續(xù)斷切制工藝的優(yōu)化

李 妍， 王建科?， 王新村， 王元鎂

（1. 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州同濟(jì)堂中藥材種植有限公司， 貴州 貴陽(yáng)550009）

續(xù)斷是傳統(tǒng)常用中藥， 首載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》， 被列為上品[1］， 為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall. ex Henry 的干燥根， 在秋季采挖，除去蘆頭及須根， 清洗后用微火烘至半干， 堆積“發(fā)汗” 至內(nèi)部變綠后再烘干[2］， 它含有三萜皂苷、 木通皂苷、 馬錢子苷、 多糖、 β-谷甾醇等成分， 另外其揮發(fā)油主要組成有漪羅艾菊酮、 2， 4，6-三叔丁基苯酚等[1，3-6］。 藥理研究表明， 續(xù)斷對(duì)骨組織、 生殖系統(tǒng)、 免疫系統(tǒng)、 神經(jīng)系統(tǒng)等均有一定影響， 具有抗炎、 抗衰老、 修復(fù)肝損傷等藥理作用[7-14］。 然而， 目前續(xù)斷切制工藝尚無(wú)具體的技術(shù)參數(shù)， 導(dǎo)致飲片質(zhì)量參差不齊， 影響臨床療效發(fā)揮及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展， 故本研究采用正交試驗(yàn)優(yōu)化該藥材切制工藝， 為其進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）； TU-1810 型紫外-可見(jiàn)分光光度儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AUW220D 型全自動(dòng)電子天平[島津儀器（蘇州）有限公司］； 中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥 川續(xù)斷皂苷Ⅵ（批號(hào)GZDD-0006） 對(duì)照品購(gòu)于貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司。 續(xù)斷采自貴州同濟(jì)堂中藥材種植有限公司續(xù)斷種植基地（威寧縣二塘鎮(zhèn)梅花村）， 經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥教研室魏升華教授鑒定為續(xù)斷科植物川續(xù)斷Dipsacus asper Wall. ex Henry 的干燥根， 將其除去雜質(zhì)， 洗凈， 潤(rùn)透， 切薄片， 干燥， 篩去碎屑。 甲醇、 乙醇、 磷酸均為分析純； 甲醇、 乙腈均為色譜純； 水為純凈水，

2 方法與結(jié)果

2.1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含有量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agilent Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.20%磷酸（30 ∶ 70）； 檢 測(cè) 波 長(zhǎng)206 nm； 體 積 流 量1 mL／min； 柱溫30 ℃； 進(jìn)樣量20 μL。 色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 川續(xù)斷皂苷ⅥHPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of asperosaponin Ⅵ

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量， 甲醇稀釋成1.5 mg／mL， 精密量取1 mL 置于10 mL 量瓶中， 流動(dòng)相稀釋至刻度， 搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材細(xì)粉約0.5 g， 置于50 mL 具塞錐形瓶中， 精密加入15 mL 90%甲醇， 密塞， 稱定質(zhì)量， 回流提取3 次， 每次30 min， 放冷， 90% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻，濾過(guò)， 合并濾液， 精密吸取1 mL， 置于10 mL 量瓶中， 流動(dòng)相稀釋至刻度， 搖勻， 0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾， 即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品15.05 mg， 甲醇稀釋成1.505 mg／mL， 精密吸取0.05、 0.2、 0.8、 1.2、 1.8 mL 于2 mL 量瓶中，甲醇定容， 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測(cè)定。 以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 得方程為Y=4.616 6X ＋1.038 3（r=0.999 8）， 在0.075 3～2.709 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 續(xù)斷總皂苷含有量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量， 甲醇定容至25 mL， 即得（0.226 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末約0.3 g， 加入60 mL 70% 乙醇， 超聲 （500 W、40 kHz） 50 min， 濾過(guò)， 濾液置于100 mL 量瓶中，70%乙醇定容至刻度， 搖勻， 即得。

2.2.3 顯色條件 精密吸取供試品0.3 mL 于10 mL比色管中， 沸水浴揮干溶劑， 精密加入甲醇2 mL、 濃硫酸3 mL， 密塞， 搖勻， 95 ℃恒溫水浴中加熱20 min 后， 再放入冰水浴中冷卻5 min， 搖勻， 于528 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.3、0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9 mL 于具塞試管中， 隨行試劑作為空白對(duì)照， 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法操作， 于528 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。 以吸光度為縱坐標(biāo)（A）， 進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，得方程為A = 3.641X-0.022 6 （r = 0.999 6），在0.067 8～0.203 4 mg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 水浸出物測(cè)定 參照2015 年版《中國(guó)藥典》四部水浸出物項(xiàng)下熱浸法測(cè)定。

