布魯氏菌病快速檢測試紙條的探索

孔玉方，鄭家昊2，王慧煜，梅 琳，吳紹強(qiáng)，林祥梅，韓雪清

布魯氏菌病(Brucellosis)(簡稱布病)是由布魯氏桿菌引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重威脅人和多種動物的生命健康[1]。該病不僅對動物的繁殖和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，而且人在感染布魯氏菌后，難以治愈，從而造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前，全球有170多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)有人、畜布病的流行和分布[2]。此外，野生動物也會攜帶布魯氏菌，進(jìn)而引發(fā)家畜患病，這也是老病新發(fā)的原因。因此對布病的防控成為當(dāng)前我國和全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生健康問題。

目前，病原學(xué)檢測是診斷布病的金標(biāo)準(zhǔn)，而布魯氏菌的分離培養(yǎng)對實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)人員的要求較高，需要具有經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員在BSL-3(Biosafety Level 3 Laboratory)級以上的實(shí)驗(yàn)室操作[3]?；⒓t平板凝集實(shí)驗(yàn)(rose-bengal plate agglutination test，RBT)和試管凝集實(shí)驗(yàn)(standard tube agglutination test ，SAT)具有敏感性高和特異性強(qiáng)的檢測特點(diǎn)，可用于布病的早期診斷，但不適用于現(xiàn)場樣品的快速篩查[4]。而基于布魯氏菌全菌作為抗原的 ELISA需在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，不適用于現(xiàn)場快速檢測[5]。因此，建立一種適用于現(xiàn)場快速檢測的方法對布病防控具有重大意義。有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌外膜蛋白(Outer membrane proteins，OMPs)是繼LPS后又一布病優(yōu)勢診斷抗原[6-7]。OMP28蛋白又稱BP26或CP28，是一種由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外釋放的可溶性外周漿蛋白。1996年，Lindler等[6]研究結(jié)果表明OMP28蛋白均可檢測到羊、牛、鼠感染的布魯氏菌，該蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可作為布魯氏菌的診斷抗原。2008年，宮曉煒等[8]發(fā)現(xiàn)BP26在人注射的疫苗中沒有缺失和弱化，采用免疫印跡檢測BP26蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白敏感性高、特異性強(qiáng)。Kaushik P等[9]發(fā)現(xiàn)在OMP28誘導(dǎo)下體內(nèi)IgG含量猛增，還可以誘導(dǎo)以IgG2a介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。OMP22蛋白是由213個(gè)氨基酸組成，屬于OMP25/OMP31家族蛋白，在布魯氏桿菌的各個(gè)種屬間保守性高，這與布病的感染力有關(guān)[10]。OMP22蛋白的免疫反應(yīng)能力與布魯氏菌的脂多糖相似，均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[11-12]。OMP22蛋白作為布病的重要毒力因子，在致病過程中OMP22蛋白主要表達(dá)分泌于細(xì)菌的表面，會引起較高的Th1免疫反應(yīng)[13]。此外，外膜蛋白OMP22可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，降低了該蛋白作為診斷抗原的成本。

目前免疫層析技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、結(jié)果肉眼可視和無需輔助儀器檢測等特點(diǎn)，特別適合現(xiàn)場樣品快速初篩和基礎(chǔ)推廣。本研究將重組的布魯氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28的混合蛋白作為膠體金標(biāo)記物，抗OMP22單克隆抗體作為質(zhì)控線(C線)OMP22和OMP28混合蛋白作為檢測線(T線)，組裝成檢測布魯氏菌病的免疫層析試紙條，為現(xiàn)場初篩提供了新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1蛋白與血清 布魯氏菌重組蛋白OMP22、OMP28和抗OMP22單克隆抗體由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動檢所制備；布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽性血清均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛源結(jié)核病血清、藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、口蹄疫血清、牛白血病血清、小反芻獸疫血清及牛、羊、馬、豬源血清樣品，中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動檢所保存。

