北桑寄生總黃酮提取方法的優(yōu)化

胡嘉琳 胡超男 楊 飛 楊官娥*

（山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001）

我國(guó)桑寄生科植物資源豐富，約有11個(gè)屬、64個(gè)種和10個(gè)變種，共有約75個(gè)分類單位[1]。北桑寄生（Loranthus tanakae）是桑寄生科（Loranthaceae）桑寄生屬（Loranthus）植物中的落葉小灌木，多以殼斗科（Fagaceae）植物為寄主，也會(huì)選擇寄生于櫟屬、樺屬、李屬、榆屬等不同種屬的植物上[2]。生長(zhǎng)花期在4～5月，果期9～10月，生長(zhǎng)分布在通風(fēng)透光好，森林覆蓋率高的環(huán)境中。在我國(guó)主要集中分布于黃河流域。根據(jù)記載，北桑寄生具有祛風(fēng)濕，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎等功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，北桑寄生粗提物對(duì)體外腫瘤細(xì)胞具有血管抑制活性和細(xì)胞毒活性。本研究對(duì)北桑寄生總黃酮進(jìn)行了提取工藝的考察，并通過高效液相色譜法對(duì)總黃酮所含各化合物進(jìn)行定量，為進(jìn)一步研究北桑寄生總黃酮物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器：北桑寄生，采自山西省沁水縣歷山風(fēng)景區(qū)，由山西醫(yī)科大學(xué)楊官娥教授鑒定為北桑寄生Loranthus tanakae。蘆丁對(duì)照品（西安瑞林生物科技有限公司批號(hào)：20150410，純度≥98%），鼠李素-3-O-鼠李糖苷由課題組前期從北桑寄生中提取分離所得，0.1 mol/L三氯化鋁溶液，0.1 mol/L醋酸鈉溶液。

粉碎機(jī)（浙江省瑞安市百信藥機(jī)械廠）；AR1140電子天平（奧斯豪國(guó)際貿(mào)易有限公司）；UV757CRT紫外分光光度計(jì)（上海精密儀器有限公司）；島津LC-20ATvp全自動(dòng)高效液相色譜儀，Diamonsil?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，Dikma Technologies）；SB-360DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照溶液的制備：蘆丁對(duì)照品在105 ℃干燥至恒重，精確稱取25.0 mg于100 mL容量瓶中，用40 mL的60%乙醇充分溶解，再用相同濃度的乙醇定容至刻度，配制成0.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液。

1.2.2 樣品溶液的制備：精確稱取北桑寄生粗粉10.0 g于燒杯中，加入70 mL乙醇溶液常溫下浸泡1h，進(jìn)行超聲提取，共提取3次，每次20 min，合并提取液，過濾去除藥渣，用60%乙醇溶液定容至50 mL，備用。

1.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：根據(jù)參考文獻(xiàn)[3-4]采用修改后三氯化鋁-醋酸鈉顯色法，取樣品溶液適量，加入0.1 mol/L的三氯化鋁溶液2 mL，0.1 mol/L的醋酸鈉溶液1 mL，搖勻，室溫放置20 min顯色后，以試劑作為空白參比液在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸光度，選擇最大吸收波長(zhǎng)。經(jīng)UV757CRT紫外分光光度計(jì)確定于414 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故測(cè)定時(shí)選擇用此波長(zhǎng)。

1.2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-6]精密吸取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，相同濃度乙醇溶液定容至1 mL，分別加入2 mL三氯化鋁溶液和1 mL醋酸鈉溶液，放置10 min，以相應(yīng)的試劑作為空白對(duì)照，以濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸收度（A）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 單因素試驗(yàn)分析：對(duì)影響超聲提取北桑寄生總黃酮的各因素，包括： 提取溫度，提取時(shí)間，料液比，和乙醇濃度，分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。乙醇濃度選定為55%、60%、65%、70%、75%；料液比選定為，1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35；提取溫度被選定為15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃；提取時(shí)間選定為30 min、45min、60 min、75 min、90 min。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響

圖3 料液比對(duì)總黃酮含量的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-10]及單因素提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以提取溫度（A），料液比（B），提取時(shí)間（C），和乙醇濃度（D）為研究因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。確定超聲提取法提取北桑寄生總黃酮的最佳工藝，見表1。

1.2.7 總黃酮的含量測(cè)定：將所配制樣品溶液稀釋至可用濃度，采用三氯化鋁-醋酸鈉顯色法進(jìn)行顯色，于414 nm處測(cè)定吸光度值，利用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算北桑寄生提取液中總黃酮的含量。

