T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對黑色素瘤順鉑耐藥株的作用研究

陸海濤，李雪飛，劉利君，何磊，段昕所

黑色素瘤病因不明，已成為發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤，具有高度的轉(zhuǎn)移性和侵襲力，且預(yù)后差［1-2］。順鉑是治療多種腫瘤的一線用藥，但腫瘤細胞對順鉑的耐藥性可明顯削弱其療效［3］。腫瘤的基因治療越來越受到關(guān)注，已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點。有研究表明，T-鈣黏蛋白可抑制黑色素瘤的增殖和侵襲力，促進腫瘤細胞的凋亡［4-5］。另有研究認為，上調(diào)腫瘤的某些鈣黏蛋白分子表達可提高腫瘤細胞對細胞毒性藥物的敏感性［6］。T-鈣黏蛋白能否逆轉(zhuǎn)耐藥黑色素瘤細胞對順鉑的敏感性，尚鮮見相關(guān)報道。本研究擬建立對順鉑耐藥的黑色素瘤細胞株（CDDP-R B16F10），并轉(zhuǎn)染T-鈣黏蛋白基因獲得穩(wěn)定表達T-鈣黏蛋白的黑色素瘤順鉑耐藥株，觀察T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對腫瘤細胞遷移及侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器 黑色素瘤B16F10細胞株由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部提供。Transwell 侵襲實驗用細胞外基質(zhì)膠（extracellular matrix gel）和順鉑購自Sigma 公司。T-鈣黏蛋白一抗購自Santa Cruz公司。T-鈣黏蛋白二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 pEGFP-N1、脂質(zhì)體2000（LipofectamineTM2000）和 TRIzol 購自 Invitrogen 公司。AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq 酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司。孔徑為8μm的transwell小室購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 黑色素瘤B16F10順鉑耐藥細胞株（CDDP-R B16F10）的建立及增殖能力測定 （1）細胞培養(yǎng)。B16F10 細胞株在37 ℃、5%CO2及10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基內(nèi)生長，采用大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法誘導(dǎo)。取對數(shù)生長期B16F10 細胞，1 mg/L 順鉑作用24 h 后換為正常RPMI-1640 培養(yǎng)基，當(dāng)細胞恢復(fù)生長后再加藥，如此反復(fù)誘導(dǎo)、換液，最終使B16F10細胞能夠在含有1 mg/L順鉑的培養(yǎng)基中正常生長。再依次加入含有2、4 mg/L 順鉑的RPMI-1640培養(yǎng)基，重復(fù)上述步驟，最終使得B16F10細胞能夠在含有 4 mg/L 順鉑的 RPMI-1640 培養(yǎng)基中正常生長。（2）MTT 法檢測CDDP-R B16F10 的增殖能力。取前述培養(yǎng)后細胞，分為CDDP-R B16F10細胞組和B16F10組（未發(fā)生順鉑耐藥）。細胞以2×105/mL 的密度接種于96 孔板，每孔加入100 μL 細胞懸液。采用MTT 法，每日各組測定5 個孔的光密度（OD）值，連續(xù)4 d后繪制腫瘤細胞的生長曲線。

1.2.2 T-鈣黏蛋白基因轉(zhuǎn)染CDDP-R B16F10及篩選 取對數(shù)生長期的細胞，應(yīng)用LipofectamineTM2000 將pEGFP-N1 空載體及本實驗室構(gòu)建的T-鈣黏蛋白真核表達載體pEGFPN1-T-cadherin 轉(zhuǎn)染 CDDP-R B16F10 細胞［7］。pEGFP-N1 質(zhì)粒攜帶G418抗性基因，上述細胞培養(yǎng)48 h后加入G418，使其藥物濃度為800 mg/L，進行篩選，2周后獲得可穩(wěn)定表達T-鈣黏蛋白的CDDP-R B16F10細胞。采用有限稀釋法挑選轉(zhuǎn)染成功的單個細胞，反復(fù)篩選和傳代，挑選在抗性培養(yǎng)基中生長良好的細胞。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測轉(zhuǎn)染后T-鈣黏蛋白mRNA 的表達 按照Trizol 試劑說明書抽提細胞總RNA，檢測RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系為50 μL：5 μL 10×Reaction Buffer，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，2 μL 模板 cDNA，4 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.5μL Taq Plus，36.5 μL雙蒸水。引物序列見表1。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 45 s，34 個循環(huán)；最后 72 ℃ 5 min。PCR 的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠），70 V，電泳2 h，凝膠成像系統(tǒng)照相，進行分析。

Tab.1 Primer sequence of each purpose gene表1 各自的基因引物序列

1.2.4 免疫組化SP法檢測轉(zhuǎn)染后T-鈣黏蛋白的表達 取對數(shù)生長期的腫瘤細胞，胰酶消化，稀釋成濃度1.5×105/mL。將細胞懸液滴加至載玻片，每孔0.2 mL，放置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，甲醇固定。3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，胎牛血清封閉非特異性抗原，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃1 h，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來水沖水返藍，中性樹脂封片，拍照觀察T-鈣黏蛋白的表達情況，在細胞質(zhì)、細胞核、細胞膜出現(xiàn)棕黃色視為T-鈣黏蛋白陽性。