1.1.2主要試劑 氯金酸(HAuCl4·4H2O)、檸檬酸三鈉、高效清洗劑(Formula)、膠體金涂鍍劑(F-1307)、吸水紙(Paper-2030)、NC膜(Millipore HiFlow-95)、白色底板和金標(biāo)墊(Gls-17930)北京吉森生物科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器 三位噴點(diǎn)系統(tǒng)(XYZ3050TM)，和切紙機(jī)系統(tǒng)(CM4000TM)美國BIO DOT公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9030A型)上海中友儀器設(shè)備有限公司；臺式冷凍超高速離心機(jī)BECKMAN COULTER；超純水系統(tǒng)美國 Milipore公司。

1.2 方 法

1.2.1膠體金制備 檸檬酸三鈉還原法制備40 nm膠體金溶液：取0.01%氯金酸溶液100 mL加熱至沸騰后加入1%檸檬酸三鈉水溶液1 mL，2 min內(nèi)金黃色氯金酸溶液變?yōu)樽仙?，繼續(xù)加熱沸騰10 min，冷卻后添加蒸餾水恢復(fù)至原體積，該方法制備的膠體金溶液采用紫外分光光度計(jì)掃描(UV-Vis)，可見光區(qū)最高吸收峰在(525±2)nm處為合格。

1.2.2蛋白標(biāo)記濃度的確定 采用目測法確定膠體金與待標(biāo)蛋白質(zhì)用量比例，取8個(gè)1.5 mL離心管分別加入1 mL的膠體金溶液，用0.2 mol/L K2CO3調(diào)pH 8.2，再加入用0.005 mol/L，pH值9.0的硼酸鹽緩沖液稀釋的3～15 μg /mL的OMP22和OPM28混合蛋白，5 min后在上述各管中加入0.1 mL 10% NaCl溶液，混勻后靜置2 h后肉眼觀察，保持紅色最低濃度即為蛋白最佳包被濃度，按照表1操作。

表1 蛋白最佳標(biāo)記濃度Tab.1 Optimal amount of protein

編號膠體金/mLK2CO3/μL蛋白/μgPB/μL10%NaCl/μL111001001002110397100311059510041107931005110991100611011891007110138710081101585100

1.2.3膠體金標(biāo)記過程 取5 mL膠體金溶液至15 mL離心管內(nèi)平衡至室溫，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)pH8.2，然后根據(jù)1.2.2獲取的最適蛋白包被濃度加入相應(yīng)量的OMP22和OMP28，攪拌器攪拌20 min混勻，接著加入10% BSA 0.25 mL攪拌10 min，最后加入20%P EG20000 0.012 5 mL攪拌10 min， 10 000 r/min 4 ℃離心15 min，棄上清保留濃縮膠體金顆粒，加入1/10體積含1%BSA的PB液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4膠體金試紙條制備

1.2.4.1金標(biāo)墊預(yù)處理 將金標(biāo)墊浸泡入含有表面活性劑和金釋放液20 g/L BSA 、1 mL TrionX-100和25 g/L的PBS(pH7.4)緩沖液中，浸泡30 min后至37℃恒溫箱烘干備用。

1.2.4.2硝酸纖維素膜(NC)預(yù)處理 將NC膜在PBST溶液(含0.5% Tween20和1% BSA，pH7.4)浸泡30 min，37 ℃烘干，備用。

1.2.4.3試紙條組裝 使用三維噴金劃膜儀將1 mg/mL的OMP22、OMP28混合蛋白和抗OMP22單克隆抗體噴涂在NC膜上，分別作為T線和C線；37 ℃溫箱烘干，將樣品墊、NC 膜、金標(biāo)墊、吸水墊粘于PVC無熒光底板上，然后用BIO-DOT切割機(jī)將組裝好的條子切割成5 mm寬度的試紙條，置于卡槽內(nèi)加入干燥劑放入巴氏滴管并用密封袋封閉常溫避光保存，有效期1年，方便野外現(xiàn)場檢測。

1.2.5試紙條靈敏度檢測 將布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用1×PBS緩沖液按照1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128進(jìn)行梯度稀釋。

1.2.6試紙條特異性檢測 選用同一批次試紙條對牛源布魯氏菌血清、牛結(jié)核病血清、藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、口蹄疫血清、牛白血病血清及小反芻獸疫血清，觀察結(jié)果有無交叉反應(yīng)。

