便攜式葡萄專用可見-近紅外光譜檢測儀器開發(fā)與實(shí)驗(yàn)

肖 慧，孫 柯，屠 康，潘磊慶*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

果蔬品質(zhì)安全檢測主要包括對果蔬外部品質(zhì)、內(nèi)部品質(zhì)及食用安全性的測定及評估，其中果蔬的內(nèi)部品質(zhì)檢測是果蔬流通中的重要環(huán)節(jié)之一[1]。傳統(tǒng)的果蔬內(nèi)部品質(zhì)檢測方法主要是抽樣進(jìn)行破壞性實(shí)驗(yàn)，檢測成本高，而且測量每種參數(shù)都需要進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)，不能夠滿足果蔬快速分級分選及品質(zhì)指標(biāo)預(yù)測的現(xiàn)實(shí)要求。同時(shí)，傳統(tǒng)的品質(zhì)檢測方法無法完成多指標(biāo)同時(shí)檢測，耗時(shí)耗力[2-4]?，F(xiàn)如今，越來越多的無損檢測技術(shù)被應(yīng)用于果蔬的品質(zhì)檢測中，其中，近紅外光譜技術(shù)備受關(guān)注。近紅外光譜的光譜區(qū)域范圍為800～2 500 nm，該譜區(qū)承載的分析信息主要是分子含氫基團(tuán)振動(dòng)的倍頻和合頻，因此可充分利用全譜或多波長下的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性或定量分析[5]?，F(xiàn)代近紅外光譜分析是光譜測量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)與基礎(chǔ)測試技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，通過將近紅外光譜所反映樣品基團(tuán)、組成或物態(tài)信息與用標(biāo)準(zhǔn)或認(rèn)可的參比方法測得的組成或性質(zhì)數(shù)據(jù)采用化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)建立校正模型，然后通過對未知樣品光譜的測定和建立的校正模型完成快速預(yù)測其組成或性質(zhì)的一種分析方法[6]。

近年來，近紅外檢測技術(shù)作為一種無損、快速分析和評估各類食品質(zhì)量與安全的方法，得到了廣泛認(rèn)可。近紅外光譜技術(shù)發(fā)展迅速，微型化的光譜儀已成為快速分析研究的重點(diǎn)，因其具備體積小、重量輕、價(jià)格低和高性能等特點(diǎn)，為現(xiàn)代食品、藥品、日用品等領(lǐng)域的快速檢測提供了有力的支撐[7]。同時(shí)因近幾年光譜技術(shù)的迅猛發(fā)展，實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的硬件更為多樣，使得設(shè)計(jì)開發(fā)不同用途的近紅外儀器更易于實(shí)現(xiàn)，其中針對不同樣品的專用檢測設(shè)備成為現(xiàn)今近紅外應(yīng)用的熱點(diǎn)，是將近紅外研究由理論轉(zhuǎn)為應(yīng)用的關(guān)鍵一步，對于促進(jìn)近紅外技術(shù)的發(fā)展有極其重要的作用。郭志明等[8]基于新型光譜儀微機(jī)電系統(tǒng)開發(fā)了果蔬品質(zhì)手持式近紅外設(shè)備，能完成對番茄中可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）及番茄紅素的預(yù)測。馮幫等[9]利用線性漸變?yōu)V光片作為分光原理開發(fā)了小型近紅外檢測系統(tǒng)。聞明等[10]研制了以發(fā)光二極管為近紅外光源的整粒小麥成分快速分析儀器。王凡等[11]基于可見-近紅外光譜技術(shù)開發(fā)的便攜式番茄多品質(zhì)檢測裝置可對番茄的顏色、硬度、總酸、總糖實(shí)現(xiàn)快速無損的同時(shí)檢測。李倩倩等[12]利用自搭建的獼猴桃SSC便攜式無損檢測系統(tǒng)對多個(gè)品種的獼猴桃糖度進(jìn)行了預(yù)測。尹慧敏等[13]設(shè)計(jì)開發(fā)的便攜式谷物成分近紅外檢測儀對水稻的測試實(shí)驗(yàn)中得到蛋白質(zhì)的預(yù)測與真實(shí)值相關(guān)系數(shù)為0.747 1，其結(jié)果進(jìn)一步證明了便攜式食品近紅外檢測儀的可行性。

