牛膽汁對化風(fēng)丹藥母發(fā)酵減毒的影響

曹國瓊， 張永萍?， 徐 劍， 高 莉， 廖小剛

（1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550002； 2. 遵義廖元和堂藥業(yè)有限公司， 貴州 遵義 563000）

化風(fēng)丹是貴州省傳統(tǒng)名藥， 收載于《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科分冊》， 具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、 豁痰開竅的功效， 臨床用于治療風(fēng)痰閉阻、 中風(fēng)偏癱、 癲癇等癥， 療效顯著， 1951 年被列入國務(wù)院保護(hù)的四大名藥之一， 2008 年入選國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄[1-2］。 化風(fēng)丹的制備分為藥母制備和成藥制備， 藥母的制備工藝為川烏、 半夏、 天南星、 白附子、 郁金打粉， 加入神曲和牛膽汁混勻， 自然條件下發(fā)酵2 至3 月， 陰干后即得， 其中含毒性藥材川烏、 半夏、 天南星、 白附子， 故需進(jìn)行發(fā)酵后方可制劑， 其主要目的是降低藥母中毒性成分， 包括川烏中雙酯型生物堿， 半夏、 天南星、 白附子中草酸鈣針晶、 凝集素蛋白。 其中， 雙酯型生物堿毒性最強(qiáng)， 小鼠灌胃給藥烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿后， 三者半數(shù)致死量（LD50） 值分別為1.0 ～1.8、1.9、 5.8 mg／kg[3］。 目前， 化風(fēng)丹的研究主要集中在藥理和毒理[4-6］， 而關(guān)于其藥母發(fā)酵減毒僅有課題組前期的部分研究[7-8］。

牛膽汁為?？苿游稂S牛Bos taurus domesticus Gmelin 或水牛Bubalus bubalis Linnaeus 的膽汁， 味苦， 性大寒， 無毒， 具有清肝明目、 利膽通暢、 解毒消腫的功效[9］。 除藥用價值外， 牛膽汁常用于炮制有毒藥物， 如天南星[10］， 因牛的品種、 性別、年齡、 飼養(yǎng)條件不同， 其膽汁的pH 值、 密度、 膽酸等均存在差異， 對化風(fēng)丹藥母發(fā)酵降低毒性生物堿是否有影響還未見報道。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， 化風(fēng)丹藥母隨發(fā)酵時間的延長3 種雙酯型生物堿含有量逐漸降低[7］， 并優(yōu)選出化風(fēng)丹藥母發(fā)酵的溫度和濕度。 在此基礎(chǔ)上，本實驗研究牛膽汁對發(fā)酵過程中雙酯型生物堿含有量的影響。

1 材料

LC-2010CHT 型高效液相色譜儀（UV-VIS 檢測器、 LC Solution 色譜工作站， 日本島津公司）；AE240 型電子分析天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）； 超聲波清洗儀（上海高信化玻儀器有限公司）； HH-S 型恒溫水浴鍋 （江蘇國勝實驗儀器廠）； LRH-150S 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（廣東醫(yī)療器械廠）； GBC Cintra20 紫外可見分光光度計（澳大利亞照生公司）； PHS-2C 型精密酸度計（武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司）。

膽 酸 （100078-200414）、 烏 頭 堿 （110720-200410）、 新 烏 頭 堿 （0799-9403）、 次 烏 頭 堿（11079-200805） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。 乙腈為色譜純（美國天地公司）； 四氫呋喃、 異丙醇為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）； 其余試劑均為分析純； 水為娃哈哈純凈水。

藥母由遵義廖元和堂藥業(yè)有限公司提供； 牛膽汁購于市場， 共36 份， 趁鮮取得， 置棕色瓶中，在-20 ℃冷藏， 備用。

2 方法

2.1 牛膽汁理化指標(biāo)測定

2.1.1 pH 值 精密酸度計測定牛膽汁pH 值。

2.1.2 總固體 精密量取牛膽汁25 mL， 置于已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中， 水浴上蒸干， 105 ℃下干燥3 h， 置于干燥器中冷卻30 min， 迅速精密稱定質(zhì)量， 作為牛膽汁中的總固體。

2.1.3 密度 精密吸取牛膽汁25 mL， 稱定質(zhì)量，將其除以體積， 作為牛膽汁的密度。

2.1.4 總膽酸 按文獻(xiàn)[11］ 報道的方法， 測定牛膽汁中總膽酸含有量。

2.1.4.1 對照品溶液制備 精密稱取膽酸對照品0.300 3 g， 置25 mL 量瓶中， 加60%冰醋酸溶解，定容， 搖勻， 即得（12.012 mg／L）。