1.2.7實(shí)用性驗(yàn)證和ELISA試劑盒效價(jià)評定 使用同一批次試紙條對現(xiàn)場采集的牛、羊各100份血清樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試劑盒(IDEXX)和國家標(biāo)準(zhǔn)檢測的虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)作為參照比，計(jì)算兩種方法檢測結(jié)果符合率。對篩出的陽性血清按照1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶200進(jìn)行梯度稀釋用于評價(jià)ELISA試劑盒的效價(jià)和試紙條的靈敏度。

1.2.8試紙條重復(fù)性檢測 使用同一批次和不同批次試紙條檢測布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，通過試驗(yàn)結(jié)果評價(jià)試紙條的批間和批內(nèi)的重復(fù)性效果。

2 結(jié) 果

2.1膠體金溶液的鑒定 按照1.2.1方法進(jìn)行制備膠體金，結(jié)果顯示，膠體金溶液呈酒紅色，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)掃描可知：膠體金橫向等離子共振吸收波長在527 nm處，且峰型狹窄，說明該膠體金顆粒均一，分散性好(圖1)。

A:40 nm粒徑膠體金溶液；B:UV-Vis 掃描光譜圖圖1 標(biāo)準(zhǔn)膠體金溶液鑒定圖譜Fig.1 Standard colloidal gold solution identification map

2.2蛋白標(biāo)記最適濃度 未加蛋白管和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金溶液的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變，膠體金溶液紅色不變的最低蛋白標(biāo)記用量為9 μg/mL(圖2)。

圖2 膠體金標(biāo)記蛋白最適濃度Fig.2 Optimization concentration determination of gold colloid binding protein

2.3試紙條靈敏度檢測 當(dāng)布魯氏標(biāo)準(zhǔn)陽性血清稀釋度達(dá)1∶128時(shí)，質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)均顯示兩條紅線，而稀釋度低于1∶128時(shí)，試紙條呈陰性，因此，該試紙條的靈敏度為1∶128。

2.4試紙條特異性檢測 用重組布魯氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28的混合蛋白標(biāo)記的試紙條檢測布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、牛結(jié)核病血清、藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、口蹄疫血清、牛白血病血清及小反芻獸疫血清。結(jié)果顯示，除布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)血清為陽性外，其他均為陰性。

2.5實(shí)用性驗(yàn)證和ELISA試劑盒效價(jià)評定 用IDEXX試劑盒和國家檢測標(biāo)準(zhǔn)的RBPT分別對牛、羊各100份血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，用IDEXX試劑盒檢出陽性結(jié)果40份和陰性結(jié)果160份；使用膠體金免疫層析試紙條檢測，陽性結(jié)果38份和陰性結(jié)果162份；以RBPT檢測結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，檢出陽性結(jié)果39份和陰性結(jié)果161份，以IDEXX試劑盒檢測結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果試紙條檢測的陽性樣品全部來自IDEXX試劑盒檢測的40份陽性血清樣品，即兩種檢測方法的符合率為95%(38/40)，以RBPT檢測結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果試紙條檢出的38份陽性樣品全部來源于RBPT檢測的39份陽性樣品，即兩種檢測方法的符合率為97.4%(38/39)。采用ELISA試劑盒檢測不同稀釋度的陽性樣品，結(jié)果顯示陽性血清最大稀釋度在1∶100時(shí)檢測結(jié)果為陰性，而膠體金試紙條在稀釋度為1∶100時(shí)仍可檢出，表明膠體金試紙條的靈敏度較ELISA試劑盒高。

2.6試紙條重復(fù)性檢測 使用同一批次和不同批次的試紙條檢測布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，試紙條的批內(nèi)和批間結(jié)果重復(fù)性良好。

