白茶、玫瑰花及玳玳花提取物對體外培養(yǎng)黑素細胞功能的影響*

金 鑫 ，高 擎，翟曉翔 ，李 潔 ，張曉宇

（1.無限極（中國）有限公司，廣州 510663；2.上海市第七人民醫(yī)院，上海 422700；3.徐州市中醫(yī)院，徐州 221000）

黃褐斑是常見的色素沉著性皮膚病，臨床表現(xiàn)為淡褐色或深褐色斑片，大多呈對稱性分布。患者雖無自覺癥狀，但嚴重損害面容美觀，給患者造成一定的心理影響。目前黃褐斑沒有特效的治療方法。近年來從天然植物中提取活性成分用于黃褐斑、雀斑等皮膚病的治療逐漸成為熱點。祛斑因子A、B即是從白茶、玫瑰花及玳玳花中所提取的活性成分。本研究采用祛斑因子含藥血清作用于體外培養(yǎng)的黑素細胞體系，觀察其對黑素細胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及其mRNA表達的影響；同時建立角質(zhì)形成細胞與黑素細胞的體外共培養(yǎng)體，觀察祛斑因子對黑素細胞樹突生長及黑素小體轉(zhuǎn)運的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級大鼠，雄性30只，體質(zhì)量（200±20）g（山東大學耳鼻喉實驗室）。

1.2 細胞株來源 健康兒童（5～12歲）包皮環(huán)切術(shù)后的包皮（山東大學齊魯醫(yī)院醫(yī)院泌尿外科）。

1.3 實驗藥品 祛斑因子B（白茶提取物）、祛斑因子A（白茶、玫瑰花及玳玳花提取物：將3種中藥按照比例投料400 g→加水5 L提取40 min（1提，微沸，避免大火強熱）→100目過濾備用→加水5 L提取40 min（2提，微沸，避免大火強熱）→100目過濾備用→合并2次提取濾液→濃縮至500 mL左右（微沸，避免大火強熱）→填充至10 mL口服液瓶）（兩者均為無限極中國有限公司所提?。?；太太美容口服液（深圳太太藥業(yè)有限公司，批號：TGC1232）；維生素C片（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：5141206）用時研細粉，用蒸餾水配成溶液。

1.4 主要試劑和儀器 D-Hanks液、雙抗（青霉素和鏈霉素）、DM254培養(yǎng)基、KC-FSFM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）、二甲基亞砜（DMSO）、4-甲基偶氮唑藍（MTT）、左旋多巴（均購自Sigma公司），TritonX-100（Amresco公司），RNA提取試劑盒、0.25%胰蛋白酶-EDTA液、胎牛血清（購自杭州四季青生物有限公司），irTton X-20（Ge nview公司），pulldown試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、Alexa-fluor-594-anti-cytokeratin-19-抗體（購自南京建成生物工程有限公司），CFDA-SE（上海麥約爾生物技術(shù)有限公司），Li-Cor近紅外成像儀（美國LI-CO公司），BDFalcon流式細胞儀（美國BD生物公司），Wellsean MK3型酶標儀（Labsystems公司），Smartspec300紫外可見光分光光度計、DNA擴增儀、電泳圖像分析儀（iBo-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備[1]祛斑因子A臨床擬用藥量設(shè)為高、中、低 3 組[4 mL/60（kg·d）、8mL/60（kg·d）、12 mL/60（kg·d）]，祛斑因子 B 設(shè)為[6 mL/60（kg·d）]，太太美容口服液組[20 mL/60（kg·d）]，維生素 C 組[30 mg/60（kg·d）]，按照公式換算法：動物給藥劑量=臨床用藥量×動物等效劑量系數(shù)（按體表面積）×培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度，空白血清對照組給予同等劑量蒸餾水灌胃，2次/日，連續(xù)3日，最后1次灌胃后1～2 h內(nèi)腹主動脈取血，無菌分離血清；-80℃保存，使用前滅活。臨用時調(diào)至終濃度。

2.2 原代黑素細胞的培養(yǎng) 參考Halaban R[3]的方法，取包皮組織，分離并純化黑素細胞，接種于DM254培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，收獲3~4代備用。

2.3 MTT法檢測黑素細胞的增殖 將前期收獲的黑素細胞接種于96孔板，每孔5×103細胞，24 h后加入含藥血清，以不含藥物的空白血清作為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，離心棄上清，每孔加入5μg/mL的 MTT溶液 20μL，置于 37℃、5%CO2孵箱 4 h，棄上清，每孔加DMSO150μL，室溫振蕩10 min，置酶標儀490 nm（630 nm為校準波長）波長下測量各孔吸光度值。黑素細胞抑制率（%）=1-含藥血清組OD值/空白血清對照組OD值×100%。