2.1.4.2 供試品溶液制備 精密吸取牛膽汁0.5 mL于蒸發(fā)皿中， 80 ℃水浴揮干， 殘渣用60%冰醋酸溶解， 轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中， 60%冰醋酸稀釋至刻度， 搖勻。 從中精密吸取0.5 mL 置于25 mL量瓶中， 加入水-濃硫酸（1 ∶1） 混合液至刻度， 75 ℃水浴中加熱10 min， 迅速移至冰浴中放置2 min， 取出， 即得。

2.1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取對照品溶液2 mL， 置于50 mL 量瓶中， 60%冰醋酸定容至刻度， 取2、3、 4、 5、 6、 7 mL 置于25 mL 量瓶中， 加入水-濃硫酸（1 ∶1） 混合液至刻度， 75 ℃水浴中加熱10 min， 迅速移至冰浴中放置2 min， 并以相應(yīng)試劑為空白， 于388 nm 波長處測定。 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 吸光度為縱坐標(biāo)（A） 進(jìn)行回歸，得方程為A=0.128 5X ＋0.092 9 （R2=0.999 1），在0.961 0～3.333 4 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液1 mL， 置于25 mL 量瓶中， 60% 冰醋酸定容至刻度， 從中取出6 mL 于25 mL 量瓶中， 加入水-濃硫酸（1 ∶1） 混合液至刻度， 75 ℃水浴中加熱10 min， 迅速移至冰浴中放置2 min， 以相應(yīng)試劑為空白， 于388 nm 波長處測定6 次， 測得膽酸吸光度RSD 為0.51%， 表明儀器精密度良好。

2.1.4.5 重復(fù)性試驗 精密吸取同一批膽汁6 份，每份0.5 mL， 按“2.1.4.2” 項下方法制備6 份供試品溶液， 在388 nm 波長處測定吸光度， 計算含有量。 結(jié)果， 膽酸含有量RSD 為2.45%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份膽汁0.5 mL， 按“2.1.4.2” 項下方法制備供試品溶液和空白對照液， 在0、 20、 40、 60、 80、 100 min測定吸光度。 結(jié)果， 膽酸吸光度RSD 為2.27%，表明樣品在100 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.7 加樣回收率試驗 精密吸取含有量已知的膽汁0.25 mL， 共6 份， 加入膽酸對照品適量，按“2.1.4.2” 項下方法制備供試品溶液， 測得膽酸的平均加樣回收率為99.82%。

2.1.4.8 樣品含有量測定 按“2.1.4.2” 項下方法制備供試品溶液和空白對照液， 在388 nm 波長處測定吸光度， 計算含有量。

2.2 發(fā)酵藥母制備 按藥母處方量稱取生川烏、生半夏、 生南星、 白附子、 郁金、 神曲， 混合均勻， 分為36 份， 加入已測定過pH 值、 總固體、密度、 膽酸的36 份牛膽汁混勻， 于溫度35 ℃、 相對濕度60%下發(fā)酵， 在未發(fā)酵及發(fā)酵4 周取樣用于檢測（發(fā)酵溫度、 濕度為課題組前期通過正交試驗確定的最佳條件， 藥母發(fā)酵4 周左右即可）。

2.3 發(fā)酵藥母含有量測定 參照文獻(xiàn)[7］ 報道的方法， 測定未發(fā)酵及發(fā)酵4 周川烏中烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿的含有量。

2.3.1 對照品溶液制備 取烏頭堿、 新烏頭堿、次烏頭堿對照品適量， 精密稱定， 加異丙醇-三氯甲烷 （1 ∶ 1） 混 合 液 制 成 每1 mL 含 烏 頭 堿0.129 mg、 新烏頭堿0.161 mg、 次烏頭堿0.140 mg，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 取藥母約2.5 g， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 加入氨試液1.5 mL， 精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1 ∶1） 混合溶液25 mL，稱定質(zhì)量， 超聲30 min， 放冷， 再稱定質(zhì)量， 混合溶液補(bǔ)足減失質(zhì)量， 搖勻， 過濾， 精密量取續(xù)濾液12.5 mL， 50 ℃水浴揮干， 殘渣精密加入1.5 mL混合溶液溶解， 過濾， 取續(xù)濾液， 即得。

