煙酰胺片含量及有關(guān)物質(zhì)測定方法改進(jìn)

李志遠(yuǎn)，劉 屹，左文松

（云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650106）

煙酰胺片（Nicotinamide Tablets）系吡啶衍生物3-吡啶甲酰胺，屬于水溶性B族維生素類藥物，在體內(nèi)與核糖、磷酸、腺嘌呤形成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（輔酶Ⅰ）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（輔酶Ⅱ），為脂質(zhì)代謝、組織呼吸的氧化作用和糖原分解所必需，缺乏時(shí)會影響細(xì)胞的正常呼吸和代謝，進(jìn)而引起糙皮??；胃腸道易吸收，吸收后分布到全身組織，半衰期（t1／2）約為 45 min，經(jīng)肝臟代謝，治療量僅少量以原形自尿排出，但過量服用時(shí)排泄量增加。煙酰胺與異煙肼有拮抗作用，長期服用異煙肼時(shí)應(yīng)適當(dāng)補(bǔ)充煙酰胺；煙酰胺無擴(kuò)張血管作用，可用于高血壓患者。2015年版《中國藥典（二部）》收載有薄層色譜（TLC）法測定其有關(guān)物質(zhì)，紫外分光光度（UV）法測定含量［1-2］。高效液相色譜（HPLC）法測定其含量和有關(guān)物質(zhì)也有文獻(xiàn)［3-6］報(bào)道。本研究中選擇2種不同的方法測定煙酰胺片的含量及有關(guān)物質(zhì)，為該藥的質(zhì)量控制提供更加簡便、準(zhǔn)確、高效的評價(jià)方法［7-9］?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：LC-20A型高效液相色譜儀（PDA檢測器，日本島津公司）；BP-221S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；UE06SFD（6 L）型超聲波提取儀（德國Wiggens儀器公司）；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；DELTA320型酸度計(jì)（梅特勒-托利多集團(tuán)公司）。

試藥：煙酰胺片（廣州康和藥業(yè)有限公司5批，天津力生制藥股份有限公司36批，上海信誼藥廠有限公司委托上海信誼黃河制藥有限公司32批）；煙酰胺對照品（批號為 100115-200703）、煙酸對照品（批號為100434-201102）均購于中國食品藥品檢定研究院；N-羥甲基煙酰胺（批號為1001062150）、3-氰基吡啶（批號為13082202）均購于Sigma-Aldrich公司；甲醇為色譜純；鹽酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：UITimate XB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.05 mol／L 醋酸銨溶液（pH 6.0）（20∶80）；檢測波長：262nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL／min；進(jìn)樣量：20 μL。

圖1 系統(tǒng)適性用試驗(yàn)高效液相色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 溶液制備

稱取煙酰胺對照品適量，精密稱定，加流動相適量，超聲10 min溶解，并稀釋制成質(zhì)量濃度為250 μg／mL的對照品貯備溶液。稱取煙酰胺片細(xì)粉適量，精密稱定，加流動相適量，超聲10 min溶解，并稀釋制成質(zhì)量濃度為50 μg ／mL 的溶液，搖勻，用 0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取煙酰胺片處方項(xiàng)下的輔料適量，加流動相適量，按供試品溶液制備方法制備，即得空白輔料溶液。

2.2.2 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取 2.2.1項(xiàng)下3種溶液，各精密量取20 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果空白輔料溶液無干擾。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：精密量取對照品貯備溶液，加流動相制成 250，100，50，25，10 μg ／mL 的溶液，按擬訂色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝25446X+45667，r＝0.9998（n＝5）。結(jié)果表明，煙酰胺質(zhì)量濃度在10～250 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2.1項(xiàng)下對照品溶液（質(zhì)量濃度為 50 μg／mL），連續(xù)進(jìn)樣 5 次，記錄圖峰面積。結(jié)果的RSD為0.03%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：稱取樣品（天津力生制藥股份有限公司，批號為1305004）細(xì)粉適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于 0，2，4，6，9，12，18，24 h 時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.63%（n＝8），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（天津力生制藥股份有限公司，批號為1305004）細(xì)粉適量（約相當(dāng)于煙酰胺50 mg）6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果煙酰胺平均含量為97.72%，RSD為0.87%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（天津力生制藥股份有限公司，批號為1305004）10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于煙酰胺50 mg），置100 mL容量瓶中，加流動相適量，超聲10 min溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，并精密量取續(xù)濾液10 mL置50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，得100 μg／mL的供試品貯備溶液。精密量取供試品貯備溶液與2.1項(xiàng)下對照品溶液（質(zhì)量濃度為100 μg ／mL）適量，用流動相稀釋成 80% ，100% ，120%回收率試驗(yàn)溶液，搖勻，即得。取上述溶液各20μL，按擬訂色譜條件試驗(yàn)，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 煙酰胺加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