2.4 酪氨酸酶活性測定 同MTT法中操作方法，不同配方含藥血清作用于黑素細胞72 h后，收集細胞，離心棄上清液，PBS洗2次，加入200μL0.1%TritonX-100裂解液，置于-80℃冰箱中0.5 h，37℃水浴箱中復(fù)溫0.5 h，加2 mg/mL L-Dopa（左旋多巴）400μL，繼續(xù)37℃孵育2 h，紫外分光光度計讀取450 nm處OD值，用L-Dopa的自動氧化進行校正。以不加中藥的反應(yīng)混合物作為對照組。酪氨酸酶活性影響率（%）=（含藥血清組OD值-空白血清對照組OD值）/空白血清對照組OD值×100%。

2.5 黑素含量測定 同MTT法中操作方法，不同配方含藥血清作用于黑素細胞72 h后，傾去培養(yǎng)液，用生理鹽水清洗1次，胰酶消化，離心，吸出上清液，加入NaOH，于80℃水浴保溫1 h，置于波長490 nm下測OD值。黑素相對含量（%）=含藥血清組/空白血清對照組×100%。

2.6 酪氨酸酶mRNA表達量測定 取第3~4代對數(shù)生長期的黑色素細胞，以1×104個/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶中，不同配方含藥血清作用于黑素細胞4 h后，采用Trizol Reagent總RNA提取試劑盒進行總RNA提取，操作步驟按試劑盒說明書進行。電泳鑒定提取RNA的完整性。統(tǒng)一調(diào)整總RNA純度為0.5 g/L，于-70℃儲存。取6μLRNA為反轉(zhuǎn)錄模板，在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得目的基因mRNA序列，采用Primer express2.0軟件，在CDS區(qū)設(shè)計特異性引物（由山東大學齊魯醫(yī)院耳鼻喉實驗室設(shè)計，實驗使用引物TYR-421F：GCAAAGCATACCATCAGCTC；TYR-565R：GCAGTGCATCCATTGACACAT）。使用TAKARA的RT-PCR試劑盒將RNA進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測方法進行酪氨酸酶mRNA的表達的檢測。mRNA的相對表達量（%）=含藥血清組/空白血清對照組×100%。

2.7 Pull down實驗和Western Blot檢測 GTPRhoA和GTP-Rac1蛋白的表達在收獲的3-4代的黑素細胞中加入含生長因子添加物M254，光學顯微鏡下計數(shù)細胞；將細胞以每孔1×106接種10 cm培養(yǎng)皿，設(shè)對照組（空白血清）和實驗組（含藥血清）；隔日更換新鮮培養(yǎng)液，待細胞生長至約70%，更換不含生長因子的M254繼續(xù)培養(yǎng)，饑餓24 h后吸出培養(yǎng)液加入含有藥物血清的M254處理120 min收集細胞，按照pull down試劑盒加入裂解液于冰上行細胞裂解，充分裂解后取裂解液離心收集上清備用，BCA法測上清液中總蛋白量，各組取20μg樣品蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液室溫封閉1 h。加入特異性識別抗體（Ⅰ抗，以適當比例稀釋，β-actin為1：1 000，Tyr為 1：500），4℃封閉過夜。TBS 震蕩洗膜后，加入熒光Ⅱ抗（1：10 000），避光室溫孵育 1 h，Odssey雙色紅外成像儀掃描，用Image-plus6.0圖像分析軟件測量數(shù)據(jù)。蛋白相對表達量（%）=含藥血清組/空白血清對照組×100%。

2.8 流式細胞術(shù)檢測 共培養(yǎng)細胞體系培養(yǎng)參照黑素細胞培養(yǎng)方法，不同在于角質(zhì)形成細胞的培養(yǎng)基為KC-SFM（含生長因子）。將生長至3~4代的角質(zhì)形成細胞消化后離心，光學顯微鏡下計數(shù)，將細胞濃度調(diào)至2×105個/mL，以每孔5 mL接種10 cm培養(yǎng)皿。在前期收獲的3~4代黑素細胞加入2μmol/L的CFDA-SEHanks平衡液10 mL重懸細胞，進行CFDA-SE熒光標記，37℃避光孵育后以1：2（黑素細胞：角質(zhì)細胞）比例進行共培養(yǎng)，用含藥物血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d，并設(shè)空白血清對照組，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗2次，充分消化后PBS重懸細胞，光學顯微鏡下細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1×106個/mL；取2 mL離心加入試劑A（固定劑）100μL，室溫固定15 min；用PFN 3 mL洗細胞1次，離心，加入試劑B（透膜劑）100μL，室溫孵育 10 min；離心，用 100μL PBS重懸細胞，加入anti-cytokeratin-19抗體。PFN洗滌細胞，離心后，用lmLPBS重懸細胞。CFDA-SE可用488 nm激發(fā)，anti-cytokeratin-19用590 nm激發(fā)（CFDA和anti-cytokeratin-19均陽性者，即成功發(fā)生黑素轉(zhuǎn)運的角質(zhì)形成細胞數(shù)目）。黑素小體轉(zhuǎn)運抑制率（%）=（空白血清對照組轉(zhuǎn)運率-含藥血清組轉(zhuǎn)運率）/空白血清對照組轉(zhuǎn)運率×100%。

