JNK1在2型糖尿病大鼠股動脈纖維病變中的表達及中藥桃仁干預(yù)研究*

武海闊，張榮榮，王 軍，李夢虎

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

糖尿病下肢血管病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，是造成患者傷殘與死亡的重要原因。目前認(rèn)為糖尿病大血管病變的病理改變主要為內(nèi)膜、中膜層厚度增加，管腔狹窄，管壁順應(yīng)性降低，內(nèi)膜粥樣斑塊形成致管腔進一步狹窄，直至完全閉塞產(chǎn)生臨床癥狀。高血糖與高血脂的毒性作用、蛋白質(zhì)非酶糖基化、內(nèi)皮功能障礙等因素聯(lián)合作用于血管壁，導(dǎo)致平滑肌細胞增殖，膠原過度表達，最終形成血管纖維化。本課題組前期證明，糖尿病足患者血管病變是以內(nèi)膜的纖維性增厚為主，脂質(zhì)沉積以纖維成分所占比例大。JNK又被稱為蛋白激酶，近年發(fā)現(xiàn)，JNK信號通路和纖維化相關(guān)。因此，筆者提出如下科學(xué)假說：在高糖、慢性炎癥刺激引起內(nèi)毒素增多的環(huán)境下，JNK信號傳導(dǎo)通路被激活進而促進血管纖維化的進程。本實驗采用2型糖尿病大鼠股動脈纖維病變模型，應(yīng)用免疫組化、蛋白免疫印跡（Western blot）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）實時熒光定量等技術(shù)，從c-Jun氨基末端激酶（JNK1）蛋白的表達水平，JNK1蛋白的磷酸化水平，JNK1基因的表達水平及血管上皮細胞形態(tài)功能水平等方面多角度考察JNK1與2型糖尿病大鼠股動脈纖維化的關(guān)系，并研究中藥桃仁的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠50只，清潔級，2月齡，體質(zhì)量160~200 g，由天津?qū)嶒瀯游镏行奶峁?，動物合格證號為SCXK-（軍）2012-0004。

1.2 實驗藥品 桃仁，原材料檢驗合格后，破碎，置多功能中藥提取罐中，煎煮2次，過濾3次，真空低溫濃縮，噴霧干燥，干法制粒，檢驗合格后備用，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院顆粒劑藥房制備，每克顆粒劑相當(dāng)于生藥20 g。使用時將3 g桃仁顆粒劑溶解200 mL蒸餾水中，形成每毫升含生藥0.3 g的藥液備用。大鼠的等效劑量約為人體的6倍，生藥用藥劑量約為3.0 g/（kg·d），即顆粒劑水溶液10 mL/（kg·d）。

1.3 主要實驗試劑及儀器 兔抗大鼠多克隆抗體（JNK1 BA1219），武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠多克隆抗體（p-JNK1 BS-17591r），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG二抗抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗，天津賽爾生物有限公司；Actin（5A7）mAb M20010內(nèi)參抗體，天津賽爾生物有限公司；Epgiadients PCR儀，Eppendorf公司；ABI7500 fast熒光定量PCR儀，Life Technologies公司。

1.4 造模方法及實驗分組 造模方法：雄性SD大鼠50只，隨機分為空白對照組、模型對照組、早期干預(yù)組、桃仁高劑量組、桃仁低劑量組各10只；空白對照組10只普通飲食喂養(yǎng)，其余各組予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，誘導(dǎo)胰島素抵抗。4周后，禁食不禁水12 h，稱質(zhì)量。行腹腔靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）35 mg/kg。第3、7天測血糖，血糖＞16．7 mmol/L為2型糖尿病鼠造模成功。此時空白對照組繼續(xù)普通飲食喂養(yǎng)，其余各組繼續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)10周[1-2]，進行2型糖尿病股動脈纖維病變造模，其中早期干預(yù)組予桃仁顆粒劑水溶液10 mL/（kg·d）灌胃。

2型糖尿病股動脈纖維病變模型標(biāo)準(zhǔn)：前期實驗表明，雄性SD大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后行腹腔靜脈注射STZ，可形成2型糖尿病鼠模型，繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)10周后，可形成2型糖尿病股動脈纖維病變模型[3-5]。本次實驗中，為驗證模型成功率，另取同批次雄性SD大鼠3只單獨分組，干預(yù)方法同模型對照組，2型糖尿病鼠模型造模成功10周后剝?nèi)‰p側(cè)股動脈，福爾馬林溶液固定，光鏡下觀察，若見纖維帽，膠原纖維玻璃樣變，內(nèi)皮細胞腫脹，其下聚集大量泡沫細胞，平滑肌細胞排列紊亂，彈力纖維斷裂，甚至出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶，血栓形成，鈣鹽沉著，即證明2型糖尿病鼠股動脈纖維病變模型制作成功（造模結(jié)果為陽性，見圖1）。這3只雄性SD大鼠不進入正式實驗。

