-17], 對藥典要求的多株菌生長均有抑制, 采用常規(guī)平皿法進行微生物計數(shù)時, 回收比值偏低,抑菌活性消除不理想, 可能會導致假陰性結(jié)果出現(xiàn), 不能真實反映制劑微生物污染狀況; 另一方面雖然該品種對白色念珠菌和黑曲霉的抑制性不強, 但其為皮膚用藥, 2015年版《中國藥典》 對該類制劑微生物限度標準規(guī)定嚴格,尤其是霉菌和酵母菌總數(shù)為10 cfu/mL[4], 故計數(shù)若采用平皿法或培養(yǎng)基稀釋法, 會不利于企業(yè)內(nèi)控標準制定和微生物安全質(zhì)量控制。

    2015 年版《中國藥典》 中, 計數(shù)法部分消除樣品抑菌性的主要技術(shù)手段為培養(yǎng)基稀釋法、 薄膜過濾法、 添加中和劑[18], 后者通常是與前兩者聯(lián)用。 薄膜過濾法直接過濾抑菌成分, 消除抑菌活性, 能有效避免假陰性結(jié)果出現(xiàn),常用于檢測中藥液體制劑[19], 此方法還有快速收集菌種、減少檢測時間的優(yōu)點[20], 但不適用于非完全溶解的供試品[21]; 培養(yǎng)基稀釋法雖對藥品中抑菌成分進行稀釋, 但沒有完全消除, 在計數(shù)檢測過程中抑菌成分仍可能對菌的生長不利, 進而對回收率和檢出率造成影響[22]。 據(jù)報道[23],高稀釋級供試品會降低微生物檢出, 同時增加試驗步驟,延長試驗時間, 增加污染風險, 對結(jié)果準確性的不利影響增多, 《中國藥典》 對皮膚、 耳用、 口腔黏膜給藥制劑的微生物計數(shù)限度要求比口服固體制劑高, 而上述制劑通常為液體制劑。 因此, 在限值要求較高, 樣品藥渣少、 溶解性好、 通過性佳的情況下, 薄膜過濾法是消除藥品抑菌活性的合適方法。

    2015 年版《中國藥典》 將“方法驗證” 改成了“方法適用性”, 更側(cè)重于將試驗條件、 供試品特性等因素作為一個整體系統(tǒng)來評價, 控制分析條件對諸因素的影響,使檢測活動能達到預期目的[23-24]。 本研究以此為宗旨, 結(jié)合重樓解毒酊的抑菌成分、 理化特性和限度標準, 選擇薄膜過濾法作為計數(shù)法, 既提高了回收比值, 又保證了霉菌和酵母計數(shù)法能貼合藥典限度規(guī)定, 并選擇培養(yǎng)基稀釋法對該品種控制菌進行檢查, 能在規(guī)定培養(yǎng)條件下檢出陽性菌。

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