膽囊膽固醇結(jié)石患者膽道菌群結(jié)構(gòu)、免疫水平與其結(jié)石形成間的關(guān)聯(lián)*

朱衛(wèi)國 黃繼宗 鄭小平 李揚(yáng)智 梁海飛

1.佛岡縣人民醫(yī)院普外科，廣東 清遠(yuǎn) 511600； 2.清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院肝膽外科，廣東 清遠(yuǎn) 511500

根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)可知，我國膽結(jié)石患者的數(shù)量逐年增加，尤其是膽囊膽固醇患者的比例很高。能夠?qū)е履懩夷懝檀冀Y(jié)石的因素有很多，如膽囊運(yùn)動(dòng)功能受損、膽固醇膽汁飽和度過高等。在經(jīng)過溶石治療之后，患者膽囊膽固醇結(jié)石的重復(fù)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)仍然比較高，同時(shí)統(tǒng)一產(chǎn)生各類并發(fā)癥，如膽囊癌、急性膽囊炎等。在當(dāng)前臨床治療當(dāng)中，相關(guān)專家認(rèn)為細(xì)菌源性物質(zhì)能夠?qū)е履懩夷懝檀冀Y(jié)石的形成，其可影響人體免疫代謝，從而促使病癥的發(fā)生[1]。本研究就膽囊膽固醇結(jié)石患者其結(jié)石形成的原因與免疫水平、膽道菌群結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系進(jìn)行探討，深入研究結(jié)石是因何而形成。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月—2018年9月我院收治的膽囊膽固醇結(jié)石患者60例，并作為本次試驗(yàn)的觀察組，并選取60例健康者最為本次試驗(yàn)的對(duì)照組。入組條件：(1)年齡在20～60歲之間；(2)不限患者性別；(3)患有膽囊膽結(jié)石的患者。排除條件：(1)排除患有人類免疫缺陷病毒及各類肝炎患者；(2)排除患有其他消化道病癥的患者；(3)排除身患惡性腫瘤的患者；(4)排除患有精神疾病的患者。倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：(1)將臨床研究內(nèi)容充分告知患者及其直系家屬，并簽署相關(guān)知情同意書；(2)依照相關(guān)臨床標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)定監(jiān)護(hù)、診治入選患者，充分保障患者的生命安全以及醫(yī)療治療的有效性。(3)嚴(yán)格保密入選患者的各類相關(guān)信息，使其隱私權(quán)被充分保護(hù)。(4)該研究試驗(yàn)應(yīng)該遵守《渥太華工作組關(guān)于臨床試驗(yàn)注冊(cè)的聲明》。

1.2 方法 對(duì)兩組研究患者的膽囊粘膜和膽汁DNA的菌落數(shù)及陽性率采用半定量PCR的方式進(jìn)行檢測，將其菌群種類作以分析，同時(shí)對(duì)它們IgM、IgG和IgA含量進(jìn)行測定。

1.2.1 樣品收集 膽汁取樣：該研究采取術(shù)中膽囊穿刺措施進(jìn)行；術(shù)中需對(duì)患者進(jìn)行開腹手術(shù)或者腹腔鏡手術(shù)進(jìn)行切除膽囊或切除后，通過無菌注射器將樣品膽汁吸出。結(jié)石取樣：患者進(jìn)行手術(shù)中，需要在不通過碎石的基礎(chǔ)上進(jìn)行收集樣本，樣本包括膽固醇結(jié)石、混合結(jié)石；在樣本去除后，需要用無菌生理鹽水對(duì)樣本表面進(jìn)行沖洗，其沖洗力度需要輕柔，主要出去樣本表面的附著物即可[2]。糞便收集：在患者實(shí)施膽囊結(jié)石手術(shù)前，需要對(duì)患者術(shù)前清晨或前一天的糞便進(jìn)行收集，其糞便屬于正常個(gè)體樣本收集。樣品保存：需要研究樣本需放置于無菌螺口離心管內(nèi)，其次需要及時(shí)放置于無防腐劑的液氮瓶中，并及時(shí)儲(chǔ)存，運(yùn)輸途中需要附加干冰，送至中國科學(xué)院進(jìn)行進(jìn)一步研究分析，其在處理過程中需要將樣本放置于原始管中，并處于于-80℃冰箱進(jìn)行保存。

1.2.2 進(jìn)行菌群鑒定 (1)采用巢氏擴(kuò)增(PCR)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳分析、膠回收、純化。(2)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。(3)采用變形梯度凝膠電泳對(duì)DNA遺傳指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行檢測[3]。

