慢病毒介導(dǎo)CK18基因沉默對人乳腺癌BT549細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響

張青，黃錢，張春燕，劉曉燕，曾凡才，甘淋△

乳腺癌（breast cancer，BC）是女性最常見的惡性腫瘤，是全球女性癌癥死亡的第二大病因［1］。研究顯示，2018年美國BC 患者發(fā)病率和死亡率較以往仍持續(xù)升高［2］。目前，臨床乳腺癌診療標(biāo)志物有雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、癌胚抗原（CEA）、糖類抗原153（CA153）、細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA-21）和藥物作用靶點人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）等，這些生物標(biāo)志物對于指導(dǎo)乳腺癌的臨床診療過程能起到一定的作用，聯(lián)合多項檢測的診斷性能優(yōu)于單項標(biāo)志物檢測，但其敏感性和特異性均不高，所以尋找和篩查乳腺癌早期的分子診斷標(biāo)志物和藥物作用靶點對提高BC早期篩查率和治療效果尤為重要。CK18是細(xì)胞角蛋白的一種亞型，參與細(xì)胞的形成、增殖、凋亡、運動等過程［3］。研究顯示，CK18 在肺癌、膀胱癌、肝癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，提示CK18 可能參與了腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過程［4］。本研究旨在探討CK18基因表達(dá)降低對人乳腺癌BT549細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及腫瘤細(xì)胞侵襲運動等功能的影響，分析其潛在的分子作用機制，以期為乳腺癌個體化治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 人乳腺癌BT549 細(xì)胞由西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室提供，胎牛血清（FBS）購自Bovogen公司，RPMI-1640購自賽默飛世爾儀器有限公司，胰酶、細(xì)胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，CK18 一抗購自Bioworld 生物科技有限公司，山羊抗兔二抗購自CST 公司，BD 細(xì)胞凋亡試劑盒［Phycoerythrin（PE）和7-Amino-Actinomycin（7-AAD）］、CCK-8試劑盒購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司，Transwell 小室購自Costar 公司，聚凝胺（Polybrene）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌BT549 在含10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.3 慢病毒載體構(gòu)建及鑒定 使用GeneCopoeraTM公司合成的人CK18基因的重組慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行實驗。其干擾靶點序列：CK18shRNA-21：5'-GACCATGCAAAGCCTGAACGA-3'；CK18shRNA-22：5'-GCAAAATCCGGGAGCACTTGG-3'；CK18shRNA-23：5'-GCTCCGCAAGGTCATTGATGA -3'；CK18shRNA-24：5'-CCAAGATCATGGCAGACATCC -3'；CK18shRNA-con：5'-GCTTCGCGCCGTAGTCTTA-3'。

1.4 質(zhì)粒提取和病毒包裝 將成熟質(zhì)粒轉(zhuǎn)化200μL新鮮制備的DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書（北京天根生化科技有限公司）提取質(zhì)粒。根據(jù)Lenti-PacTMHIV 表達(dá)包裝試劑盒說明書進(jìn)行慢病毒包裝及病毒滴度測定。

1.5 BT549感染及分組 胰酶消化對數(shù)生長期BT549細(xì)胞，按3×105個/孔接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合度為30%～50%時，分別加入CK18shRNA-con、CK18shRNA-21、CK18shRNA-22、CK18shRNA-23、CK18shRNA-24 的病毒進(jìn)行感染，24 h后更換全培養(yǎng)基。感染48 h后，使用終濃度為5 mg/L的嘌呤霉素進(jìn)行篩選。以未轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞BT549 為空白對照（Wt）組，以轉(zhuǎn)染空載體為陰性對照（sh-Con）組，以轉(zhuǎn)染CK-18慢病毒載體為CK18-shRNA組，分別記為CK18-sh21、CK18-sh22、CK18-sh23 及CK18-sh24組，以CK18靶向優(yōu)化shRNA干擾序列最優(yōu)者為后續(xù)實驗組。

1.6 Western blot 檢測CK18、E-cadherin、vimentin 和 GAPDH的表達(dá) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，抽提蛋白。按40μg 蛋白含量進(jìn)行上樣，10%SDS-PAGE 蛋白分離后，PVDF 膜 100 V 轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，CK18 抗體（1∶500）、E-cadherin（1∶500）、vimentin（1∶500）和 GAPDH（1∶10 000）4 ℃搖床過夜；洗膜3次后加入二抗孵育1 h；熒光顯影，采集蛋白條帶圖像后采用IPP 6.0軟件進(jìn)行計算分析。