定量限確定：按照信噪比（S／N）＝10時(shí)，記錄色譜圖，計(jì)算得煙酰胺的定量限為1.08 ng。

2.2.3 樣品含量測定

取不同廠家不同批號煙酰胺片73批，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件及2015年版《中國藥典（二部）》該品種項(xiàng)下方法（UV法）測定并計(jì)算。結(jié)果見表2，兩組數(shù)據(jù)比較無顯著差異（t＝0.79，P＞0.05）。

2.3 有關(guān)物質(zhì)測定

2.3.1 系統(tǒng)分離度試驗(yàn)

精密稱取煙酰胺對照品、煙酸對照品、N-羥甲基煙酰胺、3-氰基吡啶，加甲醇 -水（2 ∶8）制成 50 μg／mL 的混合對照品溶液，精密量取其續(xù)濾液20 μL，按擬訂色譜條件注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，煙酰胺與其他各雜質(zhì)分離良好。色譜圖見圖2。

2.3.2 破壞試驗(yàn)

稱取樣品（天津力生制藥股份有限公司，批號為1305004）粉末適量（約相當(dāng)于煙酰胺25 mg），精密稱定，置 50 mL 容量瓶中，分別在酸（0.1 mol／L HCL）、堿（0.1 mol／L NaOH）、高溫（100 ℃水浴 5 h）、氧化（加 3%H2O2溶液 5 mL，室溫放置 2 d）、光照（4 500 lx）條件下分別進(jìn)行破壞性試驗(yàn)。取破壞性試驗(yàn)樣品適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，精密量取適量，按擬訂色譜條件注入液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖，計(jì)算含量。結(jié)果見表3及圖3?？梢?，煙酰胺在光照條件下最穩(wěn)定，酸性條件、氧化條件和高溫條件下次之，堿性條件下最不穩(wěn)定。

表2 《中國藥典》UV法與HPLC法測定結(jié)果（標(biāo)示量的百分含量，%）

圖2 系統(tǒng)分離度試驗(yàn)高效液相色譜圖

表3 各破壞條件下煙酰胺片總雜質(zhì)含量變化情況（%）

2.3.3 輔料干擾試驗(yàn)

圖3 破壞試驗(yàn)高效液相色譜圖

由煙酰胺片制劑工藝可知，所用輔料主要為淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂。稱取上述輔料適量，參照工藝配方加10%甲醇水制得供試品溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，依法測定，記錄色譜圖。結(jié)果輔料基本無干擾。

2.3.4 檢出限與定量限確定

以信噪比（S／N）＝3時(shí)為檢出限，以S／N＝10時(shí)為定量限，各組分的檢出限及定量限確定結(jié)果見表4。

表4 檢出限與定量限確定結(jié)果（ng）

2.3.5 耐用性試驗(yàn)

其他色譜條件不變，改變流速分別為 0.8，1.0，1.2 mL ／min；改變流動相 pH 分別為 5.8，6.0，6.2；改變柱溫為25，30，35℃；改變色譜柱為UITimate XB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Kromasil 100-5 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），AlltimaTMC18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。依法測定，結(jié)果顯示，各雜質(zhì)峰之間的分離度良好，保留時(shí)間有改變，說明方法耐用性好。

2.3.6 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

取不同廠家不同批號的73批煙酰胺片，精密稱取適量（相當(dāng)于煙酰胺25 mg）置50 mL容量瓶中，加甲醇-水（2∶8）溶解并定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇-水（1∶9）溶解并定容至刻度，即得自身對照溶液。取上述溶液各20 μL照擬訂色譜條件及2015年版《中國藥典（二部）》該品種項(xiàng)下有關(guān)物質(zhì)含量測定方法進(jìn)樣測定。采用藥典方法（TLC法），73批樣品的供試品溶液中均未見雜質(zhì)斑點(diǎn)；采用新建的HPLC法均能檢出煙酸，絕大部分樣品檢出其他雜質(zhì)。表明新建HPLC法不但能有高效、快捷地區(qū)分樣品間雜質(zhì)譜的差異，還能對各雜質(zhì)進(jìn)行定量。結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 《中國藥典》UV法與HPLC法測定含量比較

2種方法測定的結(jié)果無顯著性差異；但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中UV法測定步驟煩瑣，且其試驗(yàn)過程中水浴加熱溫度對含量測定結(jié)果影響較大；新建HPLC法操作簡單、易行、準(zhǔn)確，可降低試驗(yàn)過程控制不當(dāng)帶來的誤差，可作為煙酰胺片含量測定的方法之一。

3.2 TLC法與HPLC法雜質(zhì)檢查結(jié)果比較

因受檢出限的限制，樣品均未檢出煙酸及其他雜質(zhì)，未能有效考察樣品間雜質(zhì)的差異，對控制和區(qū)分藥品的內(nèi)在質(zhì)量不利。采用新建的HPLC法均能檢出煙酸，絕大部分樣品檢出其他雜質(zhì)，能高效、快捷地區(qū)分樣品間雜質(zhì)譜的差異，還能對各雜質(zhì)進(jìn)行定量。

表5 73批樣品HPLC法有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果（%）