香氣指紋圖譜應(yīng)用于山西老陳醋的身份識別

王紅廣，安 娜，車建途,2,*

（1.北京威力格生物科技有限公司，北京 102200；2.北京威力格生物健康科學(xué)研究院，北京 102200）

香氣成分是決定食醋風(fēng)味品質(zhì)的重要因素，其來源幾乎覆蓋到食醋釀造的各個階段[1]。研究發(fā)現(xiàn)，不同原料、不同生產(chǎn)工藝的食醋樣品，香氣成分差異明顯[2-8]，且香氣成分種類和含量的差異是造成食醋風(fēng)味和質(zhì)量不同的主要因素[9-10]，所以香氣成分組成是食醋樣品自身特性的重要體現(xiàn)。

山西老陳醋風(fēng)味獨特，是我國食醋最具代表性的產(chǎn)品之一[11]。通過香氣成分的特異性突出其身份特性，是目前山西老陳醋特征性研究的一個方向。雖然已有文獻(xiàn)[12-14]描述了山西老陳醋與其他名醋香氣成分之間的差異，但并未突出香氣組成對其身份識別的重要性，也未尋求到有效的識別方法或統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

食醋指紋圖譜技術(shù)近年逐步引起重視[15-20]。指紋圖譜技術(shù)可通過對食醋的特有品質(zhì)如香氣、元素組成、形狀、色澤等進(jìn)行技術(shù)處理后實現(xiàn)對產(chǎn)品身份的分析識別，突出其唯一性[21]。聚類分析法是一種常用的指紋圖譜技術(shù)質(zhì)量評價方法，對沒有樣本所屬類別信息的物質(zhì)，以分類圖的形式進(jìn)行直觀地系統(tǒng)分析[22]，適用于對大批量樣品進(jìn)行快速分類或身份識別[23]。

頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用法是目前香氣成分分析研究的主要測試方法[23-29]。由于香氣成分對于食醋樣品的風(fēng)味貢獻(xiàn)不僅取決于含量還與其嗅覺閾值有關(guān)，所以目前多結(jié)合嗅探法研究食醋的風(fēng)味表現(xiàn)[2,30]，但是利用嗅探法對一種食醋樣品的身份識別操作過于復(fù)雜，且?guī)в幸欢ǖ闹饔^性。實驗以傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，選取4 種具有代表性品牌的山西老陳醋樣品為研究對象，以其他名醋代表性樣品作為對照，采用HS-SPME-GC-MS法進(jìn)行香氣測試和定性定量分析，建立山西老陳醋香氣指紋圖譜，結(jié)合聚類分析法及其香氣特性，以期實現(xiàn)對山西老陳醋樣品快速準(zhǔn)確的身份識別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有食醋樣品均以傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)為篩選條件，共篩選9 款山西老陳醋樣品，源自于山西老陳醋的4 個代表性品牌廠家，分別為水塔、紫林、東湖和寧化府，其中水塔醋包含不同類型的山西老陳醋樣品，包括2 個不同批次的老醋坊原醋、2 個不同陳釀期（1 a陳釀和5 a陳釀）的市售醋、1 個八一原醋和1 個1 a陳釀原醋；對照樣品為保寧醋、鎮(zhèn)江香醋、永春老醋3 大名醋的各1～2 款代表性樣品（表1）。水塔醋樣品由山西水塔集團(tuán)總部提供，其他食醋樣品均購于各品牌指定天貓旗艦店。

表 1 食醋樣品Table 1 Vinegar samples tested in this study

糠醛、4-乙基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚、5-甲基糠醛、糠醇、3-羥基-2-丁酮、2-甲基丙醇、4-乙基苯酚、香蘭素、2,3-丁二醇、辛酸、庚酸、己酸、苯乙醇、苯甲醛、丁二酸二乙酯、3-甲基丁酸（異戊酸）、苯甲酸、苯乙酸、乙酸乙酯、乙酸糠酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯、3-甲基丁醛、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、二甲基二硫醚美國Sigma公司；乙酸（色譜純） 美國Themo Fisher公司；丙酮、乙醇、苯酚、氯化鈉（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HS-SPME儀、PDMS/CAR/DVB復(fù)合（50 μm）SPME萃取頭 美國Supelco公司；7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

向15 mL樣品瓶中加入8 mL樣品、2.5 g NaCl和磁力轉(zhuǎn)子，迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的樣品瓶蓋擰緊，置于磁力攪拌加熱臺上，控制溫度60 ℃，攪拌加熱15 min，樣品瓶中的氣-液相香氣物質(zhì)達(dá)到平衡后，將已活化處理的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分（萃取頭距離液面1 cm）進(jìn)行萃取，在60 ℃提取40 min，然后將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，在250 ℃熱解吸5 min。每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent J&W HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min；固相微萃取手動進(jìn)樣，采用不分流模式，插入GC的進(jìn)樣口，進(jìn)樣口溫度250 ℃，熱解吸時間5 min；柱溫箱的升溫程序為40 ℃保持5 min后以5 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持10 min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜接口溫度為220 ℃，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，電離方式為電子電離，離子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍為45～500 u。

