一測多評法測定降脂寧顆粒中的3種有機酸類成分含量

貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004

降脂寧顆粒最早收載于吉林省藥品標準(1986年版)，原名“血脂寧沖劑”。處方由山楂(去核)、制何首烏、決明子、荷葉4味藥材組成，具有降血脂、軟化血管的作用。從國家食品藥品監(jiān)督管理總局數(shù)據(jù)庫中查詢到，目前其執(zhí)行標準共11份，尚未對方中君藥山楂進行含量控制，而山楂質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響降脂寧顆粒的藥效。山楂的化學成分主要包括黃酮及黃酮苷類、有機酸類、黃烷類及其聚合物等，有機酸類是山楂健胃消食的有效成分[1-7]。研究選取山楂中的有機酸類成分新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸作為指標性成分進行含量測定。

復方中藥制劑中藥效的發(fā)揮是多組分共同作用的結(jié)果，其成分具有多樣性、復雜性特點。因此，中藥制劑較單味藥材更需要強調(diào)其多成分、多靶點特征。為了更好的控制降脂寧顆粒中山楂的含量，實驗采用多指標質(zhì)量控制的“一測多評”方法首次對降脂寧顆粒山楂含量進行全面的控制，通過對一個對照品易得成分的測定，實現(xiàn)多個成分的同步監(jiān)控，本文以綠原酸為內(nèi)參物，采用高效液相色譜法測3個有機酸類成分含量，改善目前中檢院尚無新綠原酸、隱綠原酸等對照品供應(yīng)情況，尤其是完善了現(xiàn)行質(zhì)量標準中無君藥山楂含量控制問題[8-15]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Ultimate 3000液相色譜儀及配套工作站(PDA檢測器，賽默飛世爾科技有限公司)；色譜柱：依利特 ODS2 C18，(4.6mm×250mm,5.0 μm)；Agilent ZORBAX SB C18，(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)；Waters X-bridge C18，(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)；百萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 新綠原酸(批號：MUST-15011413，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：93.37%)、綠原酸(批號：110753-201415，中國食品藥品檢定研究院，含量：96.2%)、隱綠原酸(批號：MUST-15011413，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：99.07%)；降脂寧顆粒(生產(chǎn)企業(yè)：A公司，批號：a-1，a-2，a-3，a-4，a-5，a-6，a-7，a-8，a-9，a-10)。色譜乙腈(美國TEDIA，LOT 17080656)、甲醇(國藥集團化學試劑有限公司，10014118)，超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，按下表1規(guī)定進行梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸檢測波長為326 nm；理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于10000。圖譜見圖1。

2.2 混合對照品溶液的制備 稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品適量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL分別含35 μg、45 μg、34 μg溶液，搖勻，作為混合對照品儲備液。精密量上述對照品儲備液1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品混合溶液。

表1 流動相梯度洗脫比例

2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品，混勻，取適量，研細，取約3 g，精密稱定，置具塞錐瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，稱定重量，超聲(功率250 w，頻率100 kHz)處理45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品的制備 取不含山楂藥材的樣品，按照降脂寧顆粒配方(刪除山楂藥材)，模擬工藝制備陰性樣品，照供試品溶液制備項下方法制得陰性樣品溶液。

2.5 方法考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下對照品溶液，進樣量分別為2、3、5、10、15 μL分別注入液相色譜儀，以峰面積A對質(zhì)量數(shù)μg進行線性回歸計算，得到綠原酸的線性回歸方程為：y=32060x+69.71，r=0.9996，線性范圍0.0090 μg～0.0672 μg；隱綠原酸線性回歸方程為：y=2335x+94.32，r=0.9993，線性范圍0.0066 μg～0.03867 μg；新綠原酸線性回歸方程為：y=3455x+45.28，r=0.9991，線性范圍0.0077～0.0525 μg；結(jié)果表明3種成分線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗 精密量取“2.2”項下對照品溶液的制備項下的混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，其RSD值分別為新綠原酸1.7%、綠原酸0.6%、隱綠原酸1.5%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一批(批號：a-1)的樣品，按“2.1”項下含量測定方法，重復測定6次，記錄色譜圖，以綠原酸為S峰，其余2個成分的實際保留時間均在以S峰與相對保留時間所計算的時間范圍內(nèi)，故可通過校正因子計算出新綠原酸、隱綠原酸的含量，其RSD值分別為1.6%、1.0%、2.4%，表明方法重復性良好。結(jié)果見表2。

表2 重復性試驗

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批(批號：a-1)的樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0，24，48 h進樣，記錄色譜圖，測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量，其RSD值分別0.8%、1.9%、1.7%，結(jié)果表明48 h內(nèi)供試品溶液是穩(wěn)定的。

2.5.5 準確度 采用加樣回收法，取已知含量的樣品(批號：a-1 平均含量：含新綠原酸0.0182 mg/g、綠原酸0.5767 mg/g、隱綠原酸0.0224 mg/g)6份，每份1.5 g，精密加入對照品溶液(含新綠原酸：0.02559 mg/mL、綠原酸：0.1743 mg/mL、隱綠原酸：0.01988 mg/mL)1mL置具塞錐瓶中，揮干，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，以綠原酸為S峰，其余2個成分的實際保留時間均在以S峰與相對保留時間所計算的時間范圍內(nèi)，故可通過校正因子計算出新綠原酸、隱綠原酸的回收率，結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸平均加樣回收率RSD分別為1.7%、1.1%、1.0%。表明本方法具有良好的回收率。結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗

