畢赤酵母表達解淀粉芽孢桿菌殼聚糖酶及其水解制備可控結構殼寡糖

程 功，焦思明，馮 翠，賈培媛，任立世，杜昱光*

（中國科學院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190）

殼聚糖是甲殼素的部分或全脫乙酰產(chǎn)物，是由氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）及N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）通過β-1,4糖苷鍵連接而成線性聚合物[1]。殼聚糖酶（EC 3.2.1.132）廣泛存在于動植物及微生物中，可通過內(nèi)切方式水解殼聚糖底物[2]。在糖活性酶數(shù)據(jù)庫（www.cazy.org）中，已知7 個糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH）家族中均包含殼聚糖酶，這些家族依次為GH-3、GH-5、GH-7、GH-8、GH-46、GH-75及GH-80。

殼聚糖的降解產(chǎn)物殼寡糖已被報道具有抗氧化、抗腫瘤及激活植物免疫等多種生物活性[3-6]。這些生物活性與殼寡糖的聚合度、脫乙酰度及乙?；诠烟擎溕系姆植季苯酉嚓P[7]。為闡明殼寡糖結構與功能的關系及其產(chǎn)生活性的具體機制，極有必要制備結構確定的殼寡糖。非特異性商品酶類，如纖維素酶[8-9]、蛋白酶[10-11]及脂肪酶[12]等已被報道具有殼聚糖水解活性。然而，這些商品酶中可能同時含有多種殼聚糖水解酶類，難以獲得結構確定的殼寡糖。利用表達的單一殼聚糖水解酶則可能實現(xiàn)特定結構類型殼寡糖的制備。

解淀粉芽孢桿菌作為一種安全的菌種，已被批準用于α-淀粉酶、β-葡聚糖酶及蛋白酶等食品用酶制劑的制備。通過基因檢索發(fā)現(xiàn)，該菌種基因組中存在潛在的殼聚糖編碼基因。目前，針對解淀粉芽孢桿菌殼聚糖酶的國內(nèi)外研究較少，僅發(fā)現(xiàn)段靜等[13]在大腸桿菌中對解淀粉芽孢桿菌菌株HZ-1510中的殼聚糖酶基因進行了表達及酶學性質(zhì)鑒定。為獲得來源于安全菌株的殼聚糖酶用于特定結構類型殼寡糖的制備，本研究利用畢赤酵母高效表達系統(tǒng)對來源于解淀粉芽孢桿菌的殼聚糖酶進行分泌表達及鑒定，進一步利用該酶水解低脫乙酰度殼聚糖制備結構可控的殼寡糖。本研究獲得的畢赤酵母高效表達菌株具有制備工業(yè)或食品級殼聚糖酶的應用潛力，不僅如此，利用該酶水解制備的特定結構類型殼寡糖可能具有更高或者全新的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲殼素（貨號：V900332）、3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-D4鈉鹽（貨號：269913） 美國Sigma-Aldrich公司；質(zhì)粒提取試劑盒（貨號：9760）、膠回收試劑盒（貨號：9762）、T4連接酶（貨號：2011A）、E. coli DH5α化學感受態(tài)細胞（貨號：9057） 寶日醫(yī)（北京）生物技術有限公司；畢赤酵母GS115（貨號：C18100）、XhoI（貨號：FD0695）、NotI（貨號：FD0596）、BglII（貨號：FD0084）、乙腈（色譜純，貨號：A998-4） 美國Thermo Fisher公司；蛋白Marker（貨號：PR1920） 北京索萊寶科技有限公司；畢赤酵母表達載體pPIC9（貨號：VT1343） 湖南科愛醫(yī)療器械有限公司；pGBG1為pPIC9信號肽核酸序列根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性優(yōu)化后的載體[14]；畢赤酵母培養(yǎng)用含葡萄糖最小營養(yǎng)（minimal medium containing glucose，MD）培養(yǎng)基、含甘油緩沖復合（buffered complex medium containing glycerol，BMGY）培養(yǎng)基及含甲醇緩沖復合（buffered complex medium containing methanol，BMMY）培養(yǎng)基的配制方法參考畢赤酵母表達試劑盒說明書（貨號：K1740-01） 美國Invitrogen公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Autoflex III smartbeam型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）儀、AVANCE III 600MHz核磁共振儀 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 解淀粉芽孢桿菌殼聚糖酶基因全合成及表達載體構建

