機械加載減輕骨關節(jié)炎小鼠的病理進展

于詠，李心樂，2，劉大全，2，張平，2△

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是常見的慢性疾病之一。據(jù)統(tǒng)計，OA影響了全世界約6.3億人［1］，無論是在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，OA都造成了巨大的經(jīng)濟負擔［2］。以前認為OA是一種軟骨退化的疾病，但現(xiàn)在認為是一種全關節(jié)的病變［3］。滑膜炎和骨贅形成分別是OA 早期和晚期的典型病理變化。軟骨的退化可以促進滑膜的炎癥反應，滑膜炎也可以促進軟骨的退化［4］。骨贅是軟骨破壞后產(chǎn)生的新骨［5］，它來自于骨膜和滑膜［6］。

OA 的治療包括藥物治療和非藥物治療?？诜幬镏荒茉谝欢ǔ潭壬暇徑馓弁床⑶?guī)砗芏嗖涣挤磻?。關節(jié)置換術只適用于晚期患者，并且假體的壽命以及炎癥反應等均使其存在一定的局限性［7］。而物理康復治療作為一種新型的治療方式越來越引起廣泛的注意。本課題組自主研發(fā)的脈沖式關節(jié)機械加載是模擬主動有氧運動的物理康復療法。前期工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)機械加載可通過抑制軟骨下骨破骨細胞活性治療小鼠早期OA［8］。但是機械加載對晚期OA的作用尚不清楚。本實驗通過建立創(chuàng)傷性OA的小鼠模型，研究機械加載對早、晚期OA 軟骨的修復作用，并對早期OA的滑膜炎和晚期OA的骨贅進行研究，比較機械加載對OA早、晚期的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8 周齡 SPF 級雌性 C57BL/6 小鼠 36 只，體質量約20 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。實驗所用飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。實驗動物的飼養(yǎng)與管理過程均嚴格遵守天津醫(yī)科大學實驗動物管理規(guī)定。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.1.2 主要儀器和試劑 機械加載儀器采用本課題組自主研發(fā)并制作的產(chǎn)品（專利號：ZL201621010131.9）。H & E、番紅O染料購自美國Sigma公司，石蠟切片機（RM2255）購自德國Leica 公司，光學顯微鏡BX53購自日本Olympus 公司，SF-400 電子稱購自永康市轉金工貿有限公司，電子天平購自美國Mrttler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及手術造模 36 只小鼠采用隨機數(shù)字表法分成正常對照（Control）組、OA 手術（OA）組和機械加載治療（OAL）組，每組又分成2周和8周亞組（n=6）。用1.5%異氟烷麻醉小鼠，于右下肢膝關節(jié)內側打開關節(jié)腔，使用手術顯微鏡和顯微外科技術橫斷內側副韌帶（圖1A 箭頭所示），摘除內側半月板（圖1A虛線所示）［8］。Control組只切開關節(jié)內側皮膚。術后使用丁丙諾啡鹽酸鹽鎮(zhèn)痛并使用恩氟沙星抗感染3 d。

1.2.2 機械加載治療 OAL組小鼠經(jīng)1.5%的異氟烷吸入麻醉后，采用定制的機械加載治療儀進行治療。將小鼠膝關節(jié)外側、內側置于加載桿和定子之間，松緊應適宜，太緊容易影響血液供應（圖1B圓圈所示）。在手術后1周，機械加載作用于膝關節(jié)（圖1C）。加載力為1 N，頻率為5 Hz，每天加載5 min，直至小鼠處死。Control組和OA組小鼠僅麻醉后置于加載臺上。

1.2.3 H & E和番紅O/快綠染色 小鼠在手術后2周和8周處死。剝離小鼠后腿，剔除皮膚、軟組織及韌帶，保留完整膝關節(jié)。組織在10%中性福爾馬林中固定72 h 后在14%的EDTA 中脫鈣2 周。然后將組織包埋在石蠟中，沿關節(jié)矢狀面從內向外連續(xù)切成5 μm 的截面。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，進行H & E 和番紅O/快綠染色，脫水透明后樹膠封片，顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)學改變。使用Olympus CCD DP73軟件進行相關數(shù)據(jù)的測量。

