多位點(diǎn)序列分型在新疆人間布魯氏菌病臨床分離株遺傳進(jìn)化研究中的應(yīng)用

李 博，岳錫宏，崔步云2，黎 唯，劉志國3，尚修建

布魯氏菌病(Brucellosis，布病)是由布魯氏菌(Brucella)屬細(xì)菌侵入機(jī)體引起的傳染-變態(tài)反應(yīng)性人獸共患傳染病，該病不僅嚴(yán)重危害人類健康，且對(duì)畜牧業(yè)、旅游業(yè)、國際貿(mào)易的快速發(fā)展起到極大的負(fù)面影響[1-2]。目前，我國31個(gè)省、市、自治區(qū)都有布病人畜間流行的報(bào)道，截止2015年10月，新疆報(bào)告新發(fā)病例7 564例，第1次位居全國各省區(qū)報(bào)告新發(fā)病數(shù)的第1位，人間布病疫情防控形勢極為嚴(yán)峻[3]。

研究人間布魯氏菌分離株的種群結(jié)構(gòu)和遺傳特征是深入了解布病流行機(jī)制和菌株遺傳進(jìn)化關(guān)系的重要手段，可為布病流行疫區(qū)制定有效的防控措施提供科學(xué)依據(jù)。多位點(diǎn)序列分型(Multiple-locus sequence typing，MLST)是一種通過對(duì)研究對(duì)象的多個(gè)管家基因進(jìn)行測序，經(jīng)核苷酸序列逐一比對(duì)，發(fā)現(xiàn)差異，從而區(qū)分細(xì)菌型別的分型方法，MLST因具有良好的分辨能力，且分型結(jié)果明確，易于不同實(shí)驗(yàn)室之間的比較，而被廣泛用于細(xì)菌分型和遺傳特征研究[4]。本研究為了解新疆人間布魯氏菌的種群特征和遺傳進(jìn)化，選取分離自7個(gè)地州人間布病的24株布魯氏菌和布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)參考菌株16M(羊種)、544A(牛種)、1330S(豬種)進(jìn)行MLST分型，選擇致病性強(qiáng)的羊種、牛種、豬種、綿陽附睪種等14種生物型代表菌株作為參考株，運(yùn)用平均連鎖聚類法(UPGMA)分析分離株與參考株之間的親緣關(guān)系，同時(shí)收集過往研究的186株全國不同地區(qū)布魯氏菌分離株MLST結(jié)果，探討新疆人間布魯氏菌的種群結(jié)構(gòu)和遺傳特征，掌握人間布病流行的優(yōu)勢菌型。

1 材料與方法

1.1菌株信息 24株人間布魯氏菌病臨床分離株系2015、2016年分離自新疆伊犁州、烏魯木齊市、石河子市、昌吉州、博州、塔城、阿勒泰地區(qū)，且全部為羊種3型布魯氏菌。分離株由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所布病室分離、鑒定和保存。

1.2儀器與試劑 96孔梯度PCR儀(Sigma 德國)，水平電泳槽、電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、凝膠成像儀(GelDoc-It310 北京天美科學(xué)儀器有限公司)；分子生物學(xué)試劑、引物合成均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司提供。

1.3基因組DNA提取 將試驗(yàn)凍干菌株接種于布魯氏菌瓊脂斜面上進(jìn)行復(fù)蘇，經(jīng)純培養(yǎng)、抑菌實(shí)驗(yàn)以及噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)鑒定后，收集菌體。采用熱滅活方式滅活細(xì)菌，然后使用北京天根生物科技有限公司基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。提取的基因組DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計(jì) 選擇布魯氏菌9個(gè)基因片段作為MLST靶標(biāo)基因，靶標(biāo)基因分別為：7個(gè)管家基因(gap、aroA、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ)，1個(gè)外膜蛋白基因(omp25)和1個(gè)基因間區(qū)(int-hyp)。靶標(biāo)基因、引物序列、基因位置和擴(kuò)增長度等信息可參考文獻(xiàn)[5]。