3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS19．0進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

4 實驗結(jié)果

4.1 祛斑因子A、B對黑素細胞增殖的影響 祛斑因子A、B，維生素C及太太美容口服液對黑素細胞增殖的影響結(jié)果見表1。祛斑因子A低、中劑量組、祛斑因子B組、維生素C組黑素細胞相對增殖率均低于空白血清對照組，祛斑因子A高劑量組、太太美容口服液組黑素細胞相對增殖率高于空白血清對照組，但與空白血清對照組比較（差異）均無統(tǒng)計學意義。說明各含藥血清組在此藥物劑量下對黑素細胞的增殖無影響。

表1 祛斑因子A、B對黑素細胞增殖的影響（±s，n≥3）Tab.1 Effectsof freckle factor A and B on the proliferation of melanocytes（±s，n≥3）

表1 祛斑因子A、B對黑素細胞增殖的影響（±s，n≥3）Tab.1 Effectsof freckle factor A and B on the proliferation of melanocytes（±s，n≥3）

注：與空白血清對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01。

組別 黑素細胞相對增殖率（%）空白血清對照組 100．00祛斑因子 A 低劑量組 89．06± 8．72*祛斑因子 A 中劑量組 98．59± 9．10*祛斑因子 A 高劑量組 100．26± 3．58祛斑因子 B 組 92．70± 6．76*維生素 C 組 88．10±16．20*太太美容口服液組 110．87±10．98

4.2 祛斑因子A、B對黑素含量的影響 祛斑因子A、B，維生素C及太太美容口服液對黑素合成總量的影響結(jié)果見表2。祛斑因子A高、中、低劑量組、祛斑因子B組、維生素C組及太太美容口服液組黑素含量均低于空白血清對照組，并具有統(tǒng)計學意義。與維生素C及太太美容口服液比較，祛斑因子A高、中、低劑量組、祛斑因子B組其黑素含量有依次降低趨勢（表現(xiàn)為祛斑因子A低劑量組＜祛斑因子A中劑量組＜祛斑因子B組＜祛斑因子A高劑量組＜太太美容口服液組＜維生素C組），但不具有統(tǒng)計學意義。

表2 祛斑因子A、B對黑素合成的影響（±s，n≥3）Tab.2 Effectsof freckle factor A and B on melanin synthesis（±s，n≥3）

表2 祛斑因子A、B對黑素合成的影響（±s，n≥3）Tab.2 Effectsof freckle factor A and B on melanin synthesis（±s，n≥3）

注：與空白血清對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01。

組別 黑素含量（%）空白血清對照組 100．00祛斑因子 A 低劑量組 59．95±8．07**祛斑因子 A 中劑量組 64．05±14．40**祛斑因子 A 高劑量組 67．55±10．33**祛斑因子 B 組 66．24±12．75**維生素 C 組 79．68± 9．02**太太美容口服液組 77．06± 9．23**

4.3 祛斑因子A、B對酪氨酸酶活性及其mRNA表達的影響 祛斑因子A、B，維生素C及太太美容口服液對酪氨酸酶活性及其mRNA表達量的影響結(jié)果見表3。與空白血清對照組相比，各用藥組酪氨酸酶活性均降低，其中尤以祛斑因子A不同劑量組酪氨酸酶活性降低明顯，具有統(tǒng)計學意義；從數(shù)值分析，低劑量組對酪氨酸酶活性抑制較中、高劑量、祛斑因子B更為明顯（祛斑因子A低劑量＞祛斑因子A中劑量＞祛斑因子高劑量＞祛斑因子B），但無統(tǒng)計學意義。祛斑因子A各濃度組、祛斑因子B組與維生素C組及太太美容口服液組比較，差異無統(tǒng)計學意義。

