靶向調(diào)控AQP4對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞化療敏感性的調(diào)控作用

郭守俊，謝傳華，黃萍，邱伊連，王碩，班振英，張威

肺癌作為呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，已位于世界腫瘤死亡順位之首［1］，其發(fā)病率正呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)［2］。根據(jù)病理學(xué)特征及臨床特點(diǎn)，肺癌可分為非小細(xì)胞癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞癌（small cell lung cancer，SCLC）兩大類。在我國(guó)，每年約有60 萬(wàn)患者死于肺癌，其中NSCLC 患者所占比例達(dá)到80%以上［3］。很多NSCLC患者在診斷時(shí)已為晚期，喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，需要進(jìn)行化療。目前，對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性成為NSCLC治療失敗的主要原因，大大降低了化療應(yīng)有的效果且嚴(yán)重限制了化療在臨床上的應(yīng)用。因此，基因靶向治療聯(lián)合化療以增加化療敏感性成為NSCLC 治療的研究熱點(diǎn)。

水通道蛋白（Aquaporin，AQPs）是一種與水分子運(yùn)輸相關(guān)的跨膜蛋白，廣泛分布于人體的各種組織中，在跨細(xì)胞和跨上皮水運(yùn)輸中起主要作用。在哺乳動(dòng)物中，已經(jīng)鑒定出13個(gè)水通道蛋白基因家族成員（AQP0～AQP12）［4］。近年來(lái)，大量研究證據(jù)表明，AQPs與癌癥生物學(xué)功能密切相關(guān)，并在二十多種人類癌細(xì)胞中都有表達(dá)［5］，AQPs 的表達(dá)與腫瘤的類型、等級(jí)、增殖、遷移及血管生成均相關(guān)［6-7］，被認(rèn)為是抗癌治療的靶標(biāo)。目前化療藥物發(fā)生耐藥的機(jī)制尚未明確，NSCLC組織中存在AQP4 基因的過(guò)表達(dá)是否與其化療耐藥有關(guān)，靶向調(diào)控AQP4 基因能否增強(qiáng)對(duì)NSCLC細(xì)胞的化療敏感性，國(guó)內(nèi)尚鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬探討AQP4在NSCLC化療敏感性中的作用及其可能的機(jī)制，以評(píng)估AQP4 作為NSCLC治療的新靶點(diǎn)的價(jià)值，為提高NSCLC對(duì)化療藥物的敏感性提供更多實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備 人NSCLC A549 細(xì)胞以及順鉑耐藥株A549/DDP購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。RPMI 1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclon公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo 公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京碧波生物有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自日本 TaKaRa 公司；PCR 引物以及 siRNA 為廣州瑞博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。兔抗人AQP4、P53、Bcl-2、β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司。

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Forma公司；熒光倒置相差顯微鏡和照相系購(gòu)于統(tǒng)日本Olympus 公司；FACS Aria 流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD 公司；低溫高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Heraeus 公司；凝膠電泳儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司；紫外線分光光度儀購(gòu)于德國(guó)Ependorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 肺癌細(xì)胞A549和A549/DDP使用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，隔天更換培養(yǎng)液。首先將細(xì)胞分為 A549組和 A549/DDP組，檢測(cè) AQP4 在 2 種不同細(xì)胞中的表達(dá)情況。設(shè)計(jì)靶向AQP4的siRNA，轉(zhuǎn)染到A549/DDP細(xì)胞中，依據(jù)轉(zhuǎn)染物的不同分為轉(zhuǎn)染組（siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-NC組）和空白對(duì)照組（A549/DDP組）。篩選出最優(yōu)的siRNA后進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