1.2.4 軟骨的組織學分析 測量透明軟骨（hyaline cartilage，HC）厚度、全部軟骨（total articular cartilage，TAC）厚度。HC厚度為脛骨軟骨表面到潮線的距離，潮線為一條嗜堿性的線，H & E染色呈藍色。TAC厚度為軟骨表面到軟骨下骨板的距離。分別在脛骨平臺中點、兩個邊緣處、中點與邊緣之間的中點處5個點進行測量，然后取平均值。軟骨國際骨關節(jié)炎研究學會（OARSI）評分［9］。使用相對數(shù)據(jù)比較造模后2周和8 周OA 的病理變化以及機械加載的治療效果，OA組和Control組之間的相對數(shù)據(jù)為（Control-OA）/Control×100%，OAL組和OA組之間的相對數(shù)據(jù)為（OAL-OA）/OA×100%［10］。

1.2.5 滑膜的組織學分析 根據(jù)滑膜襯里細胞厚度和細胞密度進行評分，評價滑膜的病理變化。1～2層細胞計1分，2～4層細胞計2分，10層及以上計3分?；ぴu分從內側脛骨、內側股骨、外側脛骨和外側股骨四個象限獲得，求出四個象限的平均值（范圍0～6 分）［11］。細胞密度分為4 級，正常細胞密度為0 級，輕微增加為1 級，中等增加為2 級，顯著增加為3級。

Fig.1 Schematic diagram of induced osteoarthritis and mechanical loading圖1 誘導OA和機械加載示意圖

1.2.6 骨贅的組織學分析 骨贅評分根據(jù)骨贅的大小和成熟度。骨贅的大小分為4級，0=正常，1=輕度增加，2=中度增加，3=顯著增加。骨贅的成熟度分為5級，0=正常，1=前軟骨損傷，2=顯著的軟骨化，3=骨和軟骨的混合，4=顯著骨化［12］。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較行LSD-t檢驗，使用Person 相關分析檢測滑膜和骨贅與軟骨之間的相關性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 機械加載改善早期OA的病理變化 H & E和番紅O/快綠染色顯示，與Control組相比，OA組小鼠內側脛骨平臺表面不連續(xù)，軟骨層著色變淺，大量基質丟失，軟骨細胞數(shù)目減少，并有少量軟骨細胞出現(xiàn)肥大和凋亡，產(chǎn)生少量的空泡細胞（圖2A、B），滑膜襯里細胞層明顯增厚（圖2C紅線所示），細胞密度明顯增加（圖2C），HC 厚度明顯變薄，TAC 厚度下降，OARSI 和滑膜評分增加（均P＜0.05）。經(jīng)機械加載治療后，OAL組小鼠脛骨平臺軟骨表面連續(xù)，抑制了基質的丟失，軟骨層著色得到改善，軟骨細胞肥大和凋亡明顯減少，透明軟骨厚度和全部關節(jié)軟骨厚度明顯增加，OARSI 評分和滑膜評分顯著下降（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of HC，TAC,OARSI score and synovial score in early osteoarthritis between three groups of mice表1 早期OA HC厚度、TAC厚度、OARSI評分和滑膜評分的比較 （n=6，±s）

Tab.1 Comparison of HC，TAC,OARSI score and synovial score in early osteoarthritis between three groups of mice表1 早期OA HC厚度、TAC厚度、OARSI評分和滑膜評分的比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Control組OA組OAL組F HC厚度（μm）55.74±5.22 43.73±7.12a 51.65±6.98ab 5.296＊TAC厚度（μm）100.87±4.96 91.19±5.65a 99.20±0.99ab 8.358＊＊OARSI評分（分）1.17±0.41 6.17±1.94a 2.00±0.89ab 27.289＊＊滑膜評分（分）1.00±0.63 5.00±1.26a 2.17±1.17ab 22.624＊＊