葡萄的采后處理、品質(zhì)鑒定檢測一直是農(nóng)產(chǎn)品加工研究的重要課題，采用近紅外光譜技術(shù)建立的葡萄品質(zhì)預(yù)測模型良好，F(xiàn)ernanez-Novales等[14]利用光纖型近紅外光譜儀研究白葡萄酒發(fā)酵液中的干物質(zhì)及糖分變化，Nogales-Bueno等[15]利用近紅外光譜確定葡萄的成熟度，Hernandez-Hierro等[16]基于近紅外光譜信息研究葡萄成熟過程總的花青素變化，Urraca等[17]利用手持式近紅外設(shè)備對田間整穗葡萄的糖度檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明便攜式近紅外設(shè)備對田間葡萄穗品質(zhì)檢測的可行性。本實(shí)驗(yàn)主要研究基于光纖可見-近紅外技術(shù)的低成本、小型葡萄專用品質(zhì)預(yù)測儀器的開發(fā)，并選用“美人指”和“白玉霓”兩個(gè)品種對儀器進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圖 1 “美人指”葡萄（A）及“白玉霓”葡萄（B）Fig. 1 Manicure Finger (A) and Ugni Blanc (B)

“美人指”葡萄（Vitis vinifera L. cv. Manicure Finger）和白色的“白玉霓”葡萄（Vitis vinifera L. cv.Ugni Blanc）（如圖1所示，采集不同成熟期的每種葡萄各200 粒），采自江蘇南京八卦洲（32°5′N，118°8′E，南京）。

圖 2 葡萄品質(zhì)可見-近紅外檢測儀器Fig. 2 Vis-NIR instrument for examining grape quality

圖 3 工作流程圖Fig. 3 Flow chart of the working process

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、HCl、乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PAL-1手持糖度儀 日本愛拓公司；Ci6X手持色差儀美國愛色麗公司；UV 1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；FX2000型光譜儀、FIB-Y-200-NIR光纖、HL2000光源、STD-WS校正白板 上海復(fù)享公司；Surface Pro3平板電腦 美國微軟公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄品質(zhì)近紅外快速檢測系統(tǒng)硬件

1.3.1.1 葡萄品質(zhì)近紅外快速檢測系統(tǒng)工作原理

本研究設(shè)計(jì)的葡萄品質(zhì)可見-近紅外檢測儀器，采用漫反射模式獲取整粒葡萄漿果的可見-近紅外光譜（400～1 100 nm），光纖傳輸將攜帶葡萄品質(zhì)信息的光信號輸入光譜儀后經(jīng)數(shù)據(jù)采集卡，進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換（A/D）后傳輸?shù)狡桨咫娔X，最后在平板電腦上完成光譜的還原及數(shù)據(jù)處理。儀器硬件部分主要包括：光源、光纖光譜儀、傳輸光纖、樣品池、掌上電腦和殼體，如圖2所示。儀器工作流程如圖3所示。

1.3.1.2 光譜采集模塊

市售的光譜儀根據(jù)分光系統(tǒng)的不同大致可分為傅里葉變換型、聲光可調(diào)濾光型、濾光片型、光柵型4 大類。分光系統(tǒng)的性能決定近紅外光譜儀包括光譜分辨率、波長準(zhǔn)確性和波長重復(fù)性在內(nèi)的多個(gè)核心參數(shù)[18]。波長范圍是選擇光譜儀的重要參考衡量指標(biāo)之一，而波長范圍的選擇因測試樣品種類、狀態(tài)、需預(yù)測的指標(biāo)的不同而不同，對于葡萄而言，Beghi等[19]曾利用可見-近紅外光譜對葡萄的植物檢疫狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測評估，Martinez-Sandoval等[20]使用近紅外高光譜對單粒葡萄果粒的花青素含量進(jìn)行建模預(yù)測。Kemps等[21]利用可見-近紅外光譜對多個(gè)葡萄品種中包含花青素、多酚含量、總糖含量及硬度在內(nèi)的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行建模預(yù)測，在本儀器中，考慮成本、穩(wěn)定性、建?？煽啃缘榷鄠€(gè)因素后，選擇400～1 100 nm作為指標(biāo)檢測的建模波段。

