不同制備工藝柴胡注射液成分分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)探討

陳文露， 彭新宇， 余靜賢， 高 彪， 徐志宏， 潘育方

（1. 廣東藥科大學(xué)， 廣東 廣州 440100； 2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所， 廣東 廣州 440100；3. 廣東省中獸藥工程技術(shù)研究中心， 廣東 廣州 440100； 4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 廣東 廣州 440100）

柴胡為傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根， 按性狀不同， 分別習(xí)稱為“北柴胡” 和“南柴胡”[1］， 具有疏散退熱、 疏肝解郁、 升舉陽(yáng)氣等功效， 多用于感冒發(fā)熱、 寒熱往來(lái)、 胸脅脹痛、 月經(jīng)不調(diào)、 子宮脫垂、 脫肛[1］等。 柴胡注射液收錄在《中藥成方制劑》 第十七冊(cè)中， 是我國(guó)第一個(gè)研制的中藥注射液[2］， 具有清熱解表的功效， 臨床上常用于治療感冒和流行性感冒或瘧疾引起的發(fā)熱， 療效確切，而近年來(lái)學(xué)者還發(fā)現(xiàn)它有抗病毒、 抗腫瘤、 抗炎、 增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶力、 提高免疫力的作用[3-5］。

隨著柴胡注射液臨床應(yīng)用趨于廣泛， 其不良反應(yīng)報(bào)道也逐漸增多， 相關(guān)的副作用有蕁麻疹、 皮疹、 瘙癢、 惡心嘔吐、 腹脹腹瀉、 頭暈頭痛、 視力模糊、 胸悶煩躁、 血壓異常、 肺水腫等， 嚴(yán)重的甚至?xí)鸷粑щy、 腎功能衰竭、 血壓驟降、 意識(shí)喪失等， 據(jù)分析有可能是提取工藝中產(chǎn)生了引起副作用的物質(zhì)[6-9］。 柴胡注射液由柴胡精油進(jìn)一步制備而得， 提取工藝有水蒸法、 酸浸法、 鹽析法、 酸浸鹽析法等[10-12］， 但目前還沒(méi)有對(duì)不同制備工藝注射液進(jìn)行成分分析的報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)紫外分光光度法和GC-MS法對(duì)市售、 不同工藝制備的柴胡注射液進(jìn)行吸光度比較和成分鑒定， 以期為進(jìn)一步提高柴胡注射液的質(zhì)量、 減少毒副作用提供依據(jù)。

1 材料

Agilent GC-MDS 7890B-5977A、 HP-5MS 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm， 5 μm） （美國(guó)安捷倫公司）； PHS-3C 數(shù)顯PH 計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）； UV-3100PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）； EXD-322B 電子天平（福建衡科儀器有限公司）。 柴胡注射液（批號(hào)16020302A， 河南省康華藥業(yè)有限公司）。 鹽酸（批號(hào)20111103， 廣州化學(xué)試劑廠）； 氯化鈉（批號(hào)20170206，廣州化學(xué)試劑廠）； 1， 2-丙二醇（批號(hào)20170815， 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）； 吐溫-80 （批號(hào)20170311， 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）； 檸檬酸三鈉（批號(hào)20170929，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。 柴胡（康美藥業(yè)股份有限公司， 批號(hào)20161012）， 經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院程軒軒副教授鑒定為北柴胡。

2 方法

2.1 供試品制備

2.1.1 柴胡精油提取

2.1.1.1 水提法 柴胡50 g 切段， 段長(zhǎng)1 ～2 cm， 加入550 mL注射用水， 70 ℃下浸泡8 h （過(guò)夜） 后蒸餾提取，初餾液收取150 mL， 再進(jìn)行重蒸餾， 重餾液收50 mL。

2.1.1.2 鹽析法 柴胡50 g 切段， 段長(zhǎng)1 ～2 cm， 加入550 mL注射用水， 70 ℃下浸泡8 h （過(guò)夜） 后按占溶液25%比例， 加入氯化鈉137.5 g， 蒸餾提取， 初餾液收取150 mL， 再進(jìn)行重蒸餾， 重餾液收50 mL。

2.1.1.3 酸浸法 柴胡50 g 切段， 段長(zhǎng)1 ～2 cm， 加入550 mL稀鹽酸溶液（pH=1.0）， 70 ℃下浸泡8 h （過(guò)夜）后蒸餾提取， 初餾液收取150 mL， 再進(jìn)行重蒸餾， 重餾液收50 mL。

2.1.1.4 酸浸鹽析法 柴胡50 g 切段， 段長(zhǎng)1～2 cm， 加入550 mL 稀鹽酸溶液（pH=1.0）， 70 ℃下浸泡8 h （過(guò)夜） 后按溶液25%比例加入氯化鈉137.5 g 蒸餾提取， 初餾液收取150 mL， 再進(jìn)行重蒸餾， 重餾液收50 mL。

