白芍藥材的質(zhì)量屬性研究及產(chǎn)地評價(jià)*

譚佳威，白 潔，田灣灣，洪婷婷，梁 軍，鐘琳瑛，張 琦，劉彩鳳，陸 洋，杜守穎

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029）

仲景之方，組方嚴(yán)謹(jǐn)，療效卓越，其組方法度與臨床療效堪稱后世方劑的典范，為歷代醫(yī)家所稱贊。其中《傷寒論》是醫(yī)學(xué)史上的集大成之作，是中醫(yī)經(jīng)典的核心組成部分?！秱摗饭草d藥215種，芍藥配伍組方使用頻率高達(dá)56次，芍藥的使用頻率在單味藥中排名第5?，F(xiàn)行《傷寒論》教材全書所提及的名方共115方，其中含芍藥的有33方，芍藥用量頻次最高的為3兩，占15方。在這15方中，除去1個(gè)散方外，共14個(gè)湯方，其中加水煎煮至3升的用法共涉及11首。由于受歷史時(shí)期的限制，漢代芍藥并無赤白之分，后世醫(yī)家對芍藥究竟是用赤芍還是白芍的爭論從未停息過。筆者認(rèn)為既然漢代芍藥混用，就不能有所偏倚，排除另外一種芍藥的可能性，所以應(yīng)根據(jù)具體的方具體分析。以目前筆者正在研究的經(jīng)典名方真武湯說明，真武湯證為肝脾腎三陰同病，芍藥酸斂入肝，可調(diào)養(yǎng)厥陰肝木，使肝木條達(dá)疏泄的功能得以恢復(fù)，從而達(dá)到斂陰和營，緩急止痛，柔肝調(diào)氣，利小便等主治功效，據(jù)此推斷真武湯中的芍藥指現(xiàn)今之白芍[1-5]。

白芍是毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根[6]，具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛、平抑肝陽等功效[7]。白芍中含有白芍總苷、鞣質(zhì)、三萜類、揮發(fā)油等化學(xué)成分[8]，現(xiàn)代研究表明，白芍總苷是白芍中最具代表性的活性成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝，對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)和抗氧化等藥理作用[9-12]。白芍主產(chǎn)于安徽、浙江、四川、山東等地[13]，受土壤、氣候及生態(tài)環(huán)境等影響，藥材品質(zhì)存在一定的差異性[14]。本研究首先測定影響白芍藥材關(guān)鍵質(zhì)量的成分芍藥苷含量，評判藥材是否符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。然后采用水回流提取法，參考上述提及的頻次最高的參數(shù)（白芍劑量為3兩≈41.4 g，溶劑用量為3升≈600 mL[15]），摸索并建立白芍藥材水煎液的特征圖譜，結(jié)合出膏率，通過化學(xué)計(jì)量學(xué)和成分分析開展不同產(chǎn)地白芍藥材的質(zhì)量屬性研究，為白芍藥材的產(chǎn)地評價(jià)提供參考。借著國家對中藥經(jīng)典名方的重視及其發(fā)展的春風(fēng)，此項(xiàng)研究為含白芍的經(jīng)方研發(fā)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有一定的實(shí)用性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo Fisher U3000高效液相色譜儀（DAD檢測器，CM 7.2色譜工作站）；賽多利斯BT 125D（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；電子分析天平賽多利斯BSA 224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；JM-B10002電子天平（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DZF-6051型真空干燥器（北京利康達(dá)圣科技有限公司）；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MH-250調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試藥 白芍藥材由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司自采及購買，見表1，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院鑒定系張媛教授鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。夏、秋二季采挖，初加工方法為：洗凈，除去頭尾和細(xì)根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，干燥方法為：曬干。所有樣品的生長年限均在兩年左右。

表1 21批白芍藥材樣品信息Tab.1 The information of 21 batchesof Paeonia lactiflora samples

芍藥苷對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號110736-201741）；沒食子酸（購自上海源葉生物科技有限公司，CAS：149-91-7）；（+）-兒茶素（購自中國食品藥品檢定研究院，批號877-200001）；（-）-兒茶素（購自中國食品藥品檢定研究院，批號878-200102）；芍藥內(nèi)酯苷（購自上海源葉生物科技有限公司，CAS：39011-90-0）；鞣花酸（購自上海源葉生物科技有限公司，CAS：476-66-4）；苯甲酸（購自上海源葉生物科技有限公司，CAS：65-85-0）；苯甲酰芍藥苷（購自上海源葉生物科技有限公司，CAS：38642-49-8）；磷酸（Fisher公司，色譜純）；乙腈（Fisher公司，色譜純）；水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），其他試劑均為分析純。