1.2.8 HPLC法確定北桑寄生總黃酮各化合物含量

1.2.8.1 鼠李素-3-O-鼠李糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取鼠李素-3-O-鼠李糖苷粉末5.00 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，配制成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e精密進(jìn)樣1、5、10、15、20、25 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在相同的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得回歸方程及相關(guān)系數(shù)。取以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μL）為橫坐標(biāo)，繪制鼠李素-3-O鼠李糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8.2 色譜條件的選擇：根據(jù)參考文獻(xiàn)[11-12]及本課題組前期試驗(yàn)，確定色譜條件為：Diamonsil? C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，Dikma Technologies），檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫35 ℃，流速為0.8 mL/min，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水。梯度條件見表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。計(jì)算所得回歸方程為：A=3.8209X+0.0661，r=0.9992；確定在0.025～0.251范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 超聲提取法單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對(duì)提取的影響：如圖2可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮的含量有上升趨勢(shì)，但含量變化較小，這可能是由于在超聲過程中，溫度的變化不足以改變北桑寄生中黃酮類物質(zhì)的溶解量，因此選擇溫度在15～35 ℃條件下進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 料液比對(duì)提取的影響：如圖3可知，隨著料液比的增加，總黃酮的含量有所提高，但提升效果并不明顯，因此考慮成本問題，選擇料液比為1∶15～1∶25條件下進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)提取的影響：如圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮的含量持續(xù)升高，且含量變化明顯，這可能是由于隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，北桑寄生粉末中部分不易溶解的黃酮類物質(zhì)，由于超聲的原因溶解度增大?？紤]到超聲60 min之后，總黃酮含量變化微小，因此選擇提取時(shí)間在60～90 min條件下進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 乙醇濃度對(duì)提取的影響：如圖5可知，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮的含量持續(xù)增加，這可能是由于隨著乙醇濃度增加，北桑寄生中難溶于水的物質(zhì)開始溶解，因此，選擇乙醇濃度在65%～75%條件下進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及分析結(jié)果見表3。由R值大小可知各因素對(duì)總黃酮提取率的影響順序?yàn)锽＞D＞A＞C，即超聲提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響最大，其次是乙醇濃度，再次是提取溫度，料液比對(duì)總黃酮提取的影響最小。最佳轉(zhuǎn)化條件為A2B3C1D3，即選擇提取溫度為25 ℃，超聲提取時(shí)間為60 min，料液比為1∶20，乙醇濃度為75%為最佳轉(zhuǎn)化條件。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證：根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在最佳提取條件下超聲提取北桑寄生，平行制備五份北桑寄生總黃酮提取液，分別計(jì)算總黃酮含量為：55.60%、54.72%、54.53%、55.52%、55.08%，RSD值為0.86%，表明該方法穩(wěn)定可行。

2.5 HPLC法分析北桑寄生總黃酮中各化合物的含量

2.5.1 鼠李素-3-O-鼠李糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：如圖6為鼠李素-3-O-鼠李糖苷單體標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算所得回歸方程為：A=1×106 X-13658，r=0.9999，在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 總黃酮中各黃酮類化合物定量分析：北桑寄生總黃酮提取物的HPLC圖譜如圖7所示，本課題組已鑒定化合物3～6分別為：化合物3（槲皮素-3-O-鼠李糖苷）、化合物4（山奈酚-3-O-鼠李糖苷）、化合物5（鼠李素-3-O-鼠李糖苷）、化合物6（鼠李檸檬素-3-O-鼠李糖苷），保留時(shí)間分別為：54.30 min、60.30 min、72.75 min、76.20 min。根據(jù)鼠李素-3-O-鼠李糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得總黃酮中四個(gè)黃酮類化合物的含量為：鼠李素-3-O-鼠李糖苷78.51%、槲皮素-3-O-鼠李糖苷6.06%、鼠李檸檬素-3-O-鼠李糖苷9.55%、山奈酚-3-O-鼠李糖苷2.40%，以及少量其他黃酮類成分。

圖5 乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響

圖6 鼠李素-3-O-鼠李糖苷單體標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 北桑寄生總黃酮HPLC圖譜，成分3-6是已知成分：化合物3（槲皮素-3-O-鼠李糖苷）、化合物4（山奈酚-3-O-鼠李糖苷）、化合物5（鼠李素-3-O-鼠李糖苷）；化合物6（鼠李檸檬素-3-O-鼠李糖苷）

3 結(jié) 論

本文以北桑寄生中總黃酮的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用超聲提取法對(duì)北桑寄生總黃酮進(jìn)行提取，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳轉(zhuǎn)化條件：提取溫度為25 ℃，超聲提取時(shí)間為60 min，料液比為1∶20，乙醇濃度為75%。且通過超聲提取最佳工藝驗(yàn)證總黃酮含量為（55.08±0.86），為北桑寄生總黃酮的開發(fā)和利用提供參考。同時(shí)，利用HPLC法，以單體鼠李素-3-O-鼠李糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)北桑寄生總黃酮中各物質(zhì)進(jìn)行定量分析?？傸S酮中四個(gè)黃酮類化合物分別為：鼠李素-3-O-鼠李糖苷78.51%、槲皮素-3-O-鼠李糖苷6.06%、鼠李檸檬素-3-O-鼠李糖苷9.55%、山奈酚-3-O-鼠李糖苷2.40%。四個(gè)化合物含量和為96.52%。即北桑寄生總黃酮化合物種類少，90%以上可以定量。為進(jìn)一步合理有效的開發(fā)利用北桑寄生總黃酮中的單體化合物奠定基礎(chǔ)。