表3 祛斑因子A、B對酪氨酸酶活性及其mRNA表達的影響（±s，n≥3）Tab.3 Effects of freckle factor A and B on tyrosinase activity and the expression of tyrosinase mRNA（±s，n≥3）

表3 祛斑因子A、B對酪氨酸酶活性及其mRNA表達的影響（±s，n≥3）Tab.3 Effects of freckle factor A and B on tyrosinase activity and the expression of tyrosinase mRNA（±s，n≥3）

注：與空白血清對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與太太美容口服液組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

酪氨酸酶mRNA表達量（%）空白血清對照組 100．00 100．00祛斑因子 A 低劑量組 64．50±11．70** 87．08±5．29**△△祛斑因子 A 中劑量組 60．99±16．93** 80．52±2．91**△△祛斑因子 A 高劑量組 57．34±10．21** 76．20±2．64**△△祛斑因子 B 組 71．61±9．62* 95．19±5．08△△維生素 C 組 59．24±7．78* 86．91±3．45**△△太太美容口服液組 72．75±15．60* 54．33±2．05**組別 酪氨酸酶活性（%）

酪氨酸酶mRNA表達量的結(jié)果顯示，各用藥組均表現(xiàn)為酪氨酸酶mRNA表達量降低，與空白血清對照組比較，除祛斑因子B組外，其余各組差異均具有統(tǒng)計學意義。

4.4 祛斑因子 A、B對黑素細胞 GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白的表達的影響 各藥物組對黑素細胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白表達影響見表4。祛斑因子A高、中、低濃度、祛斑因子B及維生素C組中黑素細胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白表達量均低于空白對照組，尤以維生素C組降低明顯，具有顯著統(tǒng)計學差異。太太美容口服液組黑素細胞中GTP-RhoA蛋白表達量高于空白血清對照組，而GTP-Rac1蛋白表達量低于空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義；祛斑因子A高、中、低劑量、祛斑因子B組兩蛋白表達量均低于太太美容口服液組，且兩兩組間均具有統(tǒng)計學意義。

表4 祛斑因子A、B對黑素細胞GTP-RhoA和GTPRac1 蛋白的表達的影響（±s，n≥3）Tab.4 Effects of frecklefactor A and B on the expression of GTP-RhoA and GTP-Rac1 in melanocytes（±s，n≥3）

表4 祛斑因子A、B對黑素細胞GTP-RhoA和GTPRac1 蛋白的表達的影響（±s，n≥3）Tab.4 Effects of frecklefactor A and B on the expression of GTP-RhoA and GTP-Rac1 in melanocytes（±s，n≥3）

注：與空白血清對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與維生素 C 組比較：#P＜0．05，##P＜0．01；與太太美容口服液組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。

組別 GTP-RhoA（%） GTP-Rac1（%）空白血清對照組 100．00 100．00祛斑因子 A 低劑量組 75．66±1．14**##△△ 77．75±0．55**##△△祛斑因子 A 中劑量組 78．48±0．89**##△△ 88．49±2．15**##△△祛斑因子 A 高劑量組 63．24±0．96**##△△ 81．67±1．50**##△△祛斑因子 B 組 94．67±0．44**##△△ 86．23±1．12**##△△維生素 C 組 50．03±0．49** 59．10±0．96#太太美容口服液組 109．70±0．27** 98．00±0．80

4.5 祛斑因子A、B對黑素小體轉(zhuǎn)運的影響 在人表皮角質(zhì)形成細胞和黑素細胞的體外共培養(yǎng)體系中，與空白血清對照組比較，含藥血清組均對黑素小體的轉(zhuǎn)運有明顯的抑制作用（P＜0．05），其中以祛斑因子B、祛斑因子A低劑量抑制作用明顯，二者無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）；祛斑因子 A 中、低劑量、祛斑因子B組黑素小體轉(zhuǎn)運抑制率均高于太太美容口服液組及維生素 C 組（P＜0．05），且兩兩比較組間均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表 5。

5 討論

黃褐斑是臨床多見的獲得性色素增多性皮膚病，發(fā)病原因眾多，發(fā)病機制復(fù)雜。中醫(yī)學認為肝郁、脾虛、腎虧導致臟腑失調(diào)，氣血失和不能上榮于面部而發(fā)為本病。臨床辨證施治以疏肝理氣、健脾除濕、滋補肝腎為主。近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學研究的不斷深入，對其發(fā)病機制有了新的發(fā)現(xiàn)，如血管內(nèi)皮長因子、皮膚屏障受損等。但黑素細胞數(shù)量或是活性的增加，及黑素合成的增多一直是黃褐斑最主要也是最直接的原因，Sheth[3]研究發(fā)現(xiàn)黑素細胞活性的增加對黃褐斑的影響要比黑素細胞數(shù)量的增多更為顯著。