圖1 2型糖尿病鼠股動脈纖維病變造模結(jié)果（HE染色）Fig.1 Resultsof model building of femoral artery fiber lesion in type 2 diabetic rats（HE staining）

1.5 實驗干預(yù) 實驗過程中空白對照組不予藥物干預(yù)，早期干預(yù)組從2型糖尿病造模成功后至實驗結(jié)束給予桃仁顆粒劑水溶液10 mL/（kg·d）灌胃，模型對照組從2型糖尿病股動脈纖維病變造模成功后給予0．9%生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃，桃仁高劑量組從2型糖尿病股動脈纖維病變造模成功后給予桃仁顆粒劑水溶液20 mL/（kg·d）灌胃，低劑量組從2型糖尿病股動脈纖維病變造模成功后給予桃仁顆粒劑水溶液10 mL/（kg·d）灌胃。從2型糖尿病股動脈纖維病變造模成功后連續(xù)藥物干預(yù)3周。

1.6 取材 藥物干預(yù)3周后，禁食24 h，用10%的水合氯醛3 g/kg麻醉，備皮，手術(shù)區(qū)皮膚消毒。根據(jù)股動脈搏動情況確定股動脈的位置和走行方向，將皮膚沿股動脈走向縱向切開，用紋式鉗把周圍組織鈍性分離開來，以暴露股動脈鞘。用眼科鑷沿著血管走向鈍性分離出股動脈約4～5 cm，兩端剪斷，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，平均分成兩部分，一部分采用4%多聚甲醛進行固定，另一部分置于無菌凍存管中，-80℃冰箱保存。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 免疫組化檢測股動脈JNK1的表達 標(biāo)本固定、包埋、切片，用4%多聚甲醛固定。經(jīng)70%乙醇30 min，80%乙醇 30 min，90%乙醇 30 min 2次，95%乙醇30 min 2次，100%乙醇30 min 2次，二甲苯透明30 min 2次，55℃石蠟中30 min 2次，用銅制模具包埋組織塊。將厚度5μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜。再經(jīng)過二甲苯脫蠟。后水化，抗原煮沸熱修復(fù)，封閉。滴加一抗：將兔抗鼠抗體稀釋到適當(dāng)濃度（按1：100稀釋），滴加稀釋的抗體。置濕盒中4℃孵育過夜。滴加二抗：滴加適量生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗工作液，37℃孵育10～30 min。經(jīng)PBS沖洗、滴加HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育再沖洗。避光配置二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，復(fù)染，脫水，透明，封固，最后光鏡下觀察。

1.7.2 Western blot檢測股動脈JNK1、應(yīng)激活化蛋白激酶1（p-JNK1）的表達 液氮低溫研磨組織。Modified RIPA buffer充分裂解，超聲波破碎組織。12 000 g，4℃離心15 min，取上清液。利用牛血清白蛋白（BSA）蛋白定量法，對各樣本的蛋白濃度進行分析。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）凝膠電泳分離蛋白，配制分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠。取32μL總蛋白、8μL的 5×Loading Buffer，煮沸 3 min，立即冰置 3 min，上樣。100 V電壓電泳。電轉(zhuǎn)膜：將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min。依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙3片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min。伯樂半干轉(zhuǎn)印儀器轉(zhuǎn)膜，15 V，40 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，切斷電源，取出雜交膜。封閉：用25 mLTBS洗膜5 min，室溫，搖動。置膜于25 mL封閉緩沖液中1 h，室溫，搖動。15 mL TBS/T洗3次（5 min/T）。與一抗的結(jié)合：在搖床上4℃輕輕搖動過夜。洗去非特異結(jié)合的一抗。與二抗的結(jié)合：將上膜和下膜分別浸入含相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗的Blotto中，緩慢搖動室溫孵育1 h。洗去非特異結(jié)合的二抗。在15 mLTBS中洗1次。用ECL液（KPL公司）顯色，GE自動曝光系統(tǒng)檢測、攝像。