1.3.4 定量和定性分析

定性方法：有標(biāo)準(zhǔn)品的成分利用標(biāo)準(zhǔn)品、保留時間和質(zhì)譜統(tǒng)一定性。將標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)利用蒸餾水稀釋成適當(dāng)濃度，按照1.3.1節(jié)方法測定保留時間和質(zhì)譜信息；無標(biāo)準(zhǔn)品的成分以保留時間和質(zhì)譜進(jìn)行定性，且僅篩選質(zhì)譜NIST 11檢索結(jié)果中匹配度不小于70%的物質(zhì)為定性成分。

定量方法：絕對含量以峰面積表示，相對含量按照峰面積歸一化法進(jìn)行計算。

1.3.5 對照譜圖建立和共有峰匹配

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）建立每個食醋樣品的對照譜圖和匹配不同食醋樣品的共有指紋峰。按照圖1操作流程：1）將每個食醋樣品平行3 次測試的樣品譜圖導(dǎo)入到相似度評價軟件中，按照保留時間匹配共有峰，時間窗寬度設(shè)置為0.1 min，并按照平均值法生成對照譜圖；2）將不同食醋樣品的對照譜圖導(dǎo)入到相似度評價軟件中，同樣按照保留時間匹配共有峰，時間窗寬度設(shè)置為0.1 min，并根據(jù)香氣成分定性結(jié)果進(jìn)一步篩選確定最終的共有指紋峰。

圖 1 食醋樣品對照譜圖建立和共有峰匹配操作流程Fig. 1 Flowchart for the construction of reference fingerprint

1.4 數(shù)據(jù)分析

作圖和數(shù)據(jù)分析：采用Origin 9.1軟件結(jié)合Excel 2007。

層次聚類分析：依據(jù)樣品峰面積本身所具有定量的特征對大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分組歸類以了解數(shù)據(jù)集的內(nèi)在結(jié)構(gòu)[31]。聚類分析的數(shù)據(jù)處理方法采用空間伸縮性表現(xiàn)較好的組平均距離法[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西老陳醋香氣指紋圖譜

2.1.1 方法重復(fù)性考察結(jié)果

由于檢測到的食醋香氣成分復(fù)雜多樣，不同的香氣成分含量差異很大（圖2），而乙酸作為所有食醋樣品共性成分，含量普遍較高，以乙酸的保留時間和相對含量的變異系數(shù)考察方法的重復(fù)性。選擇老醋坊原醋樣品S2，連續(xù)平行進(jìn)樣6 次，計算乙酸保留時間和相對含量的變異系數(shù)（表2）。乙酸保留時間變異系數(shù)為0.05%，說明方法在成分保留時間定性方面較為穩(wěn)定，有利于指紋圖譜共有峰的匹配；乙酸相對含量變異系數(shù)為6.67%，與文獻(xiàn)[33]結(jié)果相符，方法重復(fù)性較為理想。另外，相對于中藥指紋圖譜分析方法精密度控制不大于5%[34]的要求，乙酸含量變異系數(shù)相對偏高，可能原因是香氣成分本身揮發(fā)性較大，種類又多，其在SPME萃取頭涂層上的分配系數(shù)和傳質(zhì)速率又受溫度和時間的影響[35]，所以溫度波動、時間控制、人為操作等因素都有可能造成測試誤差。目前香氣成分測試的文獻(xiàn)報道[2-8]普遍采用3～5 次平行測試的平均值作為最終測試結(jié)果。

圖 2 山西老陳醋樣品GC-MS譜圖Fig. 2 GC-MS chromatogram of SAV

表 2 方法重復(fù)性分析Table 2 Repeatability of GC-MS

2.1.2 山西老陳醋香氣指紋圖譜的建立

研究[36]發(fā)現(xiàn)，山西老陳醋的香氣成分主要來源于生產(chǎn)原料和釀造過程，取決于功能微生物的代謝活動，受控于生產(chǎn)條件對群體微生物代謝反應(yīng)及后處理化學(xué)反應(yīng)的調(diào)節(jié)，所以不同品牌或類型山西老陳醋樣品由于部分生產(chǎn)條件的不同，香氣組成會存在一定的差異（圖3），口感和風(fēng)味也略有不同。山西老陳醋代表性的風(fēng)味特征應(yīng)該是所有山西老陳醋樣品的共有特性，所以利用9 款山西老陳醋樣品的共有香氣成分建立其香氣指紋圖譜更具有說服力。將首先將9 款山西老陳醋樣品按照1.3.5節(jié)進(jìn)行共有峰匹配，并生成對照譜圖，各成分含量按照對照譜圖峰面積的歸一化法進(jìn)行相對計算。9 款樣品共匹配到82 個共有峰（圖4），按照1.3.4節(jié)對共有峰進(jìn)一步定性和篩選，最后確認(rèn)44 種山西老陳醋共有香氣成分，包含酸類、醇類、酯類、醛酮類、雜環(huán)類、其他6 大類（表3）。