2 白芍中指標(biāo)性成分芍藥苷的含量測定方法及結(jié)果

2.1 色譜條件的建立[6]（參考2015版《中國藥典》一部白芍藥材項(xiàng)下） 色譜柱為Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相是乙腈-0.1%磷酸溶液（14：86）；檢測波長為 230 nm；柱溫為30℃；流速是1.0 mL/min；進(jìn)樣量是10μL。

2.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含46.17μg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品中粉約0.1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加稀乙醇35 mL，超聲處理（功率 240 W，頻率 45 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)行HPLC分析。每批藥材平行制備2個(gè)樣品，共42個(gè)樣品。

2.4 樣品測定 精密稱取21批白芍藥材中粉粉末，分別按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，除S16（廣西靈山）中芍藥苷含量太低（僅0.19%），其余樣品中芍藥苷的含量均不低于1.6%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。四川中江、安徽亳州、湖南、浙江磐安4個(gè)產(chǎn)地藥材中芍藥苷的含量遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，以芍藥苷含量為考察指標(biāo)，這4個(gè)產(chǎn)地的白芍藥材質(zhì)優(yōu)。

3 特征圖譜的方法與結(jié)果

3.1 色譜條件的建立 通過多次對色譜條件的調(diào)節(jié)，從峰的數(shù)量、峰形、分離度、響應(yīng)值、出峰時(shí)間等進(jìn)行綜合考慮，最終確立色譜條件為：Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），洗脫梯度如下：0～7 min，3%A 等度；7～29 min，3～14%A；29～32 min，14%A；32～44 min，14%～18%A；44～59 min，18%～27%A；59～70 min，73%～40%A；檢測波長為230 nm；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為20μL。

3.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1mL含46.17μg的對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備 將白芍藥材切成1～2 mm規(guī)格的片或小塊，精密稱取6.9 g于250 mL圓底燒瓶中，精密加入100 mL水，加熱回流70 min后放冷，搖勻后用紗布過濾，濾液加水定容至100 mL量瓶中，稀釋1倍后，將稀釋水液離心（10 000 r/min，5 min），取上清液濾過，用續(xù)濾液進(jìn)行HPLC分析。（參照前言部分，藥材取樣量和加水用量進(jìn)行了同比例縮小處理）。

表2 不同產(chǎn)地白芍藥材中芍藥苷的含量測定Tab.2 Content determination of Paeoniflorin of Paeonia lactiflora from different producing areas

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取S1號白芍藥材，按照“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測定，以芍藥苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，分別對各共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時(shí)間的RSD在0.01%~0.03%，相對峰面積的RSD在0.09%~1.07%，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版本）”軟件進(jìn)行處理，6次測定的圖譜與對照圖譜的相似度為1，說明該儀器精密度良好。

科技平臺建設(shè)取得新進(jìn)展。組織開展申報(bào)建設(shè)江湖治理與保護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的前期準(zhǔn)備工作，國家大壩安全工程技術(shù)研究中心已經(jīng)科技部專家組現(xiàn)場驗(yàn)收，長江防洪大模型通過竣工驗(yàn)收。國際合作與交流進(jìn)一步加強(qiáng)，成功舉辦第七屆中韓水技術(shù)交流會，穩(wěn)步推進(jìn)西南國際河流管理。

3.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取S1號樣品平行制備供試品溶液6份，測得各共有峰的相對保留時(shí)間RSD在0.01%~0.12%，共有峰的相對峰面積RSD在0.16%~3.93%，6次測定的圖譜與對照圖譜的相似度為1，說明所用方法重復(fù)性良好。

3.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取S1號樣品制備供試品溶液1 份，分別在 0、3、6、9、12、24 h 進(jìn)行測定，測得各共有峰的相對保留時(shí)間RSD在0.01%~0.05%，共有峰的相對峰面積RSD在0.22%~4.95%，6次測定的圖譜與對照圖譜的相似度為1，說明該樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 不同產(chǎn)地白芍藥材水煎液特征圖譜的評價(jià)