選擇解淀粉芽孢桿菌菌株FZB42[15]中的潛在殼聚糖酶（GenBank：ABS75305.1，已去除預測的信號肽序列）的編碼基因序列，使用畢赤酵母偏好的密碼子進行基因序列優(yōu)化，合成前在5’及3’末端分別添加XhoI及NotI酶切位點并對設計好的序列進行全基因合成（委托北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成）。使用XhoI及NotI分別對含有目標基因序列的pUC18及表達載體pGBG1進行雙酶切，分別回收目標基因序列片段及線性化的pGBG1載體大片段，使用T4連接酶進行連接并轉化至E. coli DH5α化學感受態(tài)細胞中。對構建好的含有目標基因序列的表達載體質(zhì)粒進行酶切及測序（委托北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成）驗證。

1.3.2 解淀粉芽孢桿菌殼聚糖酶畢赤酵母表達及初步鑒定

將獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglII線性化后，凝膠電泳分離并切取含有目的基因的片段（較大片段），電擊導入新制備的畢赤酵母GS115電轉感受態(tài)細胞中，將通過組氨酸營養(yǎng)缺陷MD平板上篩選得到的重組子平鋪在含有膠體殼聚糖（0.5%）的BMMY瓊脂平板上進行培養(yǎng)，從中進一步篩選出水解圈最大的單克隆菌株。將篩選的單菌落接種于200 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)48 h，離心棄上清液，加入200 mL的BMMY培養(yǎng)基進行誘導表達。24 h后補加甲醇至其終體積分數(shù)為1%，以后每隔24 h補加一次，共計誘導120 h后離心，上清液即為含有殼聚糖酶的粗酶液。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測蛋白表達情況，Bradford法測定粗酶液中的蛋白質(zhì)量濃度。以制備的脫乙酰度62%殼聚糖[14]為底物，使用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）方法測定殼聚糖的活力。在pH 3.6～8.0范圍內(nèi)（pH 3.6～5.6時使用50 mmol/L的乙酸鈉緩沖液，pH 6.0～8.0時使用50 mmol/L的磷酸緩沖液）測定該酶的最適pH值，30～90 ℃范圍內(nèi)確定最佳反應溫度。在40、50 ℃及60 ℃下處理殼聚糖酶1 h，每隔20 min測一次殘留的酶活力。

1.3.3 低脫乙酰殼寡糖制備及組成與結構分析

使用前期制備的脫乙酰度為62%的殼聚糖[11]水解制備殼寡糖。稱取50 g制備的低脫乙酰度殼聚糖，加至1 000 mL水中，加入乙酸溶解并調(diào)節(jié)至pH 6.0。再加入10 mL的粗酶液，40 ℃攪拌反應48 h。待反應結束后，升高溫度至90 ℃維持10 min以滅活殼聚糖酶，離心去除不溶物后冷凍干燥用于后續(xù)分析。對酶解制備的殼寡糖進行質(zhì)譜分析以初步確定其寡糖的組成：將殼寡糖配制成2 mg/mL的溶液，吸取1 μL點樣至樣品板上，待其自然干燥后，加入1 μL基質(zhì)2,5-二羥基苯甲酸溶液，待其干燥后使用MALDI-TOF MS儀進行檢測（正離子反射模式）。檢測范圍為300～3 000。依據(jù)一級質(zhì)譜信息進行潛在殼寡糖組分組成分析的具體方法如下：先建立聚合度2～20，所有可能結構殼寡糖的H+、Na+及K+衍生物理論質(zhì)荷比（m/z）數(shù)據(jù)庫，將測定的m/z值與數(shù)據(jù)庫中殼寡糖的理論m/z值對比，即可推測產(chǎn)物殼寡糖的潛在組成。本次僅標注殼寡糖的K+衍生物。