2.2 機械加載改善晚期OA的病理變化 H & E和番紅O/快綠染色顯示，與Control組相比，造模后8 周OA組小鼠內側脛骨平臺出現(xiàn)嚴重的軟骨缺失，大面積的軟骨著色丟失，軟骨細胞數(shù)目顯著減少，以及更多的空泡細胞（圖3A、B），HC 厚度和TAC 骨厚度顯著下降，OARSI評分顯著升高（P＜0.01），見表2。同時小鼠膝關節(jié)可見骨贅形成（圖3C紅線所示），骨贅形成評分增加（P＜0.01）。經(jīng)機械加載治療后，OAL組小鼠HC 厚度（圖3A），TAC 厚度均得到了恢復，OARSI 評分下降，骨贅形成評分下降（均P＜0.05），見表2。

2.3 滑膜炎癥和骨贅形成與軟骨退化之間的相關性分析 相關性分析表明，早期OA階段滑膜評分與OARSI評分之間呈正相關（r=0.659，P＜0.05）。在晚期OA 中，骨贅形成評分與OARSI 評分之間呈正相關（r=0.711，P＜0.05）。

2.4 OA 早、晚期病變程度及機械加載治療效果的比較 相對數(shù)據(jù)表明，術后8周OA組與Control組之間HC相對厚度、TAC相對厚度較術后2周明顯增加（均P＜0.01），OARSI 相對評分與術后2 周差異無統(tǒng)計學意義，見表3。術后8周OAL組與OA組之間HC相對厚度、TAC 相對厚度較術后2 周明顯增加（均P＜0.01），OARSI相對評分與術后2周差異無統(tǒng)計學意義，見表4。

3 討論

3.1 OA 的研究現(xiàn)狀 OA 是最常見的慢性關節(jié)疾病之一，其發(fā)病率逐年升高。OA是因全身或局部因素造成的關節(jié)不穩(wěn)導致軟骨退化、滑膜炎癥、骨贅形成等病理變化的關節(jié)疾病，已逐漸成為一個重要的社會問題［13］。軟骨在關節(jié)活動中起著重要的作用，關節(jié)不穩(wěn)極易導致軟骨的損傷，從而影響關節(jié)運動。本實驗以創(chuàng)傷性骨關節(jié)炎小鼠為模型，從軟骨改善、抑制滑膜炎癥和骨贅形成等角度，探討機械加載對早、晚期OA小鼠病理變化的改善作用。

3.2 運動康復對OA的改善作用 運動康復訓練是OA的重要治療手段［14］。缺乏運動會導致肌肉乏力、萎縮以及骨質疏松，均會增加患OA 的概率，關節(jié)的運動可以使滑液和軟骨下骨的營養(yǎng)擴散到軟骨，并處理軟骨代謝所產(chǎn)生的廢物，適度運動不僅可以預防OA的發(fā)生發(fā)展，還能明顯減輕疼痛、控制體質量。機械加載作為一種代替人體主動運動的新型物理康復治療方式，以生理性頻率對關節(jié)進行機械刺激從而產(chǎn)生治療效果。相比傳統(tǒng)的運動康復訓練，機械加載能夠更好地幫助不能從事體力活動的患者進行主動物理運動，起到康復的作用。

Tab.2 Comparison of HC，TAC,OARSI score and osteophyte score in lated osteoarthritis between three groups of mice表2 晚期OA HC厚度、TAC厚度、OARSI評分和骨贅評分的比較 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of HC，TAC,OARSI score and osteophyte score in lated osteoarthritis between three groups of mice表2 晚期OA HC厚度、TAC厚度、OARSI評分和骨贅評分的比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與OA組比較，P＜0.05

組別Control組OA組OAL組F HC厚度（μm）44.95±4.57 9.51±6.83a 41.49±8.52ab 49.045＊＊TAC厚度（μm）98.29±7.60 15.61±4.64a 89.59±10.32ab 200.122＊＊OARSI評分（分）2.50±1.05 16.83±4.71a 4.68±1.51ab 42.082＊＊骨贅大小評分（分）0 3.83±0.41a 1.67±0.82ab 79.800＊＊骨贅成熟度評分（分）0 4.17±0.75a 2.00±0.89ab 57.195＊＊

Tab.3 Comparison of pathological changes between early osteoarthritis and late osteoarthritis表3 早、晚期OA病理變化的比較 （n=6，%，±s）