微型光纖光譜儀一般采用衍射光柵作為分光系統(tǒng)，影響分光效果的主要因素是光柵的角色散和線色散參數(shù)，光柵的色散越大，分光效果越好。為提高光譜儀的光學(xué)特性，很多光譜儀采用非對稱交叉式Czemy-Turner結(jié)構(gòu)，但該結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，且依然存在雜散光水平較高的問題[22]。本系統(tǒng)選用微型光纖光譜儀作為系統(tǒng)的核心器件，新型全息凹面光柵使用了非等距分布的的凹槽，沒有鬼線，雜散光很低，使光柵分光系統(tǒng)的光學(xué)性能有較大提升，同時(shí)降低了系統(tǒng)復(fù)雜度，具備光路簡潔、體積小、便于安裝等優(yōu)點(diǎn)[23]。

該光譜儀的原理是光源發(fā)出的光先經(jīng)過樣品池，再由光柵分光，光柵不需轉(zhuǎn)動(dòng)，經(jīng)光柵色散的光聚焦在多通道檢測器的焦面上，同時(shí)被檢測。在可見-短波近紅外區(qū)域使用電荷耦合器件作為檢測器，通道數(shù)達(dá)2 048 個(gè)，可獲得很好的分辨率。由于檢測器對所有波長的單色光同時(shí)檢測，掃描速率大大提升，在1 s內(nèi)可完成上百次的掃描累加，從而得到較高的信噪比和靈敏度。

1.3.1.3 光源及光傳輸模塊

光源的發(fā)光范圍決定了光譜儀的工作波長范圍，對近紅外儀器中的光源系統(tǒng)的基本要求是能在測量譜區(qū)內(nèi)保證足夠的光強(qiáng)和穩(wěn)定性，以保證光譜的穩(wěn)定性。本系統(tǒng)采用鹵素?zé)?，鹵素?zé)艄庠赐瑫r(shí)包含可見光區(qū)域和近紅外光區(qū)域，能滿足可見-近紅外光譜儀的需求，同時(shí)性能穩(wěn)定。

本系統(tǒng)中的光傳輸通過低OH的Y型石英光纖傳導(dǎo)，適合于漫反射模式，光纖利用全反射的原理把光約束在其界面內(nèi)，并引導(dǎo)光波沿著光軸線的方向前進(jìn)[24]。Y型光纖雙頭端的一頭連接光源，將光源發(fā)出的光傳輸至單頭端，光從單頭端發(fā)出照射到樣品后與樣品作用，漫反射的光被單頭端接收傳輸至雙頭端的另一頭進(jìn)入光譜儀被分析。

1.3.1.4 樣品池模塊

考慮到檢測對象為單粒葡萄漿果，檢測光纖頭與葡萄漿果表面的距離直接影響樣本光譜的可靠性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，光纖頭貼近樣本表面的測量方式能最大程度降低照射光斑不一樣帶來的實(shí)驗(yàn)誤差。由于不同品種的葡萄果粒之間存在形狀和大小的差異，為滿足不同品種葡萄的測定需求，本系統(tǒng)設(shè)計(jì)了可調(diào)式支撐模塊，用于調(diào)整不同大小的樣品表面至光纖檢測端的距離，保持光斑大小一致，如圖4所示。通過調(diào)節(jié)帶有內(nèi)螺紋的樣品架控制樣品表面距離光纖端口的距離，極大地減小了由于光斑大小不一致帶來的實(shí)驗(yàn)誤差。

圖 4 葡萄測定專用樣品池Fig. 4 Designed sample cuvette for grape berries

1.3.2 便攜式葡萄多品質(zhì)無損檢測儀器軟件開發(fā)

軟件系統(tǒng)包括：黑白背景校正、干涉圖數(shù)據(jù)采集、光譜顯示、數(shù)據(jù)分析處理、數(shù)據(jù)保存及管理四大功能模塊。軟件基于Windows系統(tǒng)采用C#撰寫，通過USB通訊功能控制光譜儀完成對樣品光譜的采集，采集到的干涉圖經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理后可還原為光譜數(shù)據(jù)并進(jìn)行計(jì)算分析。將自動(dòng)將背景光譜設(shè)定為0%，白板光譜設(shè)定為100%，待背景光譜及白板光譜采集完成后才可進(jìn)行樣品光譜的采集，采集到的光譜數(shù)據(jù)與背景光譜及白板光譜進(jìn)行計(jì)算后，軟件界面會顯示光譜反射率數(shù)據(jù)圖像。