1.2.5 Wound-healing 劃痕實驗檢測腫瘤細胞的遷移情況 腫瘤細胞接種到6 孔板，每孔的培養(yǎng)體積為3 mL，細胞密度約5×105/mL，5%CO2、37 ℃、飽和濕度條件下孵育12 h。用200μL 移液器在已經(jīng)鋪滿的單層細胞上劃痕，PBS 清洗3次，洗掉漂浮的細胞，實驗分為6組。（1）空白對照組（CDDPR B16F10細胞）。（2）pEGFP-N1組，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體。（3）pEGFP-N1-T-cadherin組，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-T-cadherin。（4）順鉑組，培養(yǎng)基加入順鉑，終濃度4 mg/L。（5）pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1 空載體，并加入順鉑，終濃度4 mg/L。（6）pEGFP-N1-T-cadherin 聯(lián)合順鉑組，轉(zhuǎn)染pEGFPN1-T-cadherin，并加入順鉑，終濃度4 mg/L。在培養(yǎng)0 h、24 h拍照，計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell 侵襲實驗檢測腫瘤細胞侵襲力 實驗分組同1.2.5。參照文獻［8］，調(diào)整細胞密度至2×105/mL，取200 μL加入上室，空白對照組、pEGFP-N1組和pEGFP-N1-T-cadherin組的上室為無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基，順鉑組、pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組和pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組上室為含4 mg/L順鉑的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基。6組的下室均加入600μL 含30%血清的培養(yǎng)基。24 h 后取出小室，PBS 洗2遍，棉簽擦去ECM 膠和上室內(nèi)的細胞，100%甲醇固定15 min，蘇木素染色，顯微鏡下觀察，隨機抽取5 個視野計數(shù)，取每組的平均值表示腫瘤細胞的穿膜細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，析因分析確定各因素的單獨效應(yīng)及有無交互作用。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑色素瘤順鉑耐藥細胞株（CDDP-R B16F10）培養(yǎng)結(jié)果 成功建立黑色素瘤順鉑耐藥細胞株。MTT法結(jié)果顯示，在不含有順鉑的培養(yǎng)液中，CDDPR B16F10組和B16F10組的生長趨勢相近，見圖1。

Fig.1 Proliferative ability of CDDP-R B16F10圖1 CDDP-R B16F10的增殖能力

2.2 細胞轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染24 h 后，pEGFP-N1-T-cadherin 和pEGFP-N1 空載體的轉(zhuǎn)染效率分別為（31.02±2.83）%和（35.62±3.35）%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.35，P＞0.05），見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染后T-鈣黏蛋白mRNA 的RT-PCR 檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1 -T-cadherin 的 CDDP-R B16F10 細胞擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中呈明顯條帶，其大小為208 bp，內(nèi)參對照β-actin 片段大小為435 bp，證實T-鈣黏蛋白成功轉(zhuǎn)染于腫瘤細胞，見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染后T-鈣黏蛋白的免疫組化SP 法檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1-T-cadherin 的 CDDP-R B16F10 細胞的T-鈣黏蛋白呈陽性表達。未轉(zhuǎn)染的CDDP-R B16F10 細胞、轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1 空載體的CDDP-R B16F10細胞T-鈣黏蛋白的表達均呈陰性，見圖4。

Fig.2 The expression of green fluorescence in cells under fluorescence microscope圖2 熒光顯微鏡下細胞內(nèi)綠色熒光的表達情況