2.3.3 色譜條件 Inertsil ODS-SP 色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動相（乙腈-四氫呋喃） （A） -0.1 mol／L 乙酸銨（B）， 梯度洗脫（0～22 min， 20% ～23% A； 22 ～40 min， 23% ～25%A）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測波長235 nm。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2、4、 6、 8、 10、 12 μL， 以峰面積為縱坐標(biāo) （Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸， 得烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿方程分別為Y=824.18X ＋455.61（r=0.999 9）、 Y=1 014.1X-16 161 （ r=0.999 9）、Y= 1 089.5X-7 990.3 （r = 0.999 9）， 分別在0.258～1.548、 0.322～2.254、 0.280 ～1.960 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，進(jìn)樣量10 μL， 連續(xù)測定6 次， 記錄峰面積， 測得烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿峰面積RSD 分別為1.58%、 1.47%、 1.19%， 表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液， 于0、 2、 4、 6、 12、 24 h 進(jìn)樣10 μL測定， 測得烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿峰面積RSD 分別為2.96%、 1.27%、 0.73%， 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取同一批藥母粉末6 份， 按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液， 進(jìn)樣10 μL測定， 測得烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿含有量RSD 分別為2.11%、 1.50%、 2.52%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿對照品各0.66、 1.68、 2.12 mg 至10 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度。 精密稱定含有量已知的藥母粉末約1.25 g， 共6 份， 加入對照品溶液0.5 mL， 按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.3.3” 項色譜條件下進(jìn)樣測定， 計算回收率。 結(jié)果， 烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿平均加樣回收率 （RSD） 分別為98.64% （2.72%）、96.61% （1.15%）、 98.80% （1.91%）。

2.3.9 樣品含有量測定 分別精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL 進(jìn)樣測定， 計算含有量。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0 軟件計算實驗數(shù)據(jù)的平均值、 標(biāo)準(zhǔn)差、 變異系數(shù)和極差。 主成分和聚類分析采用DPS 7.0 軟件， 各樣本間的聚類距離為歐氏距離， 聚類采用離均差平方和法。

3 結(jié)果與分析

3.1 藥母未發(fā)酵生物堿含有量 取未發(fā)酵藥母3份， 按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液， 測定其中烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿含有量， 并計算其總和， 見表1。

表1 未發(fā)酵藥母中3 種雙酯型生物堿含有量Tab.1 Contents of three kinds of diester-alkaloids in unfermented medicine

3.2 牛膽汁理化指標(biāo)和雙酯型生物堿含有量 測定牛膽汁密度、 pH 值、 總固體、 膽酸和雙酯型生物堿含有量， 見表2。 藥母經(jīng)發(fā)酵4 周后， 新烏頭堿、 次烏頭堿、 烏頭堿含有量均減少。

3.3 統(tǒng)計分析 藥母中烏頭堿（0～0.005 0 mg／g）、新烏頭堿（0～0.024 3 mg／g）、 次烏頭堿（0.011 5～0.066 5 mg／g）、 總生物堿（0.011 5～0.090 8 mg／g）及牛膽汁中總固體（0.037 7 ～0.194 1 g）、 膽酸（9.940 1～37.236 4 mg／mL） 差異較大， 變異系數(shù)分別 為 280.00%、 78.05%、 29.02%、 34.13%、48.83%、 30.77%； 膽汁密度（0.998 ～1.100 g／mL）和膽汁pH 值（6.27～7.29） 差異較小， 變異系數(shù)僅為2.14%、 4.55%。 見表3。

3.4 相關(guān)性分析 牛膽汁pH 值與膽汁密度、 膽酸含有量存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）， 膽汁密度與膽酸含有量亦然（P＜0.01）； 膽酸含有量與次烏頭堿、 烏頭堿含有量存在顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），膽汁的其他指標(biāo)與雙酯型生物堿含有量無顯著相關(guān)性（P＞0.05）； 新烏頭堿含有量與次烏頭堿、 總生物堿含有量存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。 見表4。

3.5 主成分分析 3 個主成分累計貢獻(xiàn)率達(dá)78.589%， 其中主成分一貢獻(xiàn)率最大， 為38.69%；

其次為二、 三， 貢獻(xiàn)率分別為26.662%， 13.238%。見表5。

表2 牛膽汁及藥母主要指標(biāo)Tab.2 Main indices of cattle bile and medicine

表3 牛膽汁及藥母主要指標(biāo)變化范圍Tab.3 Variation ranges of main indices of cattle bile and medicine

表4 牛膽汁及藥母主要指標(biāo)相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of main indices of cattle bile and medicine

表5 牛膽汁及藥母指標(biāo)主成分分析Tab.5 Principal component analysis of main indices of cattle bile and medicine

第一主成分特征值3.095， 貢獻(xiàn)率38.69%。在特征向量中， 載荷較高符號為正的指標(biāo)有新烏頭堿、 次烏頭堿、 總生物堿， 其特征向量值分別為0.683、 0.847、 0.891， 所以因子1 可作為生物堿因子； 符號為負(fù)的有膽汁密度、 膽汁pH 值、 總固體和膽酸。

第二主成分特征值2.133， 貢獻(xiàn)率26.662%。在特征向量中， 載荷較高符號為正的指標(biāo)有膽汁密度、 總固體、 膽酸， 其特征向量值分別為0.620、0.812、 0.579， 所以因子2 可作為牛膽汁因子； 符號為負(fù)的有膽汁pH 值和總生物堿。