在數(shù)據(jù)采集模塊中，用戶可根據(jù)不同的葡萄品種設(shè)定不同的積分時(shí)間參數(shù)及平滑窗口數(shù)，實(shí)現(xiàn)儀器利用的最大化。光譜模型采用最小二乘-支持向量機(jī)（least squares support vector machine，LS-SVM）回歸建立，相較于常規(guī)的偏最小二乘回歸[25]能提供更好的預(yù)測結(jié)果，更小的預(yù)測偏差。通過該系統(tǒng)測得的光譜數(shù)據(jù)可批量以.txt格式保存，此設(shè)計(jì)更便于日后的模型更新及完善。

1.3.3 光譜數(shù)據(jù)的采集

利用可見-近紅外系統(tǒng)完成對所有果粒樣本可見-近紅外光譜的采集，光源強(qiáng)度為9 W，光譜波段為400～1 100 nm，積分時(shí)間為4 ms，采樣平均次數(shù)為10 次，光譜分辨率為0.38 nm。以每個(gè)葡萄果粒赤道上間隔180°的兩個(gè)點(diǎn)作為采樣點(diǎn)，這兩點(diǎn)的光譜作為獨(dú)立數(shù)據(jù)預(yù)測CIE L*a*b*值，這兩點(diǎn)的光譜平均值作為該樣品的光譜值預(yù)測SSC及總酚（total phenolic，TP）含量。

1.3.4 理化指標(biāo)的測定

SSC：通過手持糖度儀測定，精確度為0.1 °Brix；L*、a*、b*：通過手持色差儀測定，L*值代表明度，a*值表示紅綠值，b*值表示黃藍(lán)值；TP含量：通過Fragoso等[26]所述方法測定。將葡萄皮用液氮冷凍研磨，取0.2 g研磨后果皮樣品于20 mL乙醇酸溶液（1% HCl-96%乙醇（17∶3，V/V）中40 ℃超聲浸提40 min。浸提后溶液于13 710×g離心5 min，上清液用乙醇酸溶液定容至50 mL，用紫外分光光度計(jì)在280 nm波長處測定吸光度。用2.0～20.0 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，TP含量數(shù)據(jù)表示為每千克鮮樣中的沒食子酸質(zhì)量（g/kg）。

1.3.5 儀器穩(wěn)定性測試

為測試本儀器的穩(wěn)定性，選取3 個(gè)葡萄樣本，每個(gè)樣本75 min內(nèi)每15 min測定一次光譜X（每個(gè)樣本共測定6 次），按下式計(jì)算每個(gè)樣本的光譜值平均相對誤差百分比：

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定性測試結(jié)果

3 個(gè)樣本的平均相對誤差百分比的平均值如圖5所示，同一樣本在75 min內(nèi)多次測定的平均相對誤差在400～1 100 nm內(nèi)均不超過10%，證明了儀器中包括光源、光譜儀在內(nèi)的硬件的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖 5 3 個(gè)葡萄樣品75 min內(nèi)每15 min測定的光譜平均相對誤差Fig. 5 Mean relative spectral errors of three grape samples measured for every 15 minutes in 75 minutes

2.2 兩種葡萄品質(zhì)最小二乘-支持向量機(jī)回歸建模結(jié)果

每個(gè)樣品的原始近紅外光譜共2 048 個(gè)波長數(shù)據(jù)點(diǎn)（覆蓋波長范圍為347.29～1 131.22 nm），由于前后段噪聲較大，在建模及預(yù)測分析中去除了前141及最后的80 個(gè)波長數(shù)據(jù)點(diǎn)保留了400.29～1 100.05 nm共1 827 個(gè)波長的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。利用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換和平均窗口平滑降低系統(tǒng)噪聲及散射造成的干擾[27]。預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)利用基于徑向基核函數(shù)的LS-SVM建立模型，通過留一交叉驗(yàn)證的最小預(yù)報(bào)誤差平方加和確定模型的最佳參數(shù)γ和α的值[28]。模型的結(jié)果如表1所示。

表 1 2 種葡萄品質(zhì)LS-SVM回歸建模結(jié)果Table 1 LS-SVM regressions for grape quality parameters