1.2.3 免疫球蛋白含量的試驗(yàn) (1)膽囊薪模800 mg，測定免疫球蛋白的成分。(2)抽取膽汁樣本進(jìn)行測定。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)兩組的細(xì)菌DNA檢出率、細(xì)菌菌落數(shù)及免疫球蛋白的測定結(jié)果作分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者通過對(duì)細(xì)菌DNA檢出率的分析情況 兩組患者在DNA檢出率的對(duì)比中，觀察組的膽汁細(xì)菌DNA陽性率與膽囊黏膜細(xì)菌DNA陽性率為71.67%和68.33%，兩組患者的細(xì)菌DNA檢出率對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者在細(xì)菌DNA檢出率的對(duì)比情況[n(%)](n=60)

2.2 兩組患者的細(xì)菌菌落數(shù)的對(duì)比情況 根據(jù)表2顯示，通過對(duì)比兩組數(shù)據(jù)，兩組膽汁細(xì)菌的菌數(shù)與膽囊黏膜細(xì)菌的菌落數(shù)數(shù)量相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表2。

表2 兩組患者的細(xì)菌菌落數(shù)的對(duì)比情況

2.3 兩組病患通過PCR產(chǎn)物中測序的結(jié)果顯示 兩組的細(xì)菌DNA陽性病患均有變現(xiàn)出多種細(xì)菌混合性感染的現(xiàn)象，其細(xì)菌存在的種類為2～5種以上，而兩組患者對(duì)比，對(duì)照組的細(xì)菌種類明顯少于觀察組，兩組患者在PCR產(chǎn)物測序結(jié)果中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；

2.4 兩組患者免疫球蛋白含量的對(duì)比情況 根據(jù)表3顯示，兩組患者在免疫球蛋白含量的對(duì)比中，兩組病患在其膽囊膽固醇中膽囊黏膜及膽汁的相關(guān)數(shù)值對(duì)比中，兩組IgA、IgG相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組IgM相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見表3

表3 兩組免疫球蛋白攝取含量的分析

3 討 論

通常來說，臨床當(dāng)中采用常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)方法對(duì)患者膽囊膽固醇結(jié)石的患者進(jìn)行膽囊粘膜、膽汁及膽石的檢測，通過檢測數(shù)據(jù)可知，患者細(xì)菌陽性率<25%，故可得出結(jié)石的形成與患者膽道內(nèi)的菌群無關(guān)[4]。相關(guān)醫(yī)護(hù)人員采用NT-PCR的方法檢測細(xì)菌，數(shù)據(jù)顯示患者膽汁中的細(xì)菌陽性率高達(dá)80%[5]。通過采用超速離心方式對(duì)采集的結(jié)石膽汁與對(duì)照組膽汁進(jìn)行處理，將以進(jìn)行離心的樣本取中間部分3ml并放置與無菌玻璃試管中，并采用偏光顯微鏡進(jìn)行觀察，如觀察未發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)晶可進(jìn)行下一步試驗(yàn)，但在觀察中存在膽固醇結(jié)晶則需要超速離心重復(fù)操作，直到顯微鏡下無膽固醇結(jié)晶，可進(jìn)行下一步膽汁樣品試驗(yàn)[6]。本次試驗(yàn)取結(jié)石組膽汁與對(duì)照組膽汁置于無菌管中，設(shè)置參數(shù)為37 ℃ 45 000 rpm，并通過30 min超速離心，將0.22 μm膜過濾，其膽汁量達(dá)到480 ml，兩組試驗(yàn)均加入20 μl CCCP、白蛋白蛋白、氯化鈣,其滿足總體積500μl，放置于恒溫箱培養(yǎng)，設(shè)置溫度為37 ℃。帶靜止30 min后作為試驗(yàn)零點(diǎn)，并通過偏光顯微鏡進(jìn)行觀察，時(shí)間間隔為24 h，直到可觀察折光性膽固醇結(jié)晶析出為止，并研究標(biāo)本均出現(xiàn)結(jié)晶，則視為試驗(yàn)結(jié)束。結(jié)束后記錄每個(gè)樣本出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶的形成時(shí)間點(diǎn)[7]。檢測時(shí)采用PCR的方法進(jìn)行，則外部因素不會(huì)影響到細(xì)菌的檢測數(shù)據(jù)，可使其原始資料得以還原。所以說，細(xì)菌存在于膽囊膽結(jié)石患者中，不能夠充分證明結(jié)石的形成與其有關(guān)[8]。

就患者膽囊薪膜和膽汁中IgG、IgA的含量而言，兩組相比有差異性，則可證明患者結(jié)石的形成有可能與免疫球蛋白的改變相關(guān)。膽固醇成核活性蛋白通過IgG、IgA得以提升，除此之外，免疫球蛋白的分泌了有可能會(huì)對(duì)患者菌群造成影響，從而形成結(jié)石。

總之，膽囊膽固醇結(jié)石患者菌群與其相似，結(jié)石的形成與細(xì)菌的存在并無直接關(guān)系，但是患者結(jié)石的形成有可能與免疫球蛋白的升高密切相關(guān)。