3 討 論

布魯氏菌外膜蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，在免疫診斷方面彰顯成效[14-15]。OMP28在各種屬間保守性極高，具有良好的免疫原性，Yong等[16]發(fā)現(xiàn)急性反應(yīng)期患者機(jī)體血清中OMP28蛋白抗體表現(xiàn)為陽性，而在恢復(fù)期及慢性反應(yīng)期患者機(jī)體血清中OMP28蛋白抗體表現(xiàn)為陰性，表明該蛋白具有作為急性型感染診斷抗原的潛力。Lim等[17]用外膜蛋白OMP28免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的IgG1和IgG2的滴度高于空白對照組20倍，并且脾臟的感染度也低，這表明OMP28可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。2013年，有相關(guān)研究表明此蛋白可在大腸桿菌中大量表達(dá)，繼而降低了OMP28蛋白的生產(chǎn)成本，具有良好的市場前景和應(yīng)用價(jià)值[18]。而外膜蛋白OMP22也是一種免疫優(yōu)勢抗原，Cassataro等[19]發(fā)現(xiàn)OMP22蛋白可分布于S型布魯氏菌的表面。也有相關(guān)報(bào)道[20-21]OMP22蛋白與布魯氏菌的脂多糖成分相似，均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。Martín-Martín 等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)缺失OMP22基因的綿羊附睪布魯氏菌在侵染HeLa細(xì)胞和J774.A1細(xì)胞時(shí)，兩種細(xì)胞的增殖分裂能力均降低，表明OMP22基因可能與布魯氏菌的毒性和感染力相關(guān)。近而表明外膜蛋白Omp28和OMP22均可作為診斷抗原應(yīng)用于布魯氏菌病快速診斷中。

鑒于布魯氏菌外膜蛋白OMP28和OMP22具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，本研究采用雙抗原夾心法建立了一種快速、特異、敏感適用于現(xiàn)場和基層推廣的膠體金免疫層析試紙條。劉亞東等[24]研制出的牛源布氏菌重組膜蛋白膠體金免疫層析試紙條具有快速、敏感、特異和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但是檢測目標(biāo)局限于牛源血清樣品，本研究在劉亞東等研究者的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，采用膠體金標(biāo)記OMP28和OMP22混合蛋白，將OMP28、OMP22混合蛋白和抗OMP22的單克隆抗體分別作為T線和C線噴涂于NC膜上，可以用于檢測牛、羊等動物的血清。本研究將OMP28和OMP22結(jié)合既可增強(qiáng)抗原的免疫原性、免疫反應(yīng)性，也可防止漏檢。結(jié)果表明該方法制備的試紙條具有良好的特異性和敏感性，不與牛源結(jié)核病血清、藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、口蹄疫血清、牛白血病血清和小反芻獸疫血清發(fā)生交叉反應(yīng)；牛、羊源血清樣品檢測結(jié)果與商品化ELISA試劑盒符合率為95%；檢測布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清靈敏度達(dá)1∶128。RBPT作為國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法從200份樣品中篩選出39份陽性樣品，膠體金試紙條檢測38份陽性樣品全部來自39份陽性樣品，兩種檢測方法的符合率為97.4%。說明膠體金試紙條檢測的靈敏度高，但偶爾也會有假陽性的結(jié)果，可能與下列因素有關(guān)：①T線距離結(jié)合墊較近；②過量的金標(biāo)粒子噴涂結(jié)合墊；③選用NC膜型號的層析速度過慢。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中我們需要針對上述問題進(jìn)行改進(jìn)。此外，采用雙抗原夾心法制備的試紙條有時(shí)質(zhì)控線和檢測線結(jié)果會偏弱，這是由于金標(biāo)墊抗原會和檢測線上包被的抗原競爭結(jié)合樣品中的抗原表位，后續(xù)我們可以通過金標(biāo)ProteinA，質(zhì)控線包被單抗IgG，以此提高檢測信號和試紙條的靈敏度。

本研究以牛源布魯氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28作為金標(biāo)抗原，制備了快速檢測布魯氏菌病的膠體金免疫層析試紙條，相信通過對上述不足條件進(jìn)一步優(yōu)化后，可以滿足現(xiàn)場大批量樣品的初步篩查。

本研究獲得了粒徑均一，分散良好的膠體金溶液和蛋白標(biāo)記的最適濃度，并且本研究制備的膠體金試紙條在檢測血清抗體方面具有良好的敏感性、特異性及重復(fù)性。

利益沖突：無

引用本文格式：孔玉方,鄭家昊,王慧煜,等.布魯氏菌病快速檢測試紙條的探索[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(5):460-464. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.053