本系統(tǒng)能對“美人指”葡萄及“白玉霓”葡萄的a*值、SSC及TP含量有較好的建模效果，建模集的R2均高于0.90；交叉驗(yàn)證的R2cv略低于相應(yīng)模型的建模集決定系數(shù)Rc2，交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross-validation，RMSECV）略高于相應(yīng)模型的交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC），但結(jié)果相差不大，證明模型沒有過擬合，同時(shí)證明系統(tǒng)中選用LS-SVM作為建模模型的可靠性，且因子數(shù)越少時(shí)，模型計(jì)速度越快。由于成熟的“美人指”葡萄呈紅色的手指狀長條形，成熟的“白玉霓”葡萄呈黃色的圓球形，證明該系統(tǒng)的硬件選擇及樣品池的設(shè)計(jì)能夠滿足不同形狀大小的葡萄的需要?！懊廊酥浮逼咸哑贩Na*值、SSC及TP含量LS-SVM模型的RMSEC分別為2.16、0.84 °Brix、0.19 g/kg，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用要求。

2.3 兩種葡萄模型預(yù)測結(jié)果

從江蘇南京八卦洲采集“美人指”及“白玉霓”兩個(gè)品種的葡萄漿果各70 粒，對裝置進(jìn)行外部驗(yàn)證。通過儀器獲得每個(gè)葡萄漿果的光譜值，并調(diào)用儀器內(nèi)置模型預(yù)測出該樣本的理化參數(shù)值，同時(shí)與理化方法測得的參考值進(jìn)行比較，結(jié)果如表2及表3所示。

表 2 2 種葡萄模型預(yù)測結(jié)果Table 2 Model prediction of grape quality parameters

表 3 驗(yàn)證集的理化測定值及模型預(yù)測誤差Table 3 Reference values and prediction errors of prediction set for each parameter

外部驗(yàn)證的預(yù)測集結(jié)果顯示，兩個(gè)品種的各品質(zhì)指標(biāo)能夠被較好的預(yù)測，其中，“美人指”的a*值、SSC、TP含量3 個(gè)指標(biāo)的預(yù)測決定系數(shù)（R2p）分別為0.81、0.85、0.85，預(yù)測根均方誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）分別為3.15、1.39 °Brix、0.24 g/kg；“白玉霓”3 個(gè)指標(biāo)的R2p分別為0.83、0.90、0.83，RMSEP分別為0.78、1.56 °Brix、0.22 g/kg。Cozzolino[29]、Ferrer-Gallego[30]等曾提出當(dāng)預(yù)測集標(biāo)準(zhǔn)差均方根誤差的比值（the ratio of standard deviation to standard error of prediction set，RPD）低于1.4時(shí)，模型不可靠；當(dāng)RPD值在1.4～2之間時(shí)，模型相對可靠；當(dāng)RPD高于2時(shí)，證明該模型可被認(rèn)為是一個(gè)較好的模型。如表2所示，所有模型的RPD值均高于1.4，兩個(gè)葡萄品種的a*值、SSC、TP含量3 個(gè)指標(biāo)均能被很好地預(yù)測，模型RPD均高于2，其中“白玉霓”的SSC模型的RPD高達(dá)3.07。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（表3），對于L*、a*、b*的預(yù)測，“美人指”品種的最小預(yù)測誤差為0.14，“白玉霓”品種的最小預(yù)測誤差為0.00；對于SSC的預(yù)測，“美人指”品種的最小預(yù)測誤差為0.03 °Brix，“白玉霓”品種的最小預(yù)測誤差為0.04 °Brix；對于TP的預(yù)測，“美人指”品種的最小預(yù)測誤差為0.00 g/kg，“白玉霓”品種的最小預(yù)測誤差為0.00 g/kg。外部驗(yàn)證結(jié)果證明本儀器可滿足不同類型葡萄果粒的品質(zhì)檢測需求。

3 結(jié) 論

本研究開發(fā)的葡萄專用小型近紅外檢測儀器能夠滿足多種類型葡萄果粒的測定需求，對于不同種類的葡萄能夠根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的測定參數(shù)，同時(shí)軟件數(shù)據(jù)存儲的設(shè)計(jì)能夠更便于日后模型更新的需求，充分展現(xiàn)一機(jī)多用。對于2 個(gè)不同品種葡萄實(shí)驗(yàn)表明本系統(tǒng)能夠?qū)ζ咸训谋砻骖伾?、SSC、TP含量完成較好的建模效果，外部驗(yàn)證結(jié)果顯示模型對 “美人指”a*值、SSC、TP含量3 個(gè)指標(biāo)的RMSEP分別為3.15、1.39 °Brix、0.24 g/kg；模型對“白玉霓”3 個(gè)指標(biāo)的RMSEP分別為0.78、1.56 °Brix、0.22 g/kg。本研究為果蔬專用型近紅外儀器的開發(fā)提供了方法參考。