圖 3 9 款山西老陳醋樣品的對照譜圖Fig. 3 Reference chromatograms of 9 SAVs

圖 4 山西老陳醋共有峰匹配結(jié)果Fig. 4 Matching of peaks common to 9 SAVs

表 3 山西老陳醋的共有香氣成分Table 3 Aroma components common to 9 SAVs

續(xù)表3

山西老陳醋定性的44 種共有香氣成分相對總含量占89.32%，具有代表性。根據(jù)表3 種各香氣成分的保留時間和平均峰面積，繪制山西老陳醋的共有香氣成分分布圖（圖5），以此作為山西老陳醋的香氣指紋圖譜。

對比山西老陳醋各類香氣成分的數(shù)量和含量（圖6），由于乙酸的存在，酸類物質(zhì)含量明顯較高，但數(shù)量并不多，其他酸類物質(zhì)含量也普遍較低；在酸味的基礎(chǔ)上，雜環(huán)類物質(zhì)無論數(shù)量或含量均占優(yōu)勢，風(fēng)味表現(xiàn)以堅果味、烤香味為主，很可能是山西老陳醋風(fēng)味特性的主要體現(xiàn)；醇類物質(zhì)數(shù)量和含量僅次于雜環(huán)類物質(zhì)，風(fēng)味以堅果味、醇香味、花香為主；醛酮類物質(zhì)雖然種類較多，但含量偏低，風(fēng)味表現(xiàn)同樣以堅果味、咖啡香為主；酯類物質(zhì)總含量與醛酮類物質(zhì)相當(dāng)，風(fēng)味則以花香味、果香為主；酚類物質(zhì)和其他類物質(zhì)雖然種類和含量均不高，但也賦予了山西老陳醋更加豐富的風(fēng)味特征。

圖 5 山西老陳醋香氣指紋圖譜Fig. 5 Aroma fingerprint of SAV

圖 6 山西老陳醋各類共有香氣成分的數(shù)量和相對含量Fig. 6 Number and relative contents of aroma components common to 9 SAVs

2.2 山西老陳醋的身份識別

2.2.1 聚類分析

選擇四大名醋的其他名醋作為對照樣品，通過香氣成分的對比突出山西老陳醋的身份特性。以山西老陳醋香氣指紋圖譜作為參照樣品（記為R），利用共有香氣對所有山西老陳醋樣品和對照樣品進(jìn)行聚類分析（圖7）。當(dāng)距離閾值取0.018＜λ＜0.064時，食醋樣品可以分為四大集合，分別為{S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，R}、{S11}、{S12，S13}和{S10}，對應(yīng)的正好是山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋、永春老醋和保寧醋，并且與參照樣品R同一個集合的所有樣品均屬于山西老陳醋樣品，所以山西老陳醋香氣指紋圖譜具有一定代表性，在適當(dāng)閾值條件下，可以實現(xiàn)對山西老陳醋樣品的身份識別；而當(dāng)閾值λ＞0.064時，其他名醋樣品也與山西老陳醋樣品歸為一類，所以聚類分析用于山西老陳醋樣品的身份識別還存在一定的模糊性，需要考慮設(shè)定合適的閾值。由此可見，聚類分析法能夠?qū)崿F(xiàn)對山西老陳醋樣品身份的模糊識別，可以作為其身份識別的一個重要參考。

2.2.2 香氣風(fēng)味特性分析

分析山西老陳醋44 種共有香氣（表3），首先乙酸作為食醋樣品主要的呈味物質(zhì)對風(fēng)味影響較大[38]，是酸性風(fēng)味的代表；其次共有香氣中還有兩大主要風(fēng)味類型，分別為以咖啡香、堅果香、烤香味為代表的較為濃厚型香氣風(fēng)味和以果香、花香為代表的清新型香氣風(fēng)味。共有香氣成分中3 種主要風(fēng)味類型代表性香氣（表4）的總數(shù)和總含量分別占45.5%和73.3%（相對于共有香氣總數(shù)和總含量進(jìn)行計算），比重較大，所以三者的組成和比例關(guān)系很可能是山西老陳醋香氣特性的重要體現(xiàn)。