1.5PCR擴(kuò)增體系與程序擴(kuò)增體系 Super Mix 20 μL、引物(10 μmol/L)0.5 μL、DNA 1 μL、去離子水18 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與測序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果與預(yù)期擴(kuò)增長度一致的樣品進(jìn)行純化、雙向測序并拼接。測序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.7序列分析 運(yùn)用MEGA 6.0軟件對(duì)分離株的靶標(biāo)基因測序結(jié)果與布魯氏菌MLST標(biāo)準(zhǔn)等位基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定分離株ST基因型。應(yīng)用BioNumerics 7.5軟件進(jìn)行分離株、標(biāo)準(zhǔn)株、參考株平均連鎖聚類法(UPGMA)分析，獲得各菌株間親緣進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1分離株分布特征 臨床分離株均分離自新疆布病患者，實(shí)驗(yàn)室表型檢測均為羊種3型布魯氏菌。2015年分離7株，2016年分離17株；石河子市4株，烏魯木齊市2株，昌吉州8株，博州2株，塔城地區(qū)3株，阿勒泰地區(qū)1株，伊犁州4株。詳見表1。

2.2MLST等位基因及ST型比對(duì)結(jié)果 臨床分離株的9個(gè)等位基因型均相同，且序列型均為ST8型；3株布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)參考菌株(16M,544A,1330S)序列型分別為：ST7型，ST1型，ST14型。詳見表2。收集由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所布病室、烏蘭察布市地方病防治中心[6]提供的186株全國不同地區(qū)布魯氏菌分離株MLST分型結(jié)果，結(jié)果顯示ST8型是我國主要流行的布魯氏菌，在新疆、內(nèi)蒙古、河北、黑龍江、寧夏、陜西、青海、山東、遼寧、四川、廣東、上海、海南等省、區(qū)均有分布，且以北方地區(qū)為主。詳見表2。

表1 分離株分布特征Tab.1 Distribution of isolatedBrucella

地區(qū)菌株數(shù)分布情況(n,年份)種型石河子地區(qū)4石河子市(3,2015),石河子總場(1,2016)B.melitensis3型烏魯木齊市2頭屯河區(qū)(2,2016)B.melitensis3型昌吉州8阜康市(1,2015;3,2016),瑪納斯縣(2,2016),呼圖壁縣(1,2016),吉木薩爾縣(1,2016)B.melitensis3型博州2博樂市(1,2016),溫泉縣(1,2016)B.melitensis3型塔城地區(qū)3額敏縣(1,2016),裕民縣(1,2016),民豐縣(1,2016)B.melitensis3型阿勒泰地區(qū)1青河縣(1,2016)B.melitensis3型伊犁州4察布查爾縣(3,2015),霍城縣(1,2016)B.melitensis3型

表2 分離株MLST分型結(jié)果Tab.2 MLST result of isolated strains

菌株MLST等位基因譜gaparoAglkdnaKgyrBtrpEcobQ omp25int-hypST型分離株(n=24)323215382816M35321521027544A21121311111330S16414352114

表3 全國不同地區(qū)布魯氏菌分離株MLST分型結(jié)果Tab.3 MLST results of isolated strains from different provinces in China

ST型等位基因譜gaparoAglkdnaKgyrBtrpEcobQ omp25int-hyp種型菌株數(shù)分布地區(qū)(n)?1211213111B.abortus 1型、2型、6型、7型10Nm(6)、Sc(2)、Sh(1)、Ah(1)2212213111B.abortus 1型、3型、9型23Nm(14)、Xj(4)、Bj(1)、Ln(1)、Gs(3)5211214111B.abortus 1型、3型5Nm(3)、Xj(1)、Bj(1)73532152102B.melitensis 1型5Qh(1)、HaiN(4)8323215382B.melitensis 1型、2型、3型99Xj(8)、Nm(18)、Nx(2)、Gd(8)、HaiN(7)、Hb(7)、HlJ(8)、Jl(3)、Ln(6)、Qh(2)、Sd(12)、Sx(15)、ShX(1)、Sh(1)、Sc(1)、17164153524B.suis 1型、3型8Gd(2)、Sc(1)、Gx(1)份、HaiN(3)、Nm(1)283103215382B.melitensis 2型、3型4Nm(2)、Hn(1)、Sc(1)29363215382B.melitensis 3型6Nm(6)303133215382B.melitensis 3型2Ln(1)、Nm(1)表3(續(xù))ST型等位基因譜gaparoAglkdnaKgyrBtrpEcobQ omp25int-hyp種型菌株數(shù)分布地區(qū)(n)?31323815382B.melitensis 3型11Sd(7)、Xj(3)、Nm(1)33184153124B.suis 1型、3型3Gd(1)、Gx(2)34184143121B.suis 1型5Sc(1)、Nx(2)、Jl(1)、HuN(1)35184143521B.suis 1型、2型、3型5Nm(2)、Ah(1)、Bj(1)、Xz(1)