1.7 CCK-8 實驗檢測細(xì)胞增殖情況 按試劑盒操作說明書，將細(xì)胞按5×103個/孔均勻接種于96 孔板，分別設(shè)3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 時，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育1 h，測定450 nm波長處光密度（OD）值。

1.8 平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖情況和獨立生存能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞按200 個/孔接種于6孔板中，14 d后去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌，顯微鏡觀察（×40）、計數(shù)。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 按試劑盒說明書，待Wt組、sh-Con組和CK18-shRNA組細(xì)胞均生長至對數(shù)生長期，進(jìn)行消化，1 200 r/min 離心10 min 收集細(xì)胞，用流式緩沖液重懸后，分別加入5μL PE Annexin V和5μL 7-AAD混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀雙染檢測細(xì)胞凋亡率變化。

1.10 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 按試劑盒操作說明書，將處于對數(shù)生長期的Wt組、sh-Con組和CK18-shRNA組細(xì)胞消化并收集，-20 ℃預(yù)冷12 h，70%乙醇-20 ℃固定4 h，洗滌后加入500μL碘化丙啶染色液，重懸細(xì)胞，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀上機檢測。

1.11 劃痕實驗 將BT549 細(xì)胞接種于6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞貼壁面積達(dá)到80%時，用槍尖在孔板中央進(jìn)行劃痕處理，確保劃痕處無多余細(xì)胞，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。光鏡拍照記錄劃痕0 h、24 h和48 h的圖像，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分別測量 0 h、48 h 劃痕寬度 D0h和 D48h，計算 Wt組、shCon組和CK18-shRNA組細(xì)胞的遷移率。遷移率=（D0h-D48h）/D0h×100%。

1.12 Transwell細(xì)胞運動和侵襲實驗 Transwell細(xì)胞運動實驗按文獻(xiàn)［5］進(jìn)行，取2×104個細(xì)胞/孔加入Transwell上室，下室中加600μL的含20%FBS的培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)。12 h后去除上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.1%的結(jié)晶紫染色，晾干后拍照并計數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗：除Transwell 上室需預(yù)先用Matrigel 基質(zhì)膠進(jìn)行包被后方可加入細(xì)胞，余步驟同運動實驗。

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CK18干擾人乳腺癌BT-549細(xì)胞株的建立和鑒定 Wt組、sh-Con組、CK18-sh21組、CK18-sh22組、CK18-sh23組、CK18-sh24組的 CK18/GADPH 相對表達(dá)水平分別為（0.149±0.020）、（0.157±0.013）、（0.056±0.007）、（0.157±0.013）、（0.040±0.009）和（0.046±0.010），其中CK18-sh21組、CK18-sh23組、CK18-sh24組與 Wt組、shCon組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=66.186，P＜0.05），CK18-sh23組干擾效果最佳，相對于shCon組抑制率可達(dá)73%，而Wt組、shCon組和CK18-sh22組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。后續(xù)實驗均選擇CK18-sh23 實驗組細(xì)胞進(jìn)行操作。

Fig.1 Western blot results of CK18 expressions in six groups圖1 Western blot檢測各組細(xì)胞中CK18蛋白的表達(dá)

2.2CK18沉默對BT549 細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測結(jié)果：CK18-sh23組在24、48、72 h時OD值均小于Wt組和sh-Con組（P＜0.05），而Wt 和sh-Con組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。平板克隆形成實驗結(jié)果：Wt組、sh-Con組和CK18-sh23組的細(xì)胞克隆形成數(shù)量分別為（115.000±5.000）個、（107.000±7.550）個和（78.333±7.638）個（n=3，F(xiàn)=23.838，P＜0.05），其中，CK18-sh23組細(xì)胞克隆形成數(shù)量較Wt組、sh-Con組明顯減少（P＜0.05），而Wt組和sh-Con組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 穩(wěn)定干擾CK18基因后對BT549 細(xì)胞凋亡和周期的影響CK18-sh23組細(xì)胞凋亡率及G2/M 期比例均高于 Wt組和 sh-Con組（P＜0.05），而 Wt組與sh-Con組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Tab.1 Effects of lentivirus infection on proliferation of BT549 cells by CCK-8 assay表1 CCK-8法檢測感染慢病毒后BT549細(xì)胞增殖能力影響（n=3，OD值，±s）

