前列地爾對急性力竭大鼠心肌細胞缺血及凋亡的影響

靳麗麗 郄濤 張同樂

[摘要] 目的 觀察前列地爾對急性力竭大鼠心肌細胞缺血及凋亡的影響。 方法 將24只雄性SD大鼠（SPF級）按隨機數(shù)字表法分為對照組、力竭組、低劑量前列地爾預處理力竭組（前列地爾低劑量組）、高劑量前列地爾預處理力竭組（前列地爾高劑量組）。前列地爾低劑量組、前列地爾高劑量組分別給予前列地爾5、10 μg/（kg·d）腹腔注射7 d，對照組、力竭組給予0.9% NaCl 2 mL/（kg·d）腹腔注射7 d。酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測缺血修飾白蛋白（IMA）。對大鼠心肌細胞進行TUNEL檢測并觀察計算凋亡指數(shù)（AI）。免疫組化法檢測大鼠心肌Bax、Bcl-2含量。Western blot法檢測大鼠心肌Fas、Caspase-3、Caspase-9含量。 結(jié)果 ①力竭運動大鼠血清IMA含量顯著升高。與力竭組比較，前列地爾低劑量組和前列地爾高劑量組IMA明顯降低（P < 0.05），且前列地爾高劑量組較前列地爾低劑量組降低更為明顯（P < 0.05）。②力竭運動大鼠細胞凋亡明顯增多。與對照組比較，力竭組和前列地爾低劑量組AI明顯升高（P < 0.05）。前列地爾高劑量組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），前列地爾高劑量組較力竭組和前列地爾低劑量組明顯下降（P < 0.05）。③力竭組和前列地爾低劑量組的Bax蛋白表達較對照組明顯升高（P < 0.05）。前列地爾高劑量組較力竭組和前列地爾低劑量組顯著降低（P < 0.05）。力竭組和前列地爾低劑量組的Bcl-2蛋白量較對照組顯著降低（P < 0.05），前列地爾高劑量組較力竭組、前列地爾低劑量組明顯升高（P < 0.05）。④力竭組、前列地爾低劑量組和前列地爾高劑量組的Fas、Caspase-3較對照組均顯著升高（P < 0.05），前列地爾高劑量組和前列地爾低劑量組較力竭組顯著降低（P < 0.05）。力竭組Caspase-9高于對照組（P < 0.05），與力竭組比較，前列地爾低劑量組和前列地爾高劑量組Caspase-9明顯降低（P < 0.05）。前列地爾高劑量組Fas、Caspase-3和Caspase-9均較前列地爾低劑量組顯著降低（P < 0.05）。 結(jié)論 前列地爾可以減輕心肌細胞缺血，減少心肌細胞凋亡，對心肌細胞具有保護作用，且前列地爾對心肌細胞缺血保護及抑制凋亡的作用具有劑量依賴性。

[關(guān)鍵詞] 前列地爾；急性力竭；心肌缺血；心肌凋亡

[中圖分類號] R541 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（c）-0018-05

The effects of Alprostadil on myocardial ischemia and apoptosis in acute exhausted rats

JIN Lili1 QIE Tao2 ZHANG Tongle1 XU Bei3

1.Department of Cardiology， Baoding First Central Hospital， Hebei Province， Baoding 071000， China； 2.Department of Emergency， Baoding First Central Hospital， Hebei Province， Baoding 071000， China； 3.Department of Pediatric， Baoding First Central Hospital， Hebei Province， Baoding 071000， China