“*”：Xj：新疆、Nm：內(nèi)蒙古、Sc：四川、Sh：上海、Ah：安徽、Bj：北京、Ln：遼寧、Gs：甘肅、Qh：青海、HaiN：海南、Nx：寧夏、Gd：廣東、Hb：河北、HlJ：黑龍江、Jl：吉林、Sd：山東、Sx：山西、ShX：陜西、Gx：廣西、Hn：河南、HuN：湖南、Xz：西藏

2.3新疆分離株、標(biāo)準(zhǔn)株、參考株的進(jìn)化關(guān)系分析 24株臨床分離株與羊種2型、3型同屬ST8型克隆群，該克隆群與羊種ST7、ST9、ST10、ST11、ST12的親緣關(guān)系較近，而與牛種、綿羊種、豬種各ST型處于不同分枝，遺傳距離較遠(yuǎn)；羊種、豬種、綿羊種的各ST型高度集中，并且處于同一進(jìn)化分枝，表明同種不同生物型的布魯氏菌親緣關(guān)系較近，不同種布魯氏菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；B.abortus66與其他牛種菌的遺傳距離較遠(yuǎn)，呈現(xiàn)出一定的遺傳多樣性，結(jié)果見圖1。

圖1 分離株、標(biāo)準(zhǔn)株與參考株的MLST聚類分析Fig.1 Cluster analysis of isolates,standard strains and reference strains on the MLST

3 討 論

布魯氏菌6個(gè)生物種和19個(gè)生物型因其致病力不同，造成對(duì)人體致病性的差異，其中羊種布魯氏菌致病力最強(qiáng)，牛種、豬種菌致病力次之，這3種布魯氏菌是導(dǎo)致人和動(dòng)物間布病傳播的重要病原體[7-8]。因此，掌握布魯氏菌分離株的生物種型即成為有效控制和治療人間布病的重要手段和前提條件。傳統(tǒng)表型分類方法是根據(jù)分離培養(yǎng)物是否需要CO2，H2S是否產(chǎn)生，以及染料抑菌、單相特異性血清凝集試驗(yàn)和噬菌體裂解等特點(diǎn)進(jìn)行布魯氏菌種型鑒別，但該方法耗時(shí)長、操作繁瑣、干擾因素多和生物安全風(fēng)險(xiǎn)大，造成其無法滿足突發(fā)布病公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置需求。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，AFLP、PFGE、HOOF和Rep-PCR等分型技術(shù)被廣泛用于布魯氏菌基因分型和遺傳進(jìn)化研究[9-11]，但從實(shí)際應(yīng)用來看，上述技術(shù)因布魯氏菌基因組高度保守、不同生物種型間的同源性較高，導(dǎo)致分辨率低，從而難以區(qū)分菌株之間的親緣關(guān)系。

MLST技術(shù)可直接測定多個(gè)管家基因的核苷酸序列，根據(jù)序列測定結(jié)果確定一個(gè)等位基因編號(hào)，試驗(yàn)菌株的各等位基因編號(hào)按照一定順序排列，形成菌株等位基因譜，等位基因譜代表了一組核苷酸序列信息，進(jìn)而能夠準(zhǔn)確記錄菌株在基因水平上的差異。1998年，Maiden等[12]首次將該MLST技術(shù)應(yīng)用到腦膜炎奈瑟菌分型，該技術(shù)以準(zhǔn)確、分辨率高、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于其他病原微生物的分型。Whatmore等[13]運(yùn)用MLST方法對(duì)布魯氏菌7個(gè)看家基因和2個(gè)非看家基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過確定等位基因譜，將30個(gè)國家、地區(qū)的160株布魯氏菌分為27個(gè)ST型，且各ST型與傳統(tǒng)表型分型的結(jié)果基本一致。Chen YF等[14]對(duì)中國60株布魯氏菌進(jìn)行MLST分型，新發(fā)現(xiàn)9個(gè)ST型。上述研究表明MLST技術(shù)可作為研究布魯氏菌基因分型的重要手段，通過區(qū)分菌株間的進(jìn)化關(guān)系，達(dá)到追蹤溯源的目的。