Fig.3 The expression of T-cadherin mRNA圖3 T-鈣黏蛋白mRNA的表達情況

2.5 Wound-healing 劃痕實驗檢測腫瘤細胞遷移情況 T-鈣黏蛋白可抑制黑色素瘤細胞及其順鉑耐藥細胞遷移（P＜0.05）。T-鈣黏蛋白與順鉑聯(lián)合對耐藥細胞遷移的抑制有交互作用（P＜0.05），見圖5、表1。

2.6 Transwell 侵襲實驗檢測腫瘤細胞的侵襲能力 T-鈣黏蛋白可抑制黑色素瘤細胞及其順鉑耐藥細胞的侵襲力（P＜0.05）。T-鈣黏蛋白與順鉑聯(lián)合對耐藥細胞侵襲力的抑制有交互作用（P＜0.05），見圖6、表1。

3 討論

侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤脫離原發(fā)灶，到達遠處繼續(xù)生長，并形成轉(zhuǎn)移灶的過程，是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素。鈣黏蛋白的表達降低會導(dǎo)致細胞間黏附功能喪失，使細胞易脫落，從而造成腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此，其在多種腫瘤的增殖、遷移過程中起重要的作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)某些鈣黏蛋白分子可提高腫瘤對細胞毒性藥物的敏感性［9-10］。T-鈣黏蛋白屬于鈣黏蛋白超家族。目前，相關(guān)研究已經(jīng)在人類乳腺癌［11］、肺癌［12］等多種惡性腫瘤中檢測到T-鈣黏蛋白的表達異常。有研究表明，T-鈣黏蛋白在黑色素瘤中的表達缺失可阻礙腫瘤細胞的凋亡［13］。T-鈣黏蛋白可通過抑制β1整合素來降低腫瘤的侵襲性［14］。因此，T-鈣黏蛋白被認為是一種抑癌基因。順鉑為細胞周期非特異性細胞毒性藥物，作為傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物，已經(jīng)在多種腫瘤治療中出現(xiàn)耐藥性。耐藥是一個多因素參與、多基因作用的復(fù)雜過程，如藥物去活作用增強，進入細胞內(nèi)藥物的減少［15］，DNA損傷修復(fù)［16］和凋亡通路以及一些間接信號通路的變化等。

Tab.1 The effects of T-cadherin combined with cisplatin on migration and invasion of CDDP-R B16F10表1 T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對CDDP-R B16F10遷移和侵襲力的影響 （n=3，±s）

Tab.1 The effects of T-cadherin combined with cisplatin on migration and invasion of CDDP-R B16F10表1 T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對CDDP-R B16F10遷移和侵襲力的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a 與 pEGFP-N1-T-cadherin組比較，b 與 pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組比較，P＜0.05

組別空白對照組pEGFP-N1組pEGFP-N1-T-cadherin組順鉑組pEGFP-N1聯(lián)合順鉑組pEGFP-N1-T-cadherin聯(lián)合順鉑組F基因轉(zhuǎn)染F順鉑F交互細胞遷移率（%）67.90±1.54ab 68.33±1.96ab 51.87±1.56b 67.97±1.21ab 68.43±0.59ab 20.60±1.18 1 034.589＊245.416＊249.377＊穿膜細胞數(shù)（個/視野）23.67±1.53ab 24.00±1.73ab 12.67±0.50b 23.33±2.52ab 23.00±2.65ab 4.33±0.58 139.655＊14.500＊9.172＊

本研究成功建立黑色素瘤順鉑耐藥株CDDP-R B16F10。將構(gòu)建的pEGFP-N1-T-cadherin 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CDDP-R B16F10 后結(jié)果顯示，pEGFP-N1-T-cadherin 聯(lián)合順鉑組細胞遷移率及穿膜細胞數(shù)均低于其他組，且T-鈣黏蛋白與順鉑聯(lián)合對CDDP-R B16F10的遷移與侵襲力的抑制均有正交互作用，表明T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑可抑制CDDP-R B16F10 的遷移和侵襲能力，T-鈣黏蛋白與順鉑聯(lián)合有協(xié)同抗腫瘤作用，考慮可能原因為T-鈣黏蛋白在腫瘤細胞重新表達，恢復(fù)了細胞間的黏附作用，也可能通過T-鈣黏蛋白的信號傳遞功能［13］，最終降低了CDDPR B16F10的侵襲能力。

另外，有研究顯示PI3K/AKT信號通路可以通過補償順鉑引發(fā)的致死信號，從而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生［17］。作為一種腫瘤抑制因子，T-鈣黏蛋白可拮抗PI3K/AKT 信號通路［13］。筆者將 T-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)染CDDP-R B16F10 后，可能阻斷了上述補償通路，從而恢復(fù)了順鉑對CDDP-R B16F10 遷移及侵襲力的抑制作用。這為腫瘤的聯(lián)合治療及解決腫瘤化療中耐藥性的問題提供了思路。T-鈣黏蛋白逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的機制，以及T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑后所表現(xiàn)出的協(xié)同抗腫瘤的作用機制有待進一步研究和證實。此外，T-鈣黏素主要介導(dǎo)腫瘤細胞間黏附，其表達定位于胞漿和胞核，出現(xiàn)胞核的易位可以作為日后研究的方向；過表達T-鈣黏素后，可觀察腫瘤細胞間連接通訊情況以及細胞內(nèi)藥物檢測；另外耐藥株過表達T-鈣黏素后抑制遷移和侵襲，可通過檢測細胞增殖和凋亡以及藥物敏感情況加以驗證，這些均可以作為研究的方向。

Fig.4 The expression of T-cadherin protein(immumohistochemical staining,×400)圖4 T-鈣黏蛋白的表達情況（免疫組化染色，×400）

Fig.5 The effect of T-cadherin combined with cisplatin on migration of CDDP-R B16F10(×100)圖5 -鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對CDDP-R B16F10遷移的影響（×100）

Fig.6 The effect of T-cadherin combined with cisplatin on invasion of CDDP-R B16F10(hematoxylin staining,×200)圖6 T-鈣黏蛋白聯(lián)合順鉑對CDDP-R B16F10侵襲力的影響（蘇木素染色，×200）