使用液體1H NMR及13C NMR分別對制備的殼寡糖的還原端及非還原端單糖組成進行分析，具體方法為：稱取25 mg制備的殼寡糖凍干樣品，加入0.50 mL D2O，待其充分溶解后加樣檢測。以3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-D4鈉鹽為內(nèi)標，使用AVANCE III 600MHz核磁共振儀對樣品進行檢測，其中，1H NMR檢測時對水峰進行抑制以減少其干擾。獲得的原始數(shù)據(jù)使用分析軟件MestReNova打開后，使用內(nèi)標校正位移值后，參考Sasaki等[16]的方法對特定部位單糖進行標記，具體的參考位移值包括1H NMR中的還原端GlcN（-D，σ 5.19）、還原端GlcNAc（-A，σ 5.43）以及13C NMR中5位碳（C5）的非還原端GlcN（D-，σ 79.0）及非還原端GlcNAc（A-，σ 78.5）等。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌殼聚糖酶基因全合成、克隆及畢赤酵母表達

來源于解淀粉芽孢桿菌FZB42的潛在殼聚糖酶編碼基因長度為837 bp，編碼蛋白包含278 個氨基酸，在蛋白的氨基末端包含一個36 氨基酸組成的預測信號肽序列。在不改變氨基酸序列的前提下使用畢赤酵母偏好的密碼子對該基因序列（不包含信號肽編碼序列）進行優(yōu)化，將優(yōu)化后的基因序列命名為bacsn（GenBank：MG595776）。將優(yōu)化前后的殼聚糖基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)，共有195 個核苷酸發(fā)生了改變。將合成后的基因構建至畢赤酵母表達載體pGBG1中并使用酶切驗證其正確性，電泳結果顯示，含有目的基因的表達載體經(jīng)XhoI及NotI雙酶切后在750～1 000 bp附近出現(xiàn)了一個條帶（E1），與目的基因（762 bp）大小相符；使用BglII對質(zhì)粒線性化后出現(xiàn)了預期的兩個片段（E2），其中，10 kb附近為含有目的基因bacsn的片段，3 kb附近為抗性基因片段（圖1A）。雙末端測序結果也確認目的基因被正確構建至表達載體中。將含有目的基因的表達載體bacsn-pGBG1轉化至畢赤酵母GS115中并使用甲醇進行了誘導表達，對表達產(chǎn)物（記為BACSN）進行SDS-PAGE分析，結果顯示，在35 kDa附近出現(xiàn)了兩個蛋白條帶（P1），其中，25～35 kDa之間的條帶與該蛋白的預測值（28.3 kDa）相符，而大于35 kDa的條帶推測為該蛋白的糖基化產(chǎn)物（圖1B）。Bradford法測定粗酶液中的蛋白質(zhì)量濃度為0.23 mg/mL。

與傳統(tǒng)的基于活性篩選的方法相比，利用全基因合成方法可以更高效快捷地從已公開的真核及原核基因組（近20萬 個）數(shù)據(jù)庫中根據(jù)利用同源檢索方法獲得想要的基因[17-18]。結合密碼子序列的優(yōu)化可能進一步提高目標基因的蛋白表達水平[19]。在本研究中，對基于基因組數(shù)據(jù)挖掘獲得的潛在殼聚糖酶基因進行了密碼子優(yōu)化并在畢赤酵母中實現(xiàn)了分泌表達，進一步證實該策略挖掘目標酶類的有效性。該策略的另一個優(yōu)勢是，可以優(yōu)先選擇在公認安全的物種或菌種的基因組中調(diào)取想要的酶類基因，在畢赤酵母等可用于食品酶制劑制備的系統(tǒng)中進行高效表達，從而使產(chǎn)物酶類更可能應用于食品加工等領域。