表 4 山西老陳醋3 大主要風(fēng)味類型的代表性香氣Table 4 Representative aroma components of three main flavor types of SAV

分別計算各山西老陳醋樣品中的乙酸含量（記為A值）、9 種濃厚型香氣總含量（記為D值）、10 種清新型香氣總含量（記為F值），并與對照樣品進(jìn)行對比（圖8）。乙酸含量山西老陳醋與永春老醋樣品含量相對較高，而保寧醋和鎮(zhèn)江香醋含量相對較低；清新型香氣含量永春老醋樣品含量明顯較高，其次是鎮(zhèn)江香醋，山西老陳醋與保寧醋相對較低；濃厚型香氣永春老醋含量明顯低于其他名醋，而不同的山西老陳醋樣品間含量差異也比較明顯。由此可見，四大名醋香氣成分中的A值、D值和F值的分配比例各不相同，其中山西老陳醋在A值與D值方面稍占優(yōu)勢，而F值相對較弱，即山西老陳醋相對于其他名醋在酸性風(fēng)味和濃厚型風(fēng)味特性表現(xiàn)更為突出。

圖 8 不同醋樣間A、D、F值對比Fig. 8 A, D and F values of different vinegar samples

為更加直觀突出山西老陳醋的優(yōu)勢香氣特性，實驗將山西老陳醋具有優(yōu)勢的A值和D值相乘，并除以相對較弱的F值，然后將其結(jié)果的100 倍作為一個山西老陳醋的香氣特性參數(shù)（記為P值），計算公式如下：

另外，由于3 種風(fēng)味類型參數(shù)中A值所占比重相對較高，且各樣品間A值的差異化也相對較小，所以實驗進(jìn)一步將A值差異化進(jìn)行了放大，將P值計算公式中的A值替換為A2值，作為另一個香氣特性參數(shù)（記為Ps值），計算公式如下：

分別對比山西老陳醋樣品和對照樣品的P值和Ps值（圖9），可見P值和Ps值均明顯放大了山西老陳醋與其他名醋的差異化，且突顯出了所有山西老陳醋樣品，其中Ps值突顯效果更好；所有山西老陳醋樣品的Ps值均在5以上，而其他名醋Ps值均趨近于0，所以Ps值也可以作為山西老陳醋樣品身份識別的一個參考因子。相比前文香氣指紋圖譜的聚類分析，Ps值缺少了整體香氣類型的對比信息，但在一定程度上卻彌補(bǔ)了聚類分析的模糊性，選擇性更高。所以香氣特性參數(shù)Ps值可以作為聚類分析的補(bǔ)充，提高對山西老陳醋樣品身份識別的準(zhǔn)確性和可靠性。

圖 9 不同醋樣P值（A）和Ps值（B）對比Fig. 9 P (A) and Ps (B) values of different vinegar samples

3 討 論

目前，市場上銷售的山西老陳醋類型日漸繁多，口味也具有多樣性，為突出山西老陳醋的獨特性，實驗篩選9 款不同類型的山西老陳醋樣品，且以傳統(tǒng)工藝釀造的手工醋為主，以此來建立山西老陳醋的香氣指紋圖譜并突出其風(fēng)味特征更具有代表性和說服力。

實驗通過指紋圖譜共有峰匹配與定性定量分析結(jié)合的方式，篩選出44 種山西老陳醋的共有香氣成分，并以此建立山西老陳醋香氣指紋圖譜。通過香氣風(fēng)味特性分析，山西老陳醋相對于其他名醋在酸性和濃厚型風(fēng)味相對突出，而清新型風(fēng)味相對較弱。根據(jù)山西老陳醋香氣指紋圖譜和主要風(fēng)味類型特點，實驗建立了一個快速準(zhǔn)確識別山西老陳醋身份的方法，即首先利用香氣指紋圖譜的聚類分析對樣品進(jìn)行模糊識別，然后利用香氣特性參數(shù)Ps值進(jìn)一步比較篩選，確認(rèn)山西老陳醋樣品的身份。

在食醋工業(yè)高速發(fā)展的今天，山西老陳醋香氣指紋圖譜的身份識別功能具有廣泛的應(yīng)用前景，如可用于輔助真?zhèn)舞b定，也可用于生產(chǎn)中產(chǎn)品風(fēng)味的質(zhì)量控制，同時也有助于山西老陳醋質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定。當(dāng)然，由于實驗研究的樣品數(shù)量和種類有限，而山西老陳醋樣品成分復(fù)雜多樣[36]，不同成分的分析方法也不同，要建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，還需要更多的研究數(shù)據(jù)。