3.5.1 相似度評價(jià)及成分鑒別 將6個(gè)產(chǎn)地21批次白芍藥材的數(shù)據(jù)采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版本）”軟件進(jìn)行處理，將S1設(shè)置成參照圖譜，選擇對照圖譜生成方式為“中位數(shù)”法，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，系統(tǒng)根據(jù)多批次樣品色譜圖的共有模式生成對照圖譜R，以圖譜中峰面積最大且穩(wěn)定的成分芍藥苷為對照峰，對白芍樣品共有模式中已標(biāo)定的6個(gè)共有峰進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算出21批白芍藥材特征圖譜與對照圖譜 R 的相似度分別為：0.932，0.977，0.990，0.995，0.921，0.985，0.989，0.998，0.962，0.989，0.999，0.998，0.999，0.998，0.989，0.856，0.991，0.913，0.929，0.829，0.993，見圖1。除S16和S20之外，其余樣品與對照圖譜間的相似度均大于0.9，說明安徽亳州、浙江磐安和四川中江、部分山東鄄城及湖南產(chǎn)地的白芍藥材相似度良好。安徽亳州、浙江磐安與四川中江產(chǎn)地內(nèi)的白芍質(zhì)量均一，湖南產(chǎn)地與這3個(gè)產(chǎn)地的藥材質(zhì)量接近；廣西靈山與部分山東鄄城產(chǎn)地的白芍樣品質(zhì)量較為接近，與其他產(chǎn)地藥材有一定差異；而4批山東鄄城產(chǎn)地內(nèi)的白芍質(zhì)量差異較大。

使用相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比對，結(jié)合成分的吸收光譜，通過比較與分析，對白芍藥材水煎液中的成分進(jìn)行鑒定，詳情見表3。

分析如下：從共有峰來看，S16中的峰2、7、8、10和12的面積很?。ǚ?的相對峰面積為0.02%，其余批次的平均相對峰面積占0.79%；峰7的相對峰面積為2.55%，其余批次的平均相對峰面積為30.98%；峰8的相對峰面積是0.14%，其他批次的平均相對峰面積占1.12%；峰10的相對峰面積是3.13%，其余批次的平均相對峰面積為25.79%；峰12的相對峰面積為0.25%，其余批次的平均相對峰面積是1.47%）；S20中的峰6的面積很大（峰6的相對峰面積是22.64%，其余批次平均的相對峰面積是5.94%）。

從非共有峰角度，S16中的峰3面積很大（峰3的相對峰面積是63.57%，其余批次平均的相對峰面積是5.13%）；S20中的峰3面積較大（峰3的相對峰面積是3.30%），峰4面積很大（峰4的相對峰面積是6.44%，其余批次平均的相對峰面積占0.34%）。

基于共有峰與非共有峰的相對峰面積比較的結(jié)果，進(jìn)一步論證了S16和S20這兩個(gè)批次樣品確實(shí)與其他樣品存在差異。

圖1 21批白芍藥材的HPLC特征圖譜Fig.1 HPLC characteristic spectra of 21 batchesof extract of Paeonia lactiflora

表3 白芍藥材多種水溶性成分的鑒定Tab.3 Identification of several water-soluble constituents of Paeonia lactiflora

3.5.3 主成分分析 在對多指標(biāo)進(jìn)行研究分析時(shí)，多個(gè)數(shù)指標(biāo)及它們之間的相互關(guān)系致使分析工作較困難，主成分分析法（PCA）是一種通過降維技術(shù)，用少數(shù)幾個(gè)具有代表的綜合性指標(biāo)，根據(jù)貢獻(xiàn)率的大小代替多個(gè)原始變量，從而達(dá)到簡化多指標(biāo)分析的目的，是一種化繁為簡的多元統(tǒng)計(jì)分析方法[17-18]。對21批白芍藥材特征圖譜中量化的各共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后，借助SPSS25軟件對所得的6個(gè)共有峰進(jìn)行主成分分析，求出相關(guān)矩陣的特征值及其方差。按照主成分對應(yīng)的特征值應(yīng)大于1的提取原則，本研究共提取了兩個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到77.703%，表明這兩個(gè)主成分能代表6個(gè)共有峰在21批樣品中的大部分信息。其中PC1的特征值為3.184，方差貢獻(xiàn)率為53.059%；PC2的特征值為1.479，方差貢獻(xiàn)率為24.644%。主成分載荷矩陣見表4。