1.7.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測股動脈JNK1基因表達 應(yīng)用RT-PCR法檢測其中JNK1 mRNA的含量。采用Trizol法提取總RNA，RT-PCR采用25μL反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為12．5μLSYBRMix，1μLcDNA，上下游引物各1μL，ddH2O體積 9．5μL，合計25μL。儀器為ABIStep-plus系統(tǒng)。JNK1引物序列上游為TGATGTCTGCAATACCCAGGC，下游為TTCGTTAGTCTAGGCTGTGCC。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠股動脈JNK1表達的免疫組化定位結(jié)果 JNK1主要表達于大鼠股動脈血管內(nèi)皮細胞、中膜平滑肌細胞的細胞膜及細胞質(zhì)中，采用免疫酶標(biāo)法（ABC法）檢測大鼠股動脈中JNK1表達情況（見圖2），空白對照組大鼠股動脈血管內(nèi)皮細胞及中膜平滑肌細胞中有散在黃色物質(zhì)，呈弱陽性改變；模型對照組可見大量棕黃色物質(zhì)表達呈強陽性反應(yīng)。早期干預(yù)組和桃仁高劑量組可見黃色物質(zhì)呈陽性反應(yīng)，提示JNK1表達明顯下降，桃仁低劑量組可見大量黃色物質(zhì)呈強陽性反應(yīng)，提示JNK1表達無明顯下降。

圖2 大鼠股動脈JNK1免疫組化結(jié)果（×400）Fig.2 Immunohistochemical resultsof JNK1 in rats femoral artery（×400）

2.2 大鼠股動脈JNK1、p-JNK1的Western blot檢測結(jié)果 JNK1p-JNK1表達，5組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。見表 1。

表1 治療后各組大鼠股動脈JNK1表達的比較（±s）Tab.1 Comparison of JNK1 expression in thefemoral artery of each group after treatment（±s）

表1 治療后各組大鼠股動脈JNK1表達的比較（±s）Tab.1 Comparison of JNK1 expression in thefemoral artery of each group after treatment（±s）

注：與空白對照組相比，**P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．05，##P＜0．01；與桃仁高劑量組相比，△△P＜0．01；與桃仁低劑量組相比，▲▲P＜0．01。

組別 動物數(shù) JNK1 p-JNK1早期干預(yù)組 10 0．477 6±0．069 0**##△△▲▲ 0．168 0±0．004 2**##△△▲▲低劑量組 10 0．585 4±0．008 1**#△△ 0．214 1±0．006 7**##△△高劑量組 10 0．513 1±0．009 0**## 0．177 1±0．005 8**##模型對照組 10 0．593 9±0．006 4** 0．223 1±0．010 8**空白對照組 10 0．467 5±0．006 2 0．157 8±0．003 9

2.3 大鼠股動脈 JNK1、p-JNK1的 Western blot灰度值結(jié)果 見圖3。各組Western blot灰度值檢測結(jié)果如圖3所示，圖像結(jié)合表1結(jié)果分析如下：JNK1：模型對照組大鼠JNK1表達高于空白對照組；早期干預(yù)組和桃仁高劑量組與模型對照組相比，JNK1表達明顯降低，且以早期干預(yù)組最為明顯；桃仁低劑量組與模型對照組相比，JNK1表達有所降低。p-JNK1：模型對照組大鼠p-JNK1表達高于空白對照組；早期干預(yù)組和桃仁高劑量組與模型對照組相比，p-JNK1表達明顯降低，且以早期干預(yù)組最為明顯；桃仁低劑量組與模型對照組相比，JNK1表達有所降低。

圖3 大鼠股動脈JNK1/p-JNK1 Western blot灰度值Fig.3 Gray value of JNK1/p-jnk1 Western blot in the femoral artery of rats

2.4 大鼠股動脈JNK1的RT-qPCR結(jié)果 大鼠股動脈JNK1基因表達，5組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。見表 2。

3 討論

目前認(rèn)為糖尿病大血管病變的病理改變主要為內(nèi)膜層及中膜層厚度增加，管腔狹窄，管壁順應(yīng)性降低，內(nèi)膜粥樣斑塊形成致管腔進一步狹窄，直至完全閉塞產(chǎn)生臨床癥狀。國外研究[6]表明高血糖與高血脂的毒性作用、內(nèi)皮功能障礙、蛋白質(zhì)非酶糖基化等因素聯(lián)合作用于血管壁，可以導(dǎo)致平滑肌細胞增殖和膠原過度表達，這種高糖誘導(dǎo)的過度表達與血管纖維化及血管硬化高度相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗引起的相關(guān)病理改變和胰島素信號通路受損已成為2型糖尿病、代謝綜合征和血管病變早期發(fā)病的危險因素[7]。