[Abstract] Objective To observe the effects of Alprostadil on myocardial ischemia and apoptosis in acute exhausted rats. Methods Twenty-four male SD rats （SPF grade） were divided into control group （group C）， exhausted exercise group （group E）， low dose Alprostadil group （group L） and high dose Alprostadil group（group H） by random number table method. Group L and group H were respectively given intraperitoneal injection of 5 μg/（kg·d） and 10 μg/（kg·d） of Alprostadil for 7 days； and 0.9% NaCl 2 mL/（kg·d） was given intraperitoneal injection of group C and group E for 7 days. Ischemic modified albumin （IMA） was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. TUNEL detection of rat cardiomyocytes and the apoptosis index （AI） was calculated. The Bax and Bcl-2 in rat myocardium were detected by immunohistochemistry. The Fas， Caspase-3 and Caspase-9 in rat myocardium were detected by Western blot. Results ①The serum IMA levels of exhausted exercise rats were significantly increased. Compared with group E， the levels of IMA of group L and group H were decreased significantly （P < 0.05）. The levels of IMA of group H decreased more significantly than group L （P < 0.05）. ②Myocardial apoptosis was increased significantly after exhausted exercise. AI of group E and group L were significantly higher than group C （P < 0.05）. There was no significant difference between group H and group C in AI （P > 0.05）. Compared with group E and group L， AI of group H decreased significantly （P < 0.05）. ③The expression of Bax protein of group E and group L were significantly higher than that of group C （P < 0.05）. Bax of group H was significantly lower than group E and group L （P < 0.05）. Compared with group C， the expression of Bcl-2 protein of group E and group L significantly decreased （P < 0.05）. Compared with group E and group L， Bcl-2 of group H increased significantly （P < 0.05）. ④The Fas and Caspase-3 of group E， group L and group H were significantly higher than group C （P < 0.05）， while group H and group L were significantly lower than group E （P < 0.05）. The Caspase-9 of group E was higher than group C （P < 0.05）， compared with group E， the levels of Caspase-9 of group L and group H were significantly decreased （P < 0.05）， and the levels of Fas， Caspase-3 and Caspase-9 of group H were significantly lower than group L （P < 0.05）. Conclusion Alprostadil can improve myocardial ischemia， reduce cardiomyocytes apoptosis. And Alprostadil has a dose-dependent effect on myocardial ischemia and cardiomyocytes apoptosis.

[Key words] Alprostadil； Acute exhaustion； Myocardial ischemia； Myocardial apoptosis

適當?shù)倪\動能提高機體適應力，促進代謝，對人體有益。劇烈運動、過度體力勞動甚至力竭性運動超出機體的承受能力，則會導致機體受損，而心臟是其中最為敏感的器官之一。力竭運動會導致心肌生化指標、形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，甚至猝死[1]。研究表明，細胞凋亡參與了運動性心肌損傷[2]。前列地爾成分是前列腺素E1，屬于天然的前列腺類物質(zhì)。目前的藥理研究表明，前列地爾不僅具有擴張血管、減輕心臟負荷的作用，同時有改善冠脈微循環(huán)、保護心肌細胞、抑制血小板聚集等作用[3-4]。更有研究顯示，前列地爾可以減少心肌細胞凋亡，保護心肌細胞[5]。目前關(guān)于前列地爾對心肌細胞凋亡影響的研究較少。本研究觀察了前列地爾對急性力竭大鼠心肌細胞缺血及凋亡的影響?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠（SPF級）24只（塑料飼養(yǎng)籠，并配置不銹鋼罩，每籠4只，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度21～24℃，自由飲水進食，光照時間每天12 h，5～7 d更換墊料），2月齡，體重（294.62±15.36）g。提供單位：河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003，合格證號編號：1703181。

1.2 儀器與試劑

前列地爾注射液（北京泰德制藥有限公司，批號：H10980023）。MultiscanGO酶標儀（Thermo Fisher scientific，芬蘭）；SIGMA 3K15高速冷凍離心機（Sigma-Aldrich，德國，離心力23 000 g）。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E13620r）檢測缺血修飾白蛋白（IMA）；原位細胞凋亡（TUNEL）檢測試劑盒（Roch公司，貨號：11684817910）；Bax抗體（英國Abcam公司，貨號：ab53154）；Bcl-2抗體（英國Abcam公司，貨號：ab59348）；Fas/FasL抗體（美國SantaCruz公司，貨號：sc-1023）；Caspase-3抗體（美國SantaCruz公司，貨號：sc-7148）；Caspase-9抗體（美國SantaCruz公司，貨號：sc-81663）；β-actin抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號：bs-0061R）；二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：sp-9000）；ECL發(fā)光試劑盒（美國Piece公司，貨號：32106）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組與動物模型建立 按隨機數(shù)字表法將大鼠分為四組（n = 6）：對照組、力竭組、低劑量前列地爾預處理力竭組（前列地爾低劑量組）、高劑量前列地爾預處理力竭組（前列地爾高劑量組）。在大鼠適應性飼養(yǎng)期間進行3次無負重適應性游泳訓練，每次20 min。適應性飼養(yǎng)1周后，前列地爾低劑量組、前列地爾高劑量組分別給予前列地爾5、10 μg/（kg·d）腹腔注射7 d，對照組、力竭組給予0.9% NaCl 2 mL/（kg·d）腹腔注射7 d。于給藥結(jié)束后次日進行實驗，正式實驗前動物禁食12 h。實驗時對照組不做任何運動，力竭組、前列地爾低劑量組、前列地爾高劑量組大鼠分別負重3%的錫絲，按Thomas力竭標準[6]游泳運動直至力竭（①大鼠沉入水下，無法返回水面，時間>10 s。②大鼠失去協(xié)調(diào)運動，在水中無方向性亂竄，即使沒有達到10 s也可以定義為力竭。如大鼠短時間就出現(xiàn)力竭，將其從水中撈出休息5 min，繼續(xù)使之游泳，確保其游泳時間至少2 h。密切觀察大鼠游泳過程，防止嗆水而致其意外死亡）。大鼠的力竭游泳槽為清潔塑料圓桶（60 cm×55 cm×50 cm）。水溫為32℃（上下浮動不超過1℃）。