2.1.2 柴胡注射液配制 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下4 種重餾液各40 mL， 加入0.15 g 吐溫-80、 1 g 1， 2-丙二醇， 攪拌使油完全溶解， 再加入氯化鈉0.45 g， 溶解后， 調(diào)pH 值至6.6， 加注射用水至50 mL， 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾， 灌封， 115 ℃滅菌30 min， 即得。

2.2 紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度

2.2.1 最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定 市售柴胡注射液用純化水稀釋10 倍[13］， 測(cè)定的紫外光譜和最大吸收波長(zhǎng)， 見(jiàn)圖1。 由圖可知， 市售柴胡注射液在275 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰， 故在此處進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

圖1 柴胡注射液的紫外光譜圖

2.3 GC-MS 分析 取市售柴胡注射液和“2.1.1” 項(xiàng)下4種工藝制備的柴胡注射液各10 mL， 分別密封于50 mL 頂空進(jìn)樣瓶， 水浴80 ℃， 平衡10 min， 取頂空氣體1 mL 上機(jī)檢測(cè)， 40 ℃柱溫保持5 min， 以5 ℃／min 升至50 ℃， 然后以20 ℃／min升至250 ℃， 保持5 min； EI 離子源； 電子能量70 eV； 離子溫度230 ℃； 接口溫度250 ℃； 載氣為高純氦氣； 分流模式不分流； 體積流量1.0 mL／min； 進(jìn)樣器為手動(dòng)進(jìn)樣； 進(jìn)樣口溫度250 ℃； 傳輸線溫度250 ℃； 溶劑延遲3 min； 采集質(zhì)量范圍m／z 30～350； 工作站為MASS HUNTER。

3 結(jié)果

3.1 吸光度 市售、 水蒸餾法制備、 鹽析法制備、 酸浸法制備、 酸浸鹽析法制備柴胡注射液吸光度分別為0.449 0、0.651 7、 0.5963、 1.1758、 0.824 4， 可知吸光度最低的為市售， 其次為鹽析法、 水蒸法、 酸浸鹽析法制備， 最高的為酸浸法制備。

3.2 色譜圖 圖2 ～6 顯示， 市售不同工藝制備的樣品色譜圖有明顯差異， 出峰時(shí)間和成分?jǐn)?shù)量明顯不同。 市售、水蒸餾法制備、 鹽析法制備、 酸浸法制備、 酸浸鹽析法制備的色譜峰總面積分別為100 218 400、 106 965 460、54 324 058、 58 264 089、 38 013 458， 差異很大， 最高的為水蒸法制備， 最低的為酸浸鹽析法制備。

3.3 成分鑒定 根據(jù)MST14 譜庫(kù)檢索定性分析各組分，采用色譜峰面積歸一法進(jìn)行相對(duì)定量。 表1 顯示， 5 種柴胡注射液中一共鑒定出140 種成分， 其中1 號(hào)樣品25 種，2 號(hào)樣品33 種， 3 號(hào)樣品52 種， 4 號(hào)樣品60 種， 5 號(hào)樣品23 種， 正己醛、 庚醛、 苯甲醛、 壬醛、 正辛醛為這5 種樣品的共有成分。

圖2 市售樣品GC-MS 色譜圖

圖3 水蒸法樣品GC-MS 色譜圖

圖4 鹽析法樣品GC-MS 色譜圖

圖5 酸浸法樣品GC-MS 色譜圖

圖6 酸浸鹽析法樣品GC-MS 色譜圖

表1 不同樣品中成分鑒定結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

4 討論

根據(jù)《中藥成方制劑》 第十七冊(cè)， 柴胡注射液稀釋10倍后在278 nm 波長(zhǎng)處的吸光度不小于0.65， 但只有水蒸法、 酸浸法和酸浸鹽析法提取的樣品達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)。 糠醛和5-甲基呋喃醛不僅是柴胡注射液的有害物質(zhì)， 也是引起不良反應(yīng)的主要成分； 糠醛是柴胡在酸鹽條件下柴胡纖維的水解產(chǎn)物， 5-甲基呋喃醛是柴胡皂苷中糖的水解產(chǎn)物[14］；注射液在275 nm 處的吸光度主要是糠醛的貢獻(xiàn)[15］， 故僅以吸光度來(lái)衡量柴胡注射液是否達(dá)標(biāo)有失偏頗， 缺乏專屬性， 也無(wú)法確定糠醛存在與否， 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)也已經(jīng)取消了關(guān)于吸光度的限定。

有報(bào)道稱， 正己醛、 正庚醛、 桉葉油醇、 桃金娘烯醇、匙桉醇、 桉葉素等具有解熱、 抗炎、 抗菌、 治療支氣管炎、急慢性鼻竇炎、 平喘、 祛痰的藥效學(xué)作用[16-21］。 GC-MS 結(jié)果表明， 5 種樣品一共鑒定出140 種成分， 其中正己醛、庚醛、 正辛醛、 苯甲醛、 壬醛為5 種樣品的共有成分， 它們與樣品藥效學(xué)的相關(guān)性值得進(jìn)一步研究。