2.6 相對校正因子(fsi)和相對保留時間(t)的確定

2.6.1 校正因子的計算方法 多標多測的研究思路起源于內(nèi)標法、校正因子法、主成分自身對照法以及紫外百分吸收系數(shù)法等幾個概念。計算公式：fsi=fi/fs=(As/Cs)/(Ai/Ci)=(As·Ci)/(Ai·Cs)，式中As為內(nèi)參物峰面積，Ai為其他組分峰面積，Cs內(nèi)參物濃度，Ci為其他組分濃度。在方法學建立時，需要準備待測組分及所選內(nèi)參物的對照品，求出內(nèi)參物與個待測組分見的校正因子，并把它作為常數(shù)用于以后的含量測定計算中。含量測定過程中，只需準備內(nèi)參物的對照品，因而內(nèi)參物(s)濃度可按常規(guī)方法進行測定，應(yīng)用校正因子，結(jié)合內(nèi)參物實測值計算待測組分濃度(Ci)。

2.6.2 待測成分fsi和t的計算 取“2.2”項下的混合對照品溶液進樣，測定峰面積，以綠原酸為參照，以其相應(yīng)的峰為S1峰，計算各待測成分與綠原酸之間的fsi與t，結(jié)果相對保留時間及相對校正因子見下表4。

表4 相對校正因子及相對保留時間

2.7fsi耐用性考察

2.7.1 不同色譜柱對fsi和t的影響 采用高效液相色譜系統(tǒng)分別對三種品牌(依利特 ODS2、Agilent ZORBAX SB、waters X-bridge)的C18色譜柱分別進行測定，考察不同色譜柱對fsi和t的影響，記錄色譜圖，計算校正因子，RSD應(yīng)小于5.0%，結(jié)果見表5。

表5 色譜柱對fsi的影響

2.7.2 不同柱溫柱對fsi和t的影響 采用高效液相色譜系統(tǒng)，以柱溫20、30、40 ℃分別進行測定，考察不同柱溫對fsi和t的影響，記錄色譜圖，計算校正因子，RSD應(yīng)小于5.0%，結(jié)果見表6。

表6 柱溫對fsi的影響

2.7.3 不同體積流量對fsi和t的影響 采用高效液相色譜系統(tǒng)，分別考察了流速為0.8、1.0、1.2 mL·min-1體積流量對fsi和t的影響，記錄色譜圖，計算校正因子，RSD應(yīng)小于5.0%，結(jié)果見表7。

表7 體積流量對fsi的影響

2.7.4 不同人員對fsi和t的影響 采用高效液相色譜系統(tǒng)，考察人員對fsi和t的影響，精密吸取三位不同人員所配制的混合對照品溶液(見表8)，分別進行測定，記錄色譜圖，計算校正因子和相對保留時間，RSD應(yīng)小于5.0%，結(jié)果見表9。

表8 對照品的濃度

表9 人員對fsi的影響

2.7.5 不同儀器對fsi和t的影響 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液10 μL，分別采用Ultimate 3000，waters 2998不同廠牌高效液相色譜儀分別進行測定，記錄色譜圖，計算校正因子和相對保留時間，RSD應(yīng)小于5.0%，結(jié)果見表10。

2.8 一測多評法與外標法測定結(jié)果的比較 取10批降脂寧顆粒樣品按“2.3”項下制備供試品溶液，分別采用一測多評法和外標一點法對其進行定量計算，見表11。結(jié)果表明，常規(guī)的外標一點法測法實測量本實驗所建立的一測多評計算所得量，結(jié)果差異不大，證明本實驗所建立的方法具有較好的準確性和可行性，所得結(jié)果可靠。

表10 儀器對fsi的影響

表11 外標法與一測多評結(jié)果對比

3 討論

對于供試品制備方法的考察，實驗從提取方法(超聲和回流)、提取溶劑(20%甲醇，50%甲醇，80%甲醇，甲醇)以及提取時間(15 min，30 min，45 min)對降脂寧顆粒的提取效果進行了比較，結(jié)果表明，采用50%甲醇超聲提取45 min，3種有效成分的量較高，且色譜峰的分離效果最佳。

山楂有機酸類成分主要有熊果酸、枸櫞酸、綠原酸等，實驗設(shè)計初期，希望統(tǒng)一色譜條件下測定熊果酸、枸櫞酸、綠原酸三個有效成分，熊果酸極性與枸櫞酸和綠原酸相差較大，在一個色譜條件下，無法實現(xiàn)三者的共同測定。另據(jù)文獻報道[16]熊果酸不溶于水，而降脂寧顆粒中山楂工藝為用水煎煮，樣品中枸櫞酸峰達不到較好的分離效果，基于此考慮選取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對山楂進行評價。據(jù)報道[17]，綠原酸在酸性pH條件下十分穩(wěn)定，在中性和堿性pH條件及加熱情況下，綠原酸很容易水解并生成新綠原酸、隱綠原酸，因此采用一測多評測定三個成分的含量，以總量計評價降脂寧顆粒，更加合理。同時，通過中國食品藥品檢驗研究院網(wǎng)站查詢，中檢院暫無新綠原酸、隱綠原酸對照品銷售，故選擇常見的綠原酸作為山楂有機酸檢測的內(nèi)參物，用以測定有機酸類中新綠原酸與隱綠原酸的含量。

本實驗建立的綠原酸與其他2種有效成分的校正因子，并考察了不同規(guī)格色譜柱、柱溫、體積流量、人員、儀器對校正因子和相對保留時間的影響，結(jié)果RSD均<5%，表明各成分的相對保留因子重復性好。實驗中還采用外標外與一測多評法測定10批樣品指標性成分含量進行比較，結(jié)果2種方法所測值無明顯差異，說明該方法的建立基本達到節(jié)省對照品，以多指標控制藥品質(zhì)量的目的。