圖2 系統(tǒng)聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram for thesystematic clustering

圖3 主成分得分圖Fig.3 PCA score figure

表4 主成分載荷矩陣Tab.4 Component matrix

在上表中，6個(gè)共有峰對應(yīng)影響主成分的6個(gè)變量，主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻(xiàn)大小和作用方向。特征向量的數(shù)值和符號代表變量在主成分中的權(quán)重，權(quán)重越大，表明該化合物在藥材主成分分析中的作用越大[19]。由表可得：共有峰峰2、峰7（芍藥苷）、峰8和峰10（苯甲酸）對PC1的影響很大，而PC1相比于其他主成分在說明不同產(chǎn)地白芍藥材特征圖譜的信息中起關(guān)鍵作用。以PC1和PC2的得分向量分別作為橫、縱坐標(biāo)對21個(gè)樣本作主成分得分圖（圖3）。通過結(jié)果得知：S1~S15、S17~S19、S21樣品分布較近，說明安徽亳州、浙江磐安和四川中江、部分山東鄄城及湖南產(chǎn)地的白芍藥材的質(zhì)量接近；S16（廣西靈山）和S20（山東鄄城的其中一批）離群較遠(yuǎn)，分布相對獨(dú)立，其質(zhì)量與其他產(chǎn)地藥材質(zhì)量相差較大。主成分分析結(jié)果與相似度評價(jià)、聚類分析結(jié)果相符。

4 21批白芍樣品出膏率的測定方法與結(jié)果

4.1 出膏率的測定方法 將白芍藥材切成1～2 mm規(guī)格的片或小塊，精密稱取6.9 g于250 mL圓底燒瓶中，精密加入100 mL水，加熱回流70 min后用300目尼龍篩網(wǎng)趁熱過濾，所得濾液用蒸發(fā)皿收集并置于水浴鍋上，加熱濃縮成稠膏狀，再將其置于真空干燥器中，60℃干燥60 h，取出稱質(zhì)量，計(jì)算出膏率。

4.2 出膏率的測定結(jié)果 21批白芍樣品平均出膏率為14.94%，整體出膏率水平在12.53%~16.19%范圍內(nèi)，相對穩(wěn)定且集中，為含白芍的復(fù)方制劑成型提供了重要保障。其中安徽亳州的出膏率最高（16.19%），浙江磐安的出膏率最低（12.53%），其他產(chǎn)地的白芍藥材出膏率處于平均值左右。以出膏率為考察指標(biāo)，在這6個(gè)產(chǎn)地中，安徽亳州的藥材品質(zhì)最佳。

5 研究總結(jié)與討論

5.1 優(yōu)質(zhì)白芍藥材的產(chǎn)地考察 本研究證明廣西靈山的白芍藥材中芍藥苷含量過低，達(dá)不到藥典標(biāo)準(zhǔn)，且通過化學(xué)計(jì)量學(xué)分析其質(zhì)量與其他產(chǎn)地質(zhì)量的差異較大，此產(chǎn)地的白芍品質(zhì)差。歷史上，安徽亳州、四川中江、浙江磐安和山東菏澤是白芍的主產(chǎn)區(qū)[20]，這4個(gè)產(chǎn)地的白芍質(zhì)量相對較優(yōu)，尤其是前3個(gè)產(chǎn)地，在本實(shí)驗(yàn)中已得到進(jìn)一步證明。對于4個(gè)主產(chǎn)區(qū)藥材，本研究發(fā)現(xiàn)山東菏澤鄄城的白芍中芍藥苷含量相比其他3個(gè)產(chǎn)地的要少，其圖譜與對照圖譜相比相似度值較低，與其他3個(gè)主產(chǎn)區(qū)的白芍有一定差異，且山東鄄城同一產(chǎn)地內(nèi)的白芍質(zhì)量相差較大。湖南產(chǎn)地的藥材品質(zhì)較好，但畢竟不是白芍主產(chǎn)區(qū)，此產(chǎn)地白芍藥材的產(chǎn)量不大。結(jié)合藥材質(zhì)量與產(chǎn)量等因素綜合考慮，在研究其經(jīng)典名方時(shí)，對于白芍藥材的來源可選取安徽亳州、四川中江和浙江磐安3個(gè)產(chǎn)地。