市售樣品發(fā)現(xiàn)25 種成分， 有效成分正己醛28.38%、庚醛15.61%， 共占比約43.99%； 有害成分糠醛4.19%；其他主要成分有反式-2-壬烯醛3.18%、 5-ethylcyclopent-1-enecarboxaldehyde 5.50%、 壬 醛5.00%、 2， 5-二 氫 甲 苯5.51%、 2-methylene cycloheptanol， 4.96%、 正辛醛4.69%。

水蒸法提取樣品發(fā)現(xiàn)33 種成分， 有效成分正己醛2.44%、 庚醛6.93%、 桃金娘烯醇1.72%、 匙桉醇2.48%，共占比約13.57%； 其他主要成分有順-Z-α-環(huán)氧化紅沒(méi)藥烯5.03%、 2-甲氧基-3-仲丁基吡嗪4.97%、 4-乙?；?1-甲基-環(huán) 己 烯7.60%、 壬 醛5.63%、 2-羥 基-3， 5-辛 二 烯4.05%、 2， 3-辛二酮6.45%、 苯甲醛4.64%。

鹽析法提取樣品發(fā)現(xiàn)52 種成分， 有效成分正己醛4.75%、 庚醛5.92%、 桉葉油醇1.75%、 匙桉醇1.61%，共占比約14.03%； 有害成分糠醛3.08%； 其他主要成分有2， 5， 5-trimethyl-1， 3， 6-heptatriene 3.19%、 4-乙 酰 基-1-甲基-環(huán)己烯4.19%、 2-methyl-3-methylene-1-cyclopentanecarboxylic acid methyl ester 5.68%、 acetic acid、 1， 7， 7-trimethyl-bicyclo [2.2.1］ hept-2-yl ester 3.83%。

酸浸法提取樣品發(fā)現(xiàn)60 種成分， 有效成分正己醛2.32%、 庚 醛 0.77%、 1、 4-桉 葉 素 1.02%、 匙 桉 醇0.70%、 桉葉油醇3.53%， 共占比約8.34%； 有害成分糠醛19.33%、 5-甲基呋喃醛[16］2.62%， 共占比約21.95%；其他主要成分有bisabolol oxide B 3.76%、 合成右旋龍腦4.73%、 反式-2-壬烯醛4.29%、 4-乙?；?1-甲基-環(huán)己烯4.91%、 1， 5-dimethyl-6-methylenespiro [2.4 ］ heptanes 4.45%、 2-糠酸甲酯5.62%。

酸浸鹽析法提取樣品發(fā)現(xiàn)23 種成分， 有效成分正己醛17.15%、 庚 醛5.56%、 1、 4-桉 葉 素2.59%， 共 占 比 約25.30%； 有害成分糠醛3.87%、 3-糠醛4.72%， 共占比約8.59%； 其他主要成分有（＋） -莰醇6.65%、 反式月桂烯醛8.32%、 對(duì)乙氧基苯胺3.74%、 4-乙酰基-1-甲基-環(huán)己烯6.77%、 3-甲基四氫苯酐10.19%、 4-乙烯基環(huán)己酮5.33%、2-糠酸甲酯5.75%。

根據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[22］， 柴胡注射液應(yīng)是用水蒸法浸泡蒸餾所得， 氣相色譜檢測(cè)每1 mL 樣品含糠醛不得超過(guò)60 μg。但結(jié)果顯示， 水蒸法提取的樣品是唯一不含糠醛、 3-糠醛、5-甲基呋喃醛這3 種有害成分的， 表明制備工藝對(duì)產(chǎn)品成分有決定性作用， 而酸浸法和酸浸鹽析法提取制備的樣品有害成分占比是最高的， 因此不建議使用這2 種生產(chǎn)工藝制備。 隨著柴胡注射液在臨床上的廣泛應(yīng)用， 為確保臨床用藥安全， 有必要對(duì)糠醛含有量進(jìn)行更嚴(yán)格的限制。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中只有正己醛的特征圖譜， 沒(méi)有相應(yīng)的含有量規(guī)定， 所以課題組認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)不夠完善， 一是目前還沒(méi)有正己醛和柴胡注射液藥效相關(guān)的直接證據(jù)； 二是柴胡注射液相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的可能有效成分除了正己醛外， 還有正庚醛、 桉葉油醇、 桃金娘烯醇、 匙桉醇、 桉葉素等； 三是若只對(duì)正己醛做特征圖譜， 而沒(méi)有最低含有量限制， 難免有不法廠家為了達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)而對(duì)柴胡蒸餾液進(jìn)行稀釋， 進(jìn)而既可降低糠醛含有量， 又可增加產(chǎn)量， 影響藥效。 因而， 需對(duì)柴胡注射液進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)， 驗(yàn)證其作用物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制， 確定有效物質(zhì)的種類及其含有量， 進(jìn)一步完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。