Tab.3 Comparison of pathological changes between early osteoarthritis and late osteoarthritis表3 早、晚期OA病理變化的比較 （n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01

組別2周組8周組t HC相對厚度21.28±12.71 78.57±15.65 6.960＊＊TAC相對厚度9.49±5.68 84.14±4.72 24.768＊＊OARSI相對評分475.00±244.43 731.94±508.05 1.116

Tab.4 Comparison of therapeutic effect of mechanical loading between early osteoarthritis and late osteoarthritis表4 機械加載對早、晚期OA治療效果的比較（n=6，%，±s）

Tab.4 Comparison of therapeutic effect of mechanical loading between early osteoarthritis and late osteoarthritis表4 機械加載對早、晚期OA治療效果的比較（n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01

組別2周組8周組t HC相對厚度20.99±26.63 518.69±369.57 3.290＊＊TAC相對厚度8.85±6.11 536.44±275.37 4.692＊＊OARSI相對評分66.44±15.77 69.71±13.81 0.383

3.3 機械加載對軟骨的保護作用 研究證明，機械加載通過Rac1介導的p38MAPK 信號通路減輕軟骨中基質金屬蛋白酶（MMP）-13 的激活，從而對軟骨產(chǎn)生保護作用［15］。在早期創(chuàng)傷性OA 動物模型中，機械加載治療可以通過抑制破骨細胞系改善骨重塑，抑制創(chuàng)傷部位的炎性反應，保護骨關節(jié)炎的軟骨［8］。在本研究中，通過建立創(chuàng)傷性OA 模型，觀察OA 手術后2 周和8 周的病理變化。結果顯示，機械加載可以增加OA 小鼠透明軟骨和全部關節(jié)軟骨的厚度，降低OARSI 評分。這些發(fā)現(xiàn)均證實了機械加載對軟骨的治療作用。

3.4 機械加載對滑膜炎和骨贅形成的抑制作用 滑膜炎發(fā)生在關節(jié)損傷之后，并且軟骨的退化和滑膜炎之間有著顯著的聯(lián)系［6，17］。骨贅形成是OA晚期的一個特征性病變［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，機械加載能夠降低滑膜評分和骨贅形成評分，表明機械加載對滑膜炎和骨贅形成的治療作用。此外，相關性分析表明，早期OA 滑膜炎與軟骨退化之間呈正相關，晚期OA骨贅形成和軟骨退化之間也呈正相關，這說明機械加載在早期OA時通過抑制滑膜炎癥，而在晚期OA時通過抑制骨贅形成來治療OA。

3.5 機械加載對晚期骨關節(jié)炎的治療效果更好 本研究使用相對數(shù)據(jù)來評估早、晚期OA 病變的不同以及機械加載的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，晚期OA的病變相比早期OA明顯更嚴重，而機械加載對晚期OA的治療效果也更明顯。

3.6 機械加載減輕OA病理進展 機械加載通過提高HC、TAC厚度，降低OARSI評分，對早、晚期OA的軟骨產(chǎn)生保護作用。并且，這種保護作用在OA早期與抑制滑膜炎癥相關，在OA晚期與抑制骨贅形成相關，筆者總結見圖4。

Fig.4 Mechanical loading reduces the pathological progress of osteoarthritis圖4 機械加載減輕OA病理進展

3.7 不足與展望 臨床中治療OA 的藥物作用有限，不良反應較大，效果不確切。因此，找到一種有效的治療手段是目前這一領域所面臨的重大挑戰(zhàn)。本實驗表明，膝關節(jié)機械加載可通過保護軟骨、抑制滑膜炎癥和骨贅形成來對早、晚期OA產(chǎn)生顯著的治療效果。然而，其對OA的具體作用機制還需進一步研究與探討。

Fig.2 Histological staining of medial tibial cartilage and synovium at 2 weeks圖2 2周內側脛骨軟骨以及滑膜的組織學染色

Fig.3 Histological staining of medial tibial cartilage and osteophyte at 8 weeks圖3 8周內側脛骨軟骨以及滑膜的組織學染色