2.2 殼聚糖酶BACSN酶學性質(zhì)初步鑒定

使用DNS法測定發(fā)酵上清中粗酶的活力。結果顯示，該酶的最適pH值為5.0（圖2A），最適反應溫度為45 ℃（圖2B），在上述最適反應條件下的比酶活力為52.2 U/mL。熱穩(wěn)定性測定結果顯示，該酶在50 ℃及以下時較穩(wěn)定，處理1 h后酶活力沒有明顯較低，當溫度升高至60 ℃時，該酶很快失活（圖2C）。與段靜等[13]表達的來源于解淀粉芽孢桿菌菌株HZ-1510殼聚糖酶相比，最適反應溫度及pH值均存在一定差異，可能與來源菌株不同的生存環(huán)境相關。上述酶學特征使BACSN具有一定工業(yè)應用前景，可能應用于殼寡糖的規(guī)模制備。一般而言，在殼聚糖水解制備殼寡糖過程中，需要首先使用乙酸、乳酸或鹽酸等對其溶解，此時殼聚糖底物的pH值一般為4.0～7.0，適合BACSN發(fā)揮最佳活性；當pH值大于7.0時，殼聚糖很容易形成沉淀，影響酶類的水解效率。殼聚糖水解產(chǎn)物殼寡糖中暴露的氨基較活潑，在高溫時容易發(fā)生褐變，因此，水解制備殼寡糖的反應溫度通常在50 ℃以下，而BACSN在此溫度下較穩(wěn)定。

圖 2 pH值（A）、溫度（B）對殼聚糖酶BACSN的影響及其熱穩(wěn)定性（C）Fig. 2 Effects of pH value (A) and temperatures (B) on the activity of chitosanase BACSN and its thermostability (C)

2.3 殼聚糖酶BACSN水解產(chǎn)物組成及末端結構特征分析

使用畢赤酵母分泌表達的殼聚糖酶BACSN對前期制備的脫乙酰度62%的殼聚糖底物進行水解。MALDITOF MS檢測及分析結果顯示，水解物中包含聚合度3～15不同脫乙酰度的殼寡糖（圖3）。與水解高脫乙酰度殼聚糖僅主要產(chǎn)生全脫乙酰的殼寡糖不同的是，水解低脫乙酰度底物可以獲得更加復雜多樣的組分，除GlcN（D）外，這些新組分中帶有不同數(shù)量及分布的GlcNAc（A）單元，可能與動植物細胞的特定受體或結合蛋白，如植物的幾丁質(zhì)受體[20-23]、動物的甘露糖受體[24-25]及幾丁質(zhì)酶樣結合蛋白YKL39[26]和YKL40[27]等結合發(fā)揮生物活性。不僅如此，酶法水解低脫乙酰度殼聚糖底物時，因GlcNAc的存在，酶的水解位點相對減少，可以獲得更高聚合度的殼寡糖，而充分酶解高脫乙酰度殼聚糖時，便很難得到聚合度高于6的殼寡糖。有研究發(fā)現(xiàn)，只有聚合度大于6的幾丁寡糖或者幾丁質(zhì)才能與其植物受體AtCERK1結合并促進其形成二聚或寡聚體而產(chǎn)生免疫激活活性[28]。部分脫乙酰的復雜殼寡糖可能也與這些專一性識別GlcNAc單元的受體結合，因該類型殼寡糖乙?；奶菃卧扛?，聚合度要求可能更高。Einarsson等[29]在研究人骨關節(jié)炎軟骨細胞表面的受體YKL-40與幾丁寡糖及部分脫乙酰殼寡糖的結合能力時發(fā)現(xiàn)，幾丁六糖（A6）與該受體親和力較強，部分脫乙酰殼寡糖D2A4及D3A3也可與該受體結合，但親和力較弱；使用較高聚合度的低脫乙酰度殼寡糖D5A6時發(fā)現(xiàn)，其與受體的親和力與幾丁六糖相當。上述研究結果也提示，低脫乙酰殼寡糖因其含有乙?；瘑翁菃卧揖酆隙容^高，可能與特定動植物受體結合發(fā)揮先天免疫激活等生物活性。與較高聚合度的幾丁寡糖相比，低脫乙酰度殼寡糖可以通過酶法規(guī)?；苽淝姨囟ɑ钚钥赡鼙葌鹘y(tǒng)殼寡糖更高，因而具有更廣闊的應用前景。