1.3.2 血清及心肌標本采集及制備 對照組及力竭運動后的大鼠立即行戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉，開胸下腔靜脈取血，3000 r/min，離心20 min，-80℃保存?zhèn)溆?。取血后迅速將大鼠心臟取出，冷生理鹽水洗凈，迅速稱重。在心尖部心室前壁肌切取200 mg心肌組織，在4%多聚甲醛中固定24 h后，用梯度濃度酒精行常規(guī)脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后組織切片，6～8張，厚度為4 μm，用涂有多聚賴氨酸的載玻片貼片，56℃烘烤40 min備用。剩余心肌-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 ELISA檢測血清IMA含量 按照試劑盒操作具體步驟，測定每組血清中IMA含量，用酶標儀檢測各孔450 nm處的OD值及標準品的OD值，根據(jù)OD值和濃度繪制標準曲線并計算各個樣本濃度。

1.3.4 大鼠心肌細胞TUNEL檢測與半定量分析 TUNEL檢測是每一標本取3個不同部位的切片各1張，進行脫蠟，然后梯度水合后采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT酶）介導的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）缺口末端標記法檢測。操作步驟按照試劑盒說明書進行。每張切片拍攝5個視野計數(shù)細胞數(shù)，每個視野計數(shù)100個陽性細胞數(shù)，以凋亡陽性細胞數(shù)所占百分比的平均值作為凋亡指數(shù)（AI）。

1.3.5 免疫組化檢測大鼠心肌Bax、Bcl-2含量 采用SP法，按試劑說明書操作。每個標本在400倍光鏡下隨機取5個視野。陰性對照用PBS代替一抗。陽性反應：胞漿呈棕黃色背景，棕黃色顆粒沉積于細胞胞漿。陰性反應：細胞核及膜為藍色，其他部分顯示淡藍色。觀察每個視野中陽性細胞計數(shù)占總細胞計數(shù)的百分比。

1.3.6 Western blot法檢測大鼠心肌Fas、Caspase-3、Caspase-9含量 各組在適量細胞裂解液（已做冰預冷處理）中分別加入200 mg大鼠左心室前壁心肌組織，冰上裂解40 min，4℃，12 000 r/min離心20 min，隨后收集上清液，檢測上清液蛋白定量（二喹啉甲酸法，BCA）。取蛋白樣本進行SDS-PAGE電泳，100 V 2 h轉(zhuǎn)PVDF膜，5% BSA封閉1 h，一抗稀釋濃度為1∶200，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，隨后加入二抗（1∶20 000）室溫下孵育1 h，ECL檢測試劑盒顯影、洗片。用Bandleader 5.0軟件對掃描后圖像進行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）對多組間數(shù)據(jù)進行比較，并用LSD-t法或Dunnett′s T3檢驗進行進一步組間兩兩比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 前列地爾對力竭大鼠血清IMA的影響

與對照組比較，力竭組、前列地爾低劑量組和前列地爾高劑量組的大鼠血清IMA含量均顯著升高（P < 0.05）。前列地爾低劑量組和前列地爾高劑量組IMA均較力竭組降低（P < 0.05），且前列地爾高劑量組較前列地爾低劑量組降低更為明顯（P < 0.05）。見表1。

2.2 前列地爾對力竭大鼠心肌細胞AI的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示力竭組和前列地爾低劑量組AI較對照組明顯升高（P < 0.05）。前列地爾高劑量組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），前列地爾高劑量組較力竭組及前列地爾低劑量組明顯下降（P < 0.05）。力竭組和前列地爾低劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1、圖1（封四）。

2.3 前列地爾對力竭大鼠心肌Bax、Bcl-2表達的影響

免疫組化法結(jié)果顯示，力竭組和前列地爾低劑量組Bax陽性細胞計數(shù)百分比明顯高于對照組（P <0.05）。前列地爾高劑量組較力竭組和前列地爾低劑量組顯著降低（P < 0.05）。力竭組和前列地爾低劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1、圖2（封四）。