表5 祛斑因子A、B對黑素小體轉(zhuǎn)運的影響（±s，n=3）Tab.5 Effect of freckle factor A and B on melanosome transport（±s，n=3）

表5 祛斑因子A、B對黑素小體轉(zhuǎn)運的影響（±s，n=3）Tab.5 Effect of freckle factor A and B on melanosome transport（±s，n=3）

注：與空白血清對照組比較：**P＜0．01；與維生素C組比較：P＜0．01；與太太美容口服液組比較，△△P＜0．01。

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黑素細胞分布于人體多種組織器官，其中以皮膚表皮最為多見，是合成和分泌黑素的重要場所。黑素細胞通過樹突向周圍角質(zhì)形成細胞提供黑素，形成一個表皮黑素單位。在黑素細胞中酪氨酸進入黑素小體，在酪氨酸酶（TYR）的作用下經(jīng)有多種生化反應(yīng)最終轉(zhuǎn)變?yōu)楹谒?，再由樹突轉(zhuǎn)運至皮膚角質(zhì)形成細胞。肌動蛋白F-actin作為細胞骨架結(jié)構(gòu)，可以調(diào)節(jié)樹突的伸長和縮短。而RhoA、Rac1調(diào)節(jié)F-actin重排，有實驗研發(fā)現(xiàn)，活化細胞中Rac1可使黑素樹突的延伸并生長[4]；Braga[5]等研究發(fā)現(xiàn)，抑制Rac1的活化可使細胞接觸點處E鈣黏蛋白水平下降，證明Rac1可促進黑素細胞與角質(zhì)形成細胞黏附，對黑素的轉(zhuǎn)運起到協(xié)同促進作用。

祛斑因子B成分為白茶提取物（主要活性成分為茶多酚），祛斑因子A是在祛斑因子B的基礎(chǔ)上添加玫瑰花及玳玳花的活性提取物?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚是一種高效的抗氧化劑，天然高效，具有抗氧化、抗過敏、抗紫外線輻射、保健美容的功效[6]。汪建[7]等觀察茶多酚經(jīng)皮吸收可顯著抑制皮膚酪氨酸酶的活性。玫瑰花性溫，味屬甘微苦，歸肝、脾經(jīng)，具有疏肝解郁，活血調(diào)經(jīng)，潤腸通便，解郁安神之功效，是皮膚科治療黃褐斑常用中藥。玳玳花味甘，微苦，疏肝和胃，理氣解郁。二者共用，更收疏肝解郁之功?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰中富含維生素C、鞣質(zhì)、原花青素、黃酮類等多酚類化合物，具有良好的抗氧化、清除自由基及清除色素沉著的作用[8]。玳玳花，是多種保健茶飲的主要成分，其有效成分以黃酮類及多種揮發(fā)醇類物質(zhì)為主，具有抗氧化作用[9]。

本實驗結(jié)果顯示，與空白血清對照組比較，各含藥血清組對黑素細胞增殖無影響；祛斑因子A高、中、低劑量及祛斑因子B可降低黑素細胞中黑素含量、抑制酪氨酸酶活性，且與維生素C、太太美容口服液效果相當；各含藥血清組均能降低酪氨酸酶mRNA的表達。據(jù)此可推測，祛斑因子A、B對酪氨酸酶活性的抑制作用機制除了通過抑制酪氨酸酶mRNA的表達從而減少其合成量之外，還可能與藥物中有效成分對酪氨酸酶有競爭性抑制作用相關(guān)。此外，祛斑因子A、B還可抑制黑素細胞GTPRhoA和GTP-Rac1蛋白的表達，其抑制作用優(yōu)于太太美容口服液組，但較維生素C組的抑制作用弱，而祛斑因子A低、中劑量組及祛斑因子B對黑素細胞轉(zhuǎn)運抑制率均高于維生素C組，可推測祛斑因子A低劑量及祛斑因子B除了抑制黑素細胞樹突生長及黏附功能外，對黑素轉(zhuǎn)運還有其他抑制途徑的可能。

綜上所述，祛斑因子A、B可降低酪氨酸酶活性，進而降低黑素含量，并能抑制樹突結(jié)構(gòu)蛋白GTP-RhoA和GTP-Rac1的表達，從而抑制黑素小體轉(zhuǎn)運。因此，祛斑因子能夠通過減少黑素生成及轉(zhuǎn)運兩種途徑來抑制黑素在表皮的分布，從而具有防治黃褐斑的作用。