第三主成分特征值1.059， 貢獻(xiàn)率13.238%。在特征向量中， 載荷較高符號為正的指標(biāo)有膽汁pH 值、 膽 酸， 其 特 征 向 量 值 分 別 為 0.582、0.447， 所以因子3 可作為膽汁因子； 符號為負(fù)的有膽汁密度、 總固體和烏頭堿。

3.6 聚類分析 在聚類距離35 處將樣品聚為3 大類群， 見圖1， 又有不同的亞類（在此不作細(xì)分）。各類群的平均值和變幅見表6。

圖1 各樣品樹狀圖Fig.1 Dendrogram of various samples

表6 牛膽汁及藥母指標(biāo)各類群特征Tab.6 Characteristics of various groups of cattle bile and medicine

第一類群包含14 份材料， 主要特征是膽汁pH值6.74、 密度1.010 g／mL、 總固體0.060 7 g、 膽酸16.93 mg／mL； 新烏頭堿0.006 0 mg／g、 次烏頭堿0.042 4 mg／g、 烏頭堿0.009 mg／g、 總生物堿0.049 4 mg／g。 其中膽汁pH 值、 密度、 總固體、膽酸含有量在3 個類群中最小； 藥母中雙酯型生物堿含有量分別為新烏頭堿含有量在3 個類群中最小， 烏頭堿含有量最大， 次烏頭堿、 總生物堿含有量處于中間位置。

第二類群包含8 份材料， 主要特征是膽汁pH值6.84、 密度1.015 g／mL、 總固體0.069 7 g、 膽酸23.73 mg／mL； 新烏頭堿0.012 0 mg／g、 次烏頭堿0.045 5 mg／g、 烏頭堿0.000 6 mg／g、 總生物堿0.058 1 mg／g。 其中膽汁pH 值、 密度、 總固體、膽酸含有量在3 個類群中排在中間位置； 藥母中雙酯型生物堿含有量分別為新烏頭堿、 次烏頭堿、 總生物堿含有量在3 個類群中最大， 烏頭堿含有量處于中間位置。

第三類群包含14 份材料， 主要特征是膽汁pH值6.86、 密度1.029 g／mL、 總固體0.108 6 g、 膽酸32.64 mg／mL； 新烏頭堿0.008 2 mg／g、 次烏頭堿0.038 8 mg／g、 烏頭堿0.000 0 mg／g、 總生物堿0.047 0 mg／g。 其中膽汁pH 值、 密度、 總固體、膽酸含有量在3 個類群中最大； 藥母中雙酯型生物堿含有量分別為新烏頭堿含有量處于中間位置， 次烏頭堿、 烏頭堿、 總生物堿含有量在3 個類群中最小。

由此可知， 第三類群雙酯型生物堿含有量較低， 適宜化風(fēng)丹藥母的發(fā)酵。 膽汁pH 值范圍6.27～7.29， 密度范圍1.003 ～1.100 g／mL， 總固體范圍0.051 7 ～0.194 1 g， 膽酸范圍28.48 ～37.24 mg／mL。

4 討論與結(jié)論

化風(fēng)丹藥母中川烏、 半夏、 天南星、 白附子均有毒， 其中川烏毒性最大， 采用自然發(fā)酵時可降低藥母毒性。 文獻(xiàn)報道， 化風(fēng)丹藥母藥用真菌對川烏、 草烏進(jìn)行發(fā)酵時可明顯降低烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿含有量[12-13］； 本研究結(jié)果表明， 化風(fēng)丹藥母經(jīng)過發(fā)酵后， 川烏中3 種雙酯型生物堿烏頭堿、 新烏頭堿、 次烏頭堿含有量降低。 發(fā)酵實際上是生物轉(zhuǎn)化的過程， 微生物在生長代謝時產(chǎn)生豐富的酶， 如淀粉酶、 纖維素酶、 蛋白酶等， 能產(chǎn)生多種反應(yīng)， 分解轉(zhuǎn)化原料中特定的底物， 生成新的活性成分， 同時產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物， 起到增效減毒作用。

化風(fēng)丹藥母加入牛膽汁進(jìn)行發(fā)酵時， 后者對藥雙酯型生物堿含有量降低發(fā)揮著一定作用， 膽酸含有量與次烏頭堿、 烏頭堿含有量存在顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）， 而膽酸含有量與膽汁pH 值存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）， 推測在發(fā)酵過程中膽汁pH值可能對藥母毒性成分有較大影響， 作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 本實驗揭示了化風(fēng)丹藥母在發(fā)酵過程中牛膽汁理化指標(biāo)、 雙酯型生物堿含有量的變化規(guī)律及兩者相關(guān)性， 為相關(guān)輔料選用提供依據(jù)。