力竭組和前列地爾低劑量組Bcl-2陽性細胞計數(shù)百分比明顯低于對照組（P < 0.05），前列地爾高劑量組較力竭組、前列地爾低劑量組明顯升高（P <0.05）。力竭組和前列地爾低劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1、圖3（封四）。

2.4 前列地爾對力竭大鼠心肌Fas、Caspase-3和Caspase-9的影響

力竭組、前列地爾低劑量組和前列地爾高劑量組的Fas、Caspase-3均較對照組顯著升高（P < 0.05），前列地爾高劑量組和前列地爾低劑量組Fas、Caspase-3較力竭組顯著降低（P < 0.05），前列地爾高劑量組較前列地爾低劑量組顯著降低（P < 0.05）。力竭組Caspase-9高于對照組（P < 0.05），與力竭組比較，前列地爾低劑量組和前列地爾高劑量組Caspase-9明顯降低（P < 0.05）。前列地爾低劑量組Caspase-9較對照組明顯升高（P < 0.05），對照組和前列地爾高劑量組Caspase-9比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。前列地爾高劑量組Caspase-9較前列地爾低劑量組顯著降低（P < 0.05）。見圖4、表2。

3 討論

隨著社會發(fā)展進步，體育運動已逐漸成為人們?nèi)粘Ｉ畹囊徊糠?，日益受到重視，適當?shù)捏w育鍛煉會對身體健康有益，而過度的體育鍛煉、甚至力竭運動反而會對心臟造成損傷[7-8]。

IMA是反映心肌缺血的早期敏感指標。本研究顯示，力竭運動會導致心肌缺血。力竭運動的大鼠較未進行力竭運動大鼠的IMA明顯升高。而前列地爾用藥組較未應用前列地爾組力竭大鼠的心肌缺血明顯改善，且高劑量前列地爾較低劑量前列地爾改善效果更佳。這可能與前列地爾改善心肌微循環(huán)[9]、減輕細胞炎性反應[10]、改善血流動力學[11]等相關(guān)。

心肌細胞對缺血、缺氧非常敏感，在缺血、缺氧的情況下，炎性因子增多，脂質(zhì)過氧化水平增加，細胞膜的穩(wěn)定性及完整性被破壞，導致心肌細胞凋亡。本研究通過TUNEL染色觀察了心肌細胞凋亡情況。研究結(jié)果顯示，力竭運動的大鼠心肌細胞較未進行力竭運動的大鼠心肌凋亡數(shù)量增加。應用高劑量前列地爾的力竭大鼠的心肌細胞凋亡有明顯改善，而低劑量前列地爾對心肌細胞凋亡的改善作用不明顯。這表明，前列地爾可以減少心肌細胞凋亡[12]，且可能具有劑量依賴性。

Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡中起到重要的作用。其中Bcl-2對凋亡起抑制作用，Bax對凋亡起到促進作用。當Bcl-2過度表達時，Bcl-2/Bax比值高，抑制細胞凋亡。本研究顯示，力竭運動的大鼠Bcl-2顯著降低，Bax顯著升高。高劑量前列地爾力竭大鼠的Bax顯著減低，Bcl-2顯著升高。而低劑量前列地爾對Bcl-2、Bax的影響不明顯。研究表明，前列地爾對心肌細胞凋亡有抑制作用，并且與劑量相關(guān)[5]。

Fas與FasL結(jié)合，誘導凋亡信號產(chǎn)生，激活Caspase-3、Caspase-9，導致細胞凋亡。本研究顯示力竭運動大鼠Fas、Caspase-3、Caspase-9等相關(guān)凋亡蛋白表達顯著升高。而高劑量前列地爾組較低劑量前列地爾組對力竭大鼠的心肌細胞凋亡蛋白表達有明顯改善趨勢，從而達到抑制心肌細胞凋亡的目的。

前列地爾是臨床中應用多年的較為成熟的藥物。最早應用于改善微循環(huán)病變[13-15]。近年隨著臨床研究的不斷進展，發(fā)現(xiàn)前列地爾還具有調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子[16]、改善心肌細胞缺血/再灌注損傷[17-19]、抑制心肌纖維化[20]、抑制細胞凋亡[21-22]、減輕炎性反應[23-24]等多方面的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，前列地爾具有抑制心肌細胞凋亡的作用。前列地爾在臨床應用范圍會越來越廣泛。

本研究結(jié)果提示，前列地爾可以減輕心肌細胞缺血，減少心肌細胞凋亡，對心肌細胞具有保護作用，且前列地爾對心肌細胞缺血保護及抑制凋亡的作用具有劑量依賴性。

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（收稿日期：2018-11-08 本文編輯：張瑜杰）