2.4 醇浸出物測(cè)定 參照2015 年版《中國(guó)藥典》四部醇浸出物項(xiàng)下熱浸法測(cè)定， 以50%乙醇為溶劑。

2.5 切制工藝優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗(yàn) 以川續(xù)斷皂苷Ⅵ、 總皂苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 對(duì)軟化用水量（A）、 軟化時(shí)間（B）、切制片型（C）、 干燥溫度（D） 進(jìn)行考察， 發(fā)現(xiàn)在軟化用水量2 倍、 軟化時(shí)間4 h、 切制片型橫片、干燥溫度80 ℃條件下效果最佳。

2.5.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上， 各因素選取3 個(gè)水平， 通過(guò)L9（34） 正交表安排試驗(yàn)。 取9 份藥材， 每份1 kg， 按表1 參數(shù)設(shè)計(jì)， 加入不同用量水軟化一定時(shí)間后取出， 切制成不同片型， 于不同溫度下干燥， 得到9 份樣品， 粉碎， 過(guò)40 目篩， 測(cè)定各成分含有量， 再進(jìn)行綜合評(píng)分。 根據(jù)所測(cè)成分在藥材中的重要性， 設(shè)定權(quán)重分別為川續(xù)斷皂苷Ⅵ40%、 總皂苷30%、 醇浸出物15%、 水浸出物15%， 計(jì)算公式為綜合評(píng)分=川續(xù)斷皂苷Ⅵ隸屬度×40% ＋總皂苷隸屬度×30% ＋醇浸出物隸屬度×15%＋水浸出物隸屬度×15% [隸屬度= （指標(biāo)值-指標(biāo)最小值） /（指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值） ］， 滿分1.00。 結(jié)果見(jiàn)表1， 方差分析見(jiàn)表2。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.1 Design and results of tests

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

由表1 可知， 各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響程度依次為D＞B＞C＞A， 即干燥溫度影響最大， 軟化用水量影響最小， 最優(yōu)工藝為A2B3C1D2； 由表2 可知，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。 綜合各因素考慮， 最終確定最優(yōu)工藝為A2B3C2D2，即用4 倍量水軟化藥材， 軟化時(shí)間6 h， 切橫片，干燥溫度70 ℃。

2.6 切制工藝比較 取藥材3 份， 每份5 kg， 分別按“1.2” 項(xiàng)下傳統(tǒng)工藝和“2.5.2” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝切制， 測(cè)定川續(xù)斷皂苷Ⅵ、 續(xù)斷總皂苷、 水浸出物、 醇浸出物含有量， 結(jié)果見(jiàn)表3 ～4。 由表可知， 優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行， 測(cè)得值高于傳統(tǒng)工藝。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所用續(xù)斷采自種植基地， 按照傳統(tǒng)工藝加工， 即將新鮮藥材剪掉須根及蘆頭， 清洗干凈，濾水， 60 ℃干燥箱中減重， 堆積“發(fā)汗” 以使藥材內(nèi)部變綠后再烘干。 切制時(shí)， 先用水軟化續(xù)斷，發(fā)現(xiàn)切制后其外表皮呈灰褐色， 而切面皮部呈墨綠色， 并且在軟化過(guò)程中出現(xiàn)下色現(xiàn)象， 是否表明某些成分有損失或變化尚需進(jìn)一步研究。

表3 傳統(tǒng)工藝下含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of content determination under traditional process （n=3）

表4 優(yōu)化工藝下含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of content determination under optimized process （n=3）

多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)符合中藥多功效的用藥特點(diǎn)，也可體現(xiàn)中醫(yī)藥思維的整體觀念。 本研究采用該方法優(yōu)化續(xù)斷切制工藝， 所得最佳條件為取烘干減重50% “發(fā)汗” 后于60 ℃下干燥的藥材， 加入4 倍量水軟化6 h， 取出， 稍潤(rùn)， 橫切3 mm 厚片，70 ℃下烘干， 川續(xù)斷皂苷Ⅵ、 續(xù)斷總皂苷、 水浸出物、 醇浸出物含有量分別為7.86%、 14.08%、43.71%、 42.93%， 四者均高于傳統(tǒng)工藝， 可知優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行， 可用于該藥材加工。