設(shè)計(jì)合成的 siRNA 序列：AQP4 siRNA-1 為 5'-GCTCAATAGCTTTAGCAATTG-3'，AQP4 siRNA-2 為 5' -GGUCUCCUGGUAGA GUUGAUAAUCA-3'，對(duì)照序列siRNA-NC 為 5'-GGUCCGUUGGAGAUUAGAUAUCUCA-3'。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照LipofectamineTM2000 試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法分別將siRNA 或siRNA-NC轉(zhuǎn)染入A549/DDP細(xì)胞，用不含siRNA只加入脂質(zhì)體的A549/DDP細(xì)胞作為空白對(duì)照（A549/DDP組）。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中AQP4 mRNA的表達(dá) 收集細(xì)胞，使用Trizol法抽提各組細(xì)胞mRNA。分光光度計(jì)分析A260/A280計(jì)算RNA 總濃度。采用TaKaRa Prime ScriptTMreagent Kit 反錄試劑盒將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；以此cDNA 為模板采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（7500 Fast）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：SYBR premix Ex Taq Ⅱ10 μL、cDNA 2 μL、引物1μL、焦碳酸二乙酯（Diethy pyrocarbonate，DEPC）處理水7μL。引物序列為AQP4上游引物：5'-CATGGAGGTGGAGGACAA-3'；AQP4下游引物：5'-TGGGTGGAAGGAAATCTG-3'，長(zhǎng)度206 bp。GAPDH上游引物：5'-AAATCCCATCACCATCTTCCAG-3'；GAPDH下游引物：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAAAGTTG-3'，長(zhǎng)度310 bp。qRT-PCR 的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性40 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以GAPDH的拷貝數(shù)作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 后，依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，提取各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA（bicinchoninic acid）法進(jìn)行蛋白定量。制備電泳凝膠，每孔加50μg 蛋白，采用SDS-PAGE 電泳將蛋白進(jìn)行分離。采用半干法電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉2 h，加入一抗（AQP4 1∶500，P53 1∶1 000，Bcl-2 1∶1 000，β-actin 1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST溶液漂洗PVDF膜3次，每次5 min。用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育 1 h。用TBST 溶液漂洗PVDF 膜3次，每次5 min。采用ECL AdvanceTM試劑盒顯色，X光片曝光成像。β-actin作為內(nèi)參基因。

1.2.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力和藥物敏感性 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前24 h 以1 500/孔接種在96 孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染siRNA，每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照孔。在轉(zhuǎn)染后 24、48、72 h 后吸走培養(yǎng)基，PBS 洗后加入CCK-8反應(yīng)液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定450 mm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD）值。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感性變化：細(xì)胞接種到96孔板上，轉(zhuǎn)染siRNA 24 h 后更換含有順鉑（DDP）的完全培養(yǎng)基，DDP 的濃度分別為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算細(xì)胞存活率及各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡能力 將轉(zhuǎn)染后48 h各組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清收集細(xì)胞，PBS 重懸后取2×105個(gè)細(xì)胞。加5μL Annexin VFITC到細(xì)胞懸液中，再加5μL碘化丙啶，混勻后避光孵育15 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，在30 min 中檢測(cè)完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，2組間比較采用t檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 A549/DDP細(xì)胞與A549細(xì)胞中 AQP4 的表達(dá) qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞珠A549/DDP 中AQP4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（1.747±0.097），親本細(xì)胞株 A549 中 AQP4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為（0.975±0.083），2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，t=14.788，P＜0.01）。Western blot 分析結(jié)果顯示，A549/DDP 細(xì)胞中AQP4 蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.797±0.070），顯著高于A549 細(xì)胞中AQP4 蛋白表達(dá)量（0.545±0.099），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，t=5.085，P＜0.01）。見(jiàn)圖1A。通過(guò)將AQP4 siRNA 轉(zhuǎn)染到A549/DDP細(xì)胞中后，siRNA-1組和siRNA-2組AQP4 mRNA 和蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著下降，見(jiàn)圖1B、表1，這提示AQP4 siRNA 能夠使AQP4的表達(dá)沉默。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)siRNA-2組AQP4 mRNA 和蛋白表達(dá)量低于siRNA-1組（P＜0.01），因此選擇使用siRNA-2作為后續(xù)研究的干擾序列。

Fig.1 Western blot analysis of AQP4 protein expressions圖1 Western blot 檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá)