5.2 同產(chǎn)地藥材的差異性探討 基于山東鄄城同一產(chǎn)地的藥材品質(zhì)差異較大這一研究結(jié)果，應(yīng)從源頭規(guī)范藥材的種植與生產(chǎn)，確保含白芍的制劑成品質(zhì)量的均一穩(wěn)定性。從成分角度考慮，發(fā)現(xiàn)這4批山東鄄城產(chǎn)地的白芍藥材中芍藥苷亞硫酸酯的含量較高。有研究證明芍藥苷亞硫酸酯和芍藥苷的含量呈負(fù)相關(guān)，這可能與白芍本身的質(zhì)量差異相關(guān)，但也可能是由于這幾批藥材在產(chǎn)地粗加工過程中采用了二氧化硫熏蒸的方法[21-22]。這有待進(jìn)一步考察與商榷，如果因前者而起，應(yīng)加強(qiáng)對其種質(zhì)的保護(hù)和恢復(fù)；如因后者導(dǎo)致，則需在其生產(chǎn)加工上進(jìn)行規(guī)整，在市場流通方面加強(qiáng)監(jiān)管，嚴(yán)格執(zhí)行法定的限量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步完善白芍質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證白芍藥材的安全與有效性。

5.3 流動(dòng)相體系和檢測波長的選取說明 本實(shí)驗(yàn)主要對色譜條件中的流動(dòng)相體系和檢測波長進(jìn)行考察。分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液與甲醇-0.1%磷酸溶液3種流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-水為流動(dòng)相，在有機(jī)相比例較低的階段，色譜圖中有一段出現(xiàn)“鼓峰”，基線波動(dòng)很大；以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，樣品中成分洗脫所需時(shí)間太長，且峰形相對較差；三者中以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相的圖譜效果最佳，因此選擇它為流動(dòng)相體系。對210～300 nm波長段中整十的波長進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在230 nm波長下，圖譜所呈現(xiàn)的信息更全面，響應(yīng)值較高，且基線較為平穩(wěn)，故選擇230 nm作為檢測波長。

5.4 白芍藥材的提取方法說明 白芍是經(jīng)典名方真武湯水煎液中成分最多的一味藥，本研究首先按照藥典方法進(jìn)行白芍中指標(biāo)性成分芍藥苷的含量測定，然后基于《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求（征求意見稿）》的思路，采用水回流提取法，通過白芍藥材水煎液特征圖譜和出膏率開展質(zhì)量屬性研究。明確白芍水煎液中一些重要的活性物質(zhì)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對白芍藥材的產(chǎn)地進(jìn)行深入研究。采用水回流法，一是考慮臨床用藥以水為媒介，二是考慮回流法具有提取效率高，且節(jié)約溶劑與藥材等優(yōu)勢。

5.5 白芍水煎液中不穩(wěn)定成分的探討 白芍藥材水回流提取后的即時(shí)顏色是明亮的黃色，隨著放置時(shí)間的延長，白芍水液的顏色逐漸加深，從黃色過渡到棕色，最后逐漸變?yōu)樽睾谏?。?jīng)液相檢測，在可見光區(qū)并未檢測到色譜峰，結(jié)合文獻(xiàn)分析可知引起此現(xiàn)象的原因是白芍中有鞣質(zhì)類成分存在，易被氧化，比如：沒食子酸、鞣花酸等。沒食子酸和鞣花酸在水液中不穩(wěn)定，沒食子酸隨著放置時(shí)間的延長其含量呈下降趨勢；鞣花酸隨放置時(shí)間延長，含量反而呈現(xiàn)上升趨勢；五沒食子酰葡萄糖在50%熱乙醇溶液中的提取率最大，而在水中的提取率較低，所以在圖譜中此成分的峰面積較低，且有部分藥材檢測不到五沒食子酰葡萄糖的色譜峰。這是成分的分解和成分間轉(zhuǎn)化的結(jié)果，此類成分在白芍水液或含白芍的復(fù)方煎劑中不宜作為共有峰[23]。苯甲酸可由苷類成分水解生成，在延長煎煮時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，苷類物質(zhì)的含量會降低，而苯甲酸的含量反而有所增加。