Tab.1 Effects of lentivirus infection on proliferation of BT549 cells by CCK-8 assay表1 CCK-8法檢測感染慢病毒后BT549細(xì)胞增殖能力影響（n=3，OD值，±s）

＊＊P＜0.01；a與Wt組比較，b與sh-Con組比較，均P＜0.05

組別Wt組sh-Con組CK18-sh23組F 24 h 0.599±0.044 0.610±0.046 0.438±0.049ab 13.000＊＊48 h 0.867±0.104 0.850±0.050 0.601±0.061ab 11.625＊＊72 h 1.227±0.086 1.138±0.059 0.853±0.072ab 21.331＊＊

Tab.2 Effects of CK18 silencing on cell apoptosis and cell cycle in BT549 cells表2 CK18沉默對BT549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響（n=3，±s）

Tab.2 Effects of CK18 silencing on cell apoptosis and cell cycle in BT549 cells表2 CK18沉默對BT549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與Wt組比較，b與sh-Con組比較，均P＜0.05

組別Wt組sh-Con組CK18-sh23組F凋亡率（%）6.500±0.500 7.300±0.819 14.767±1.168ab 81.939＊＊G2/M期（%）14.333±2.843 15.833±1.012 23.233±4.908ab 6.155＊

2.4 穩(wěn)定干擾CK18后BT549 細(xì)胞遷移能力的變化 與Wt組和sh-Con組細(xì)胞比較，CK18-sh23組細(xì)胞的遷移率顯著下降（P＜0.05），而Wt組和sh-Con組細(xì)胞遷移率無明顯差異；Transwell 實驗亦顯示，CK18-sh23組細(xì)胞運動和侵襲能力顯著低于Wt組和sh-Con組（P＜0.05），見圖2、3和表3。

Tab.3 Changes of migration and invasion ability of BT549 cells after transfection表3 感染后BT549細(xì)胞運動和侵襲能力的變化（n=3，±s）

Tab.3 Changes of migration and invasion ability of BT549 cells after transfection表3 感染后BT549細(xì)胞運動和侵襲能力的變化（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與Wt組比較，b與sh-Con組比較，均P＜0.05

組別Wt組sh-Con組CK18-sh23組F細(xì)胞運動（個）63.667±5.132 62.667±3.786 43.333±1.528ab 27.496＊＊細(xì)胞侵襲（個）54.333±4.726 50.333±3.512 30.333±0.577ab 42.514＊＊細(xì)胞遷移率（%）51.35±2.90 50.82±2.46 26.09±2.00ab 101.576＊＊

2.5 Western blot檢測各組E-cadherin和vimentin結(jié)果 與 sh-Con組和 Wt組比較，CK18-sh23組 E-cadherin 蛋白相對表達(dá)水平升高、vimentin 蛋白相對表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；sh-Con組和Wt組間2種蛋白相對表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4、表4。

3 討論

CK18 在食管癌、肝癌和胃癌等中表達(dá)上調(diào)，提示其參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，且與這些腫瘤的預(yù)后有關(guān)［6-8］。在胃癌中，CK18 的高表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切有關(guān)，并且預(yù)示著更低的總體生存率［8］。然而，另有研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中CK18表達(dá)顯著下調(diào)，可促進(jìn)腫瘤的侵襲，認(rèn)為其與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)［9］。故CK18 在不同癌癥中發(fā)揮的作用仍未明確。人乳腺癌BT549 為三陰性乳腺癌細(xì)胞，具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，且此細(xì)胞株中CK18 高表達(dá)，故選擇此細(xì)胞系進(jìn)行CK18基因敲除實驗。

Fig.4 Western blot results of E-cadherin and vimentin expression in breast cancer BT549 cells after CK18 silencing圖4 Western blot檢測CK18沉默對乳腺癌BT549細(xì)胞中E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)影響