2.2 AQP4 表達(dá)沉默后對(duì)A549/DDP 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 將AQP4 siRNA 轉(zhuǎn)染到A549/DDP 細(xì)胞后，siRNA-2組細(xì)胞增殖能力較A549/DDP組和siRNA-NC組均顯著降低，在 48 h、72 h 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 AQP4 siRNA 48 h 后，siRNA-2組細(xì)胞凋亡率為（12.24±1.55）%，顯著高于A549/DDP組（3.01±0.81）%和siRNA-NC組（3.31±0.98）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=123.145，P＜0.01），見(jiàn)圖2。

Tab.1 The effect of siRNA transfection on the expression level of AQP4 in A549/DDP cells表1 siRNA轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后對(duì)AQP4表達(dá)的影響（n=6，±s）

Tab.1 The effect of siRNA transfection on the expression level of AQP4 in A549/DDP cells表1 siRNA轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后對(duì)AQP4表達(dá)的影響（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a 與 A549/DDP組比較，b 與 siRNA-NC組比較，c 與siRNA-1組比較，P＜0.05

組別mRNA 蛋白A549/DDP組siRNA-NC組siRNA-1組siRNA-2組F 0.985±0.047 0.975±0.083 0.425±0.051ab 0.385±0.037abc 201.505＊＊0.600±0.100 0.608±0.107 0.405±0.061ab 0.330±0.064abc 16.012＊＊

Tab.2 The effect of siRNA transfection on cell proliferation of A549/DDP cells表2 siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖能力的影響（n=6，OD，±s）

Tab.2 The effect of siRNA transfection on cell proliferation of A549/DDP cells表2 siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖能力的影響（n=6，OD，±s）

＊＊P＜0.01；a與A549/DDP組比較，b與siRNA-NC組比較，P＜0.01

組別A549/DDP組siRNA-NC組siRNA-2組F 24 h 0.40±0.07 0.39±0.06 0.34±0.03 1.855 48 h 0.74±0.10 0.71±0.13 0.47±0.07ab 12.842＊＊72 h 1.26±0.11 1.22±0.12 0.64±0.05ab 72.217＊＊

2.3 AQP4 表達(dá)沉默后A549/DDP 細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性 將AQP4 siRNA 轉(zhuǎn)染到A549/DDP 細(xì)胞后，siRNA-2組 IC50值為（28.65±6.51）μmol/L，與A549/DDP組的（54.30±5.01）μmol/L和siRNA-NC組的（50.35±7.75）μmol/L 相比明顯降低，細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性明顯增加，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=26.918，P＜0.01）。

2.4 AQP4 表達(dá)沉默對(duì)凋亡蛋白的調(diào)節(jié)作用 使AQP4基因表達(dá)沉默后，siRNA-2組細(xì)胞中P53蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.945±0.091），較 A549/DDP組（0.478±0.091）和siRNA-NC組（0.465±0.078）相比明顯升高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=59.736，P＜0.01）。siRNA-2組細(xì)胞中Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.293±0.093），較A549/DDP組（0.527±0.064）和siRNA-NC組（0.545±0.047）相比明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=23.745，P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

3 討論

AQPs促進(jìn)水分子跨上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，并在人體呼吸道的正常生理和相關(guān)疾病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在人的肺部和氣道中至少表達(dá)4種AQPs：微血管內(nèi)皮中的AQP1，氣道上皮中的AQP3 和AQP4，以及Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞、黏膜下腺泡和氣道上皮細(xì)胞中的AQP5，這幾種AQPs 與人體的肺水轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)［8-9］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，AQPs 在許多不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞中得以表達(dá)并增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移潛能［10-12］，提示抑制AQPs表達(dá)可作為抑制腫瘤擴(kuò)散的可能策略［13］。

Fig.2 The effect of siRNA transfection on apoptosis of A549/DDP cells detected by AnnexinV-FITC/PI double marker flow cytometry圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡能力的影響

Fig.3 The effect of AQP4 siRNA transfection on expressions of P53 and Bcl-2 in A549/DDP cells圖3 AQP4轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后對(duì)P53和Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