圖 3 酶解產(chǎn)物MALDI-TOF MS分析Fig. 3 MALDI-TOF MS spectrum of hydrolysate

進一步使用液體1H NMR及13C NMR對酶解產(chǎn)物殼寡糖的還原及非還原末端結構特征進行鑒定，結果顯示，還原末端及非還原末端均主要由GlcN（D）組成，說明該酶主要水解GlcN-GlcN糖苷鍵（圖4）。根據(jù)殼聚糖酶對部分脫乙酰殼聚糖水解位點的差異，可將其分為3 個亞類：I類可同時水解糖苷鍵GlcN-GlcN及GlcNAc-GlcN，II類僅能水解糖苷鍵GlcN-GlcN，而III類可同時水解水解糖苷鍵GlcN-GlcN及GlcN-GlcNAc[2]。因此，推測BACSN屬于I類殼聚糖酶，這也與MALDI-TOF MS的數(shù)據(jù)較好的對應：因水解僅發(fā)生于GlcN-GlcN，產(chǎn)生的寡糖兩端至少均帶有一個GlcN，因此，所有的殼寡糖均應含有至少兩個GlcN，質(zhì)譜的分析結果中所有殼寡糖均符合該要求。酶解產(chǎn)物的兩端不應該存在GlcNAc組分，但NMR的分析結果顯示，這些組分仍然在末端少量存在，推測可能是在弱酸（pH 6.0）及較高溫度（40 ℃）反應條件下，同時發(fā)生了一定程度的酸降解。

制備較高聚合度低脫乙酰度殼寡糖是該領域研發(fā)的新方向。使用化學法將傳統(tǒng)殼寡糖重新乙酰化也可以獲得低脫乙酰度殼寡糖，但聚合度仍然較低，且難以實現(xiàn)規(guī)模制備。以低脫乙酰度殼聚糖為底物，使用具有殼聚糖水解活性的酶類，如殼聚糖酶、幾丁質(zhì)酶及非特異性商品酶等，利用其差異的底物識別特性，可以制備不同末端結構特征的殼寡糖。理論上，通過底物脫乙酰度的控制，結合特定酶的水解，可實現(xiàn)產(chǎn)物聚合度的調(diào)控。因此，基于上述策略，可實現(xiàn)殼寡糖聚合度、脫乙酰度及乙?；稽c等結構特征的調(diào)控。已在前期利用幾丁質(zhì)酶水解制備了特定結構特征的低脫乙酰度殼寡糖[30]，后期將對本研究及前期制備的不同結構特征殼寡糖組分的活性進行評價。

圖 4 酶解產(chǎn)物1H NMR（A）及13C NMR（B）分析Fig. 4 1H-NMR (A) and 13C NMR (B) spectra of hydrolysis products

3 結 論

本研究利用全基因合成方法合成并在畢赤酵母中分泌表達了來源于解淀粉芽孢桿菌的殼聚糖酶并對其酶學性質(zhì)進行鑒定。同時，利用該酶水解低脫乙酰度殼聚糖制備低脫乙酰度殼寡糖并對其組成及結構特征進行鑒定，結果顯示，酶解產(chǎn)物中含有聚合度3～15不同脫乙酰度的殼寡糖，且還原及非還原端均主要由GlcN單元構成。與傳統(tǒng)殼寡糖相比，BACSN水解低脫乙酰度殼聚糖制備的新型殼寡糖具有更復雜的組成且具有特定的結構特征，可能具有更高或者新的生物活性。后續(xù)將對這些組分進行分離并對其生物活性進行更深入研究。