JNK在細胞、生產(chǎn)、凋亡、增殖和細胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用。目前認(rèn)為JNK參與了1型糖尿病的形成，誘導(dǎo)活化JNK通路可導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，并且JNK與胰島β細胞凋亡、胰島素基因表達障礙、胰島素抵抗和動脈粥樣硬化密切相關(guān)。此外，研究表明[8-9]JNK的異常表達可影響轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的活性，進而影響肺臟、腎臟及血管纖維化的進程。2型糖尿病狀態(tài)下，活化的TGF-β1通過激活JNK信號傳導(dǎo)途徑，進而引起Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成明顯增加并能促進纖維連接蛋白（FN）的過度聚集，最終導(dǎo)致組織纖維化的產(chǎn)生。從動物造模及實驗結(jié)果來看，中晚期糖尿病大鼠存在明顯的下肢血管病變，其病理改變與纖維化有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，JNK在糖尿病大鼠股動脈中明顯升高，可能是導(dǎo)致大血管纖維病變的分子機制。

桃仁為薔薇科植物桃或山桃的干燥成熟種子，可入中藥，也稱為“桃核仁”“南杏”，桃仁藥用首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，載其：“主瘀血血閉，癥痛邪氣，殺小蟲?！薄妒宠b本草》記載：“桃仁破血，潤大腸?！薄睹t(yī)別錄》中記載桃仁：“止咳逆上氣，消心下堅，除卒暴擊血，破癥痛，通脈，止痛?！薄侗静菥V目·果一·桃》中記載：“桃仁行血，宜連皮尖生用?！庇衅蒲叙觯瑵櫾锘c之功效。中醫(yī)認(rèn)為瘀血是糖尿病及其血管并發(fā)癥的重要病理基礎(chǔ)，活血化瘀藥能明顯降低糖尿病鼠大動脈轉(zhuǎn)化生長因子-β、結(jié)締組織生長因子、血小板衍生生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ含量，具備有效抑制糖尿病大血管向纖維化發(fā)展的傾向?，F(xiàn)代研究證明[10-13]桃仁通過擴張血管、抑制血小板聚集、抗凝血、抗血栓、抗纖維化等發(fā)揮活血化瘀的作用。目前研究表明桃仁提取物對肝纖維化均有良好的防治作用，其抗組織纖維化的機制在于促進Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型膠原和FN的降解[14]；此外桃仁對大鼠血液循環(huán)障礙及血管內(nèi)皮細胞凋亡也有明顯的抑制作用[10，15]。

本實驗結(jié)果表明，中藥早期干預(yù)對糖尿病股動脈纖維化有明顯預(yù)防作用，能有效抑制糖尿病血管病變的發(fā)展；在血管病變發(fā)生后，中藥干預(yù)3周，早期干預(yù)療效明顯，桃仁高劑量組療效良好，桃仁低劑量組療效欠佳，表明桃仁對糖尿病股動脈纖維病變的抑制作用與用藥劑量及用藥時間成正相關(guān)。

根據(jù)實驗結(jié)果分析，桃仁可有效改善糖尿病股動脈纖維病變，其作用機制可能是通過抑制JNK1基因的表達，降低JNK1蛋白的生成與表達，從而達到抑制股動脈纖維化形成的目的。

表2 治療后各組大鼠股動脈JNK1基因表達的比較（±s）Tab.2 Comparison of the JNK1 gene expression in the femoral artery of each group after treatment（±s）

表2 治療后各組大鼠股動脈JNK1基因表達的比較（±s）Tab.2 Comparison of the JNK1 gene expression in the femoral artery of each group after treatment（±s）

注：與空白對照組相比，**P＜0．01；與模型組相比，##P＜0．01；與桃仁高劑量組相比，△△P＜0．01；與桃仁低劑量組相比，▲▲P＜0．01。

組別 動物數(shù)（只） JNK1早期干預(yù)組 10 1．228 1±0．070 2**##△△▲▲桃仁低劑量組 10 1．991 1±0．067 8**##△△桃仁高劑量組 10 1．330 4±0．078 2**##模型對照組 10 2．081 2±0．075 4**空白對照組 10 1．006 2±0．063 5