肺癌是目前全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的高發(fā)病率及高死亡率的惡性腫瘤，NSCLC是最常見(jiàn)的肺癌類型，由于其早期診斷較為困難，大多數(shù)病例在明確診斷時(shí)已經(jīng)是中晚期，從而錯(cuò)失最佳手術(shù)治療的適應(yīng)證。雖然含順鉑的聯(lián)合化療法在一定程度上改善了NSCLC晚期的治療情況，但對(duì)化療藥物產(chǎn)生固有耐藥或獲得性耐藥的幾率較高，給NSCLC的臨床治療造成困難。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的機(jī)制并不清楚。已有研究表明，細(xì)胞的水通透性影響順鉑藥物的敏感性，AQP1、AQP3和AQP8的表達(dá)與卵巢癌的化療敏感性密切相關(guān)［14］。石曉明等［15］及楊明利等［16］的研究結(jié)果顯示，沉默AQP5及過(guò)表達(dá)AQP8均可以提高結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)DDP 的敏感性。AQP4已被證實(shí)在NSCLC組織中存在過(guò)表達(dá)，并對(duì)NSCLC細(xì)胞的增殖遷移產(chǎn)生重要影響。本研究則致力于探索AQP4對(duì)NSCLC細(xì)胞化療敏感性的影響，結(jié)果顯示，在耐藥株A549/DDP 中AQP4 呈高表達(dá)，因此筆者推斷在NSCLC 細(xì)胞中AQP4的表達(dá)異常與化療藥物的敏感性存在一定的相關(guān)性，通過(guò)對(duì)AQP4 的表達(dá)調(diào)控有可能提高NSCLC細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。

本研究設(shè)計(jì)了靶向AQP4 的siRNA，通過(guò)siRNA使A549/DDP 細(xì)胞中AQP4 表達(dá)沉默，發(fā)現(xiàn)A549/DDP細(xì)胞的增殖能力降低，凋亡率升高，同時(shí)細(xì)胞對(duì)DDP 的敏感性提高，這提示通過(guò)對(duì)AQP4 表達(dá)靶向調(diào)控，可對(duì)NSCLC 的細(xì)胞增殖、凋亡以及耐藥性產(chǎn)生影響。研究還發(fā)現(xiàn)APQ4表達(dá)沉默后，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，P53 蛋白表達(dá)升高，提示AQP4 可能通過(guò)對(duì)P53和Bcl-2的調(diào)控從而對(duì)細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響。研究表明Bcl-2 蛋白能夠通過(guò)線粒體介導(dǎo)途徑導(dǎo)致起細(xì)胞凋亡［17］，P53作為Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控因子，也參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程［18］。因此AQP4 表達(dá)沉默后可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡途徑的激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死，從而對(duì)NSCLC細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生影響。

綜合過(guò)去多項(xiàng)研究，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制是多方面的：藥物在細(xì)胞內(nèi)外的異常轉(zhuǎn)運(yùn)；藥物活性的改變；對(duì)DNA 損傷的耐受性或修復(fù)能力的增加等。AQPs 在調(diào)節(jié)細(xì)胞水通透性中起重要作用，是細(xì)胞對(duì)外界滲透壓做出改變的主要途徑，研究證實(shí)，細(xì)胞外高滲透壓環(huán)境能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)AQPs表達(dá)改變［19］。也有研究報(bào)道，AQPs表達(dá)增加能夠使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生藥物抗性［20］，這些證據(jù)都在一定程度上支持了本次的研究結(jié)果。AQP4 在參與肺部水分子運(yùn)輸過(guò)程中，可能會(huì)在在藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞通透性改變等方面對(duì)NSCLC 細(xì)胞的化療敏感性產(chǎn)生影響，其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上，通過(guò)靶向調(diào)控AQP4，抑制A549 細(xì)胞中AQP4的表達(dá)可以有效增加A549細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，對(duì)AQP4 與化療敏感性的深入研究將為NSCLC 的化學(xué)治療提供新的切入點(diǎn)，為靶向治療與化療聯(lián)合的腫瘤治療方法提供一定的理論基礎(chǔ)，AQP4可能成為NSCLC治療中新的潛在靶點(diǎn)。