本研究結(jié)果顯示24株分離株均為ST8型，與先前分離自新疆的羊種菌進(jìn)化程度相同，表明新疆主要流行ST8型羊種布魯氏菌，流行菌株種型單一，菌株的管家基因、外膜蛋白基因遺傳較保守。收集、分析不同地區(qū)186株布魯氏菌MLST結(jié)果，發(fā)現(xiàn)我國布魯氏菌同樣以ST8型菌流行為主，且以北方地區(qū)為重點(diǎn)流行區(qū)域，新疆人間布魯氏菌與內(nèi)蒙古、寧夏、河北、山東、青海、遼寧、陜西、四川、上海等地的分離株為同一型別，在進(jìn)化樹中處于同一分支，揭示了新疆人間流行株可能是由內(nèi)蒙古、寧夏、河北、山東等地引進(jìn)的繁育羊所攜帶，通過人與羊密切接觸，導(dǎo)致了輸入性感染和流行。而本研究中各臨床分離株MLST分型高度聚集的結(jié)果卻與既往研究存在一定差異，一方面是隨著新疆畜間防控的不斷深入，染疫動(dòng)物凈化、免疫接種措施的廣泛實(shí)施，促使牛種布魯氏菌流行得到較為有效的控制，由早期以牛、羊種布魯氏菌為主的流行模式逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐匝蚍N布魯氏菌流行為主。另一方面是不同基因分型方法的應(yīng)用造成了差異結(jié)果，且MLST方法可能存在一定的局限性，對(duì)同種不同生物型的布魯氏菌較難區(qū)分。同時(shí)，研究結(jié)果揭示了MLST分型方法雖然能夠在種的層面鑒別布魯氏菌，但卻不能有效區(qū)分各生物型，同種不同生物型可被聚為一類ST型，且局部地區(qū)的少量樣本(分離株)難以被區(qū)分，因而MLST分型方法只能作為布魯氏菌分子分型的補(bǔ)充手段。

本研究選取的臨床菌株分離自伊犁州、烏魯木齊市、石河子市、昌吉州、博州、塔城和阿勒泰地區(qū)，上述地區(qū)覆蓋了新疆北部全部行政區(qū)域，作為新疆主要畜牧養(yǎng)殖地，7個(gè)地(州、市)的人間布病發(fā)病率多年居全疆前列[15]，霍城、額敏等縣在近年存在不同程度的人間布病暴發(fā)流行，因此研究結(jié)果具有一定的代表性和參考價(jià)值，且與相關(guān)研究結(jié)果一致，均表明ST8型布魯氏菌在國內(nèi)具有廣泛的分布，尤其在北方地區(qū)普遍流行[6,16-17]。羊種布魯氏菌是一種強(qiáng)致病性病原菌，能引起廣泛的動(dòng)物間流行，并對(duì)人感染構(gòu)成極大威脅[18]，根據(jù)研究結(jié)果，新疆人間布病感染源主要是染疫羊只，做好羊布病的防控是防范人間布病流行的關(guān)鍵。動(dòng)物間應(yīng)加強(qiáng)輸入羊的檢診檢疫、強(qiáng)化感染羊的管控，做好羊的疫苗免疫和凈化工作；人間布病防控應(yīng)加強(qiáng)重點(diǎn)防控人群的宣傳教育，遵循早診斷、早治療、足量、足療程的治療原則，強(qiáng)化“三位一體”、醫(yī)防結(jié)合建設(shè)；檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)推廣ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和MLVA、全基因組測序等檢測、分型技術(shù)，以有效應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置。

利益沖突：無

引用本文格式：李博,岳錫宏,崔步云,等.多位點(diǎn)序列分型在新疆人間布魯氏菌病臨床分離株遺傳進(jìn)化研究中的應(yīng)用[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(5):411-415，439.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.042