Tab.4 Relative expression of target protein after CK18 silencing表4 沉默CK18表達(dá)后目的蛋白的相對表達(dá)量（n=3，±s）

Tab.4 Relative expression of target protein after CK18 silencing表4 沉默CK18表達(dá)后目的蛋白的相對表達(dá)量（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與Wt組比較，b與sh-Con組比較，均P＜0.05

組別Wt組sh-Con組CK18-sh23組F E-cadherin 0.039±0.009 0.036±0.010 0.071±0.013ab 9.435＊vimentin 0.860±0.044 0.840±0.036 0.460±0.050ab 80.211＊＊

本實驗構(gòu)建了靶向CK18基因慢病毒載體，并通過其病毒顆粒感染BT549 細(xì)胞，且相對于sh-Con組，CK18-sh23組CK18表達(dá)抑制率可達(dá) 73%，篩選出了CK18表達(dá)沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。本研究CCK-8 法顯示，CK18-sh23組在 24 h、48 h、72 h 時OD 值均小于Wt組和sh-Con組，平板克隆形成實驗示CK18-sh23組細(xì)胞克隆形成數(shù)量較Wt組、sh-Con組明顯減少，提示沉默CK18基因的表達(dá)，可時間依賴性地抑制BT549 細(xì)胞的生長增殖，這與師銳贊等［10］認(rèn)為CK18表達(dá)下調(diào)可抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的結(jié)果相一致。同時本研究中CK18-sh23組的凋亡率及G2/M 期比例明顯高于Wt組和sh-Con組，與乳腺癌［11］、肝癌［12-13］中CK18研究結(jié)果一致，即CK18 的表達(dá)能延遲肝癌細(xì)胞的凋亡，沉默CK18能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡和影響肝癌細(xì)胞的周期進(jìn)展。

CK18不僅參與維持細(xì)胞的完整性和生長過程，還在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，敲低人肺癌細(xì)胞中CK18基因表達(dá)，可抑制細(xì)胞的運動和遷移能力［5］。本實驗也證實，較sh-Con組，CK18-sh23組穿越 Transwell 小室和 Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明沉默CK18基因表達(dá)可抑制BT549細(xì)胞的運動和侵襲能力，提示CK18可能在乳腺癌BT549 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定的作用。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤微環(huán)境調(diào)控癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的最重要的機制［14］。其中上皮標(biāo)志物E-cadherin 和間質(zhì)性標(biāo)志物vimentin 是EMT 重要的分子標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺上皮細(xì)胞中CK18可促進(jìn)轉(zhuǎn)移生長因子β1（TGF-β1）介導(dǎo)的smad2/3 的磷酸化，上調(diào)snail 和slug 的表達(dá)，促進(jìn)EMT 的發(fā)生［15］。然而，另有研究發(fā)現(xiàn)，在人肺癌 H1975 和Calu-3細(xì)胞中CK18呈低表達(dá)，雖然其會降低腫瘤細(xì)胞的遷移，但不影響E-cadherin 和vimentin 的表達(dá)，提示CK18 沒有經(jīng)過EMT 調(diào)控肺癌細(xì)胞的侵襲過程［5］。本實驗結(jié)果顯示，較sh-Con組，CK18-sh23組中E-cadherin 表達(dá)上調(diào)，vimentin 表達(dá)下調(diào)，提示CK18 可能通過EMT 參與了乳腺癌BT549 細(xì)胞的侵襲運動過程，但具體的分子機制仍有待深入研究。

綜上所述，CK18 表達(dá)在調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期和侵襲過程中起著重要的作用；CK18 通過EMT 參與了BT549 細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本課題不足之處在于未對CK18參與EMT的一些信號通路進(jìn)行研究，后續(xù)研究將重點關(guān)注CK18可能通過影響哪些下游因子的表達(dá)影響乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，以期為乳腺癌個體化治療提供更多依據(jù)。

Fig.2 Effects of CK18 silencing on motility ability in breast cancer BT549 cells(×40)圖2 沉默CK18基因表達(dá)對乳腺癌BT549細(xì)胞遷移能力的影響（×40）

Fig.3 Effects of CK18 silencing on invasion ability in BT549 cells(crystal violet staining,×200)圖3 沉默CK18基因表達(dá)對乳腺癌BT549細(xì)胞運動能力和侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200）