鷹嘴豆非淀粉多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)表征

胡愛軍，李 楊，鄭 捷,*，李 志，馬立新

（1.天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

鷹嘴豆為豆科鷹嘴豆屬（Leguminosae）植物，在我國的新疆、甘肅、山西、河北等省具有極為豐富的資源。鷹嘴豆是一種高營養(yǎng)價(jià)值食用豆，富含多種植物蛋白和氨基酸、維生素、粗纖維及鈣、鎂、鐵、黃酮類物質(zhì)、甾體類化合物、脂肪酸類化合物[1-2]等生物活性成分和抗氧化活性成分[3]，具有降低人體血液中膽固醇含量[4]、有效控制血糖[5-6]、抑制瘤細(xì)胞生長、改善腸道功能[7]等作用，而且已有研究表明鷹嘴豆多糖具有抗疲勞的功效[8]，因此對(duì)鷹嘴豆多糖的提取、分離、純化研究必不可少。

目前雖然有關(guān)鷹嘴豆多糖的提取已有相關(guān)報(bào)道[9]，但均未除去多糖中的淀粉部分并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分離與純化，而有關(guān)其非淀粉多糖的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過酶處理與柱分離得到鷹嘴豆非淀粉中性和酸性多糖并對(duì)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行分析，旨在對(duì)其多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究與分析，并為鷹嘴豆多糖資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆（產(chǎn)自新疆木壘縣）。

耐高溫淀粉酶、高轉(zhuǎn)化率糖化酶、乙醇、正己烷、濃硫酸、氫氧化鈉、葡萄糖、氫氧化鈣、正丁醇、醋酸、鹽酸、甲醇、二乙胺基乙基纖維素（diethylaminoethyl cellulose，DEAE）、葡聚糖凝膠、硼氫化鈉、三氟乙酸等均為分析純；單糖標(biāo)品：鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ102型微型植物粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；752型紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LGJ0.5型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；層析柱（1 cm×17.5 cm） 上海滬西分析儀器廠；CTO-20A柱溫箱、RLO-10Z示差折光檢測(cè)器 日本島津公司；Lab Alliance 525高效液相色譜儀 美國蘭博公司；HW·SY21-K電熱恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司；PHS-3BW型pH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；VECTOR 22傅里葉變換紅外光譜儀 布魯克儀器公司；Phlips XL-3掃描電子顯微鏡 日本電子公司。

1.3 方法

1.3.1 鷹嘴豆非淀粉多糖的制備

干燥的鷹嘴豆種子經(jīng)微型粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩，以正己烷作為溶劑回流12 h進(jìn)行脫脂處理，超聲功率180 W、料液比1∶15（g/mL）、提取時(shí)間45 min進(jìn)行超聲提取，離心取上清液，獲得鷹嘴豆粗多糖溶液。將制得的鷹嘴豆粗多糖溶液加入耐高溫α-淀粉酶，酶添加量12 U/g，pH 6、93 ℃處理0.5 h之后，加入高轉(zhuǎn)化率糖化酶，酶添加量300 U/g、pH 4.5、60 ℃處理4 h；取上清液真空濃縮，以Sevag法進(jìn)行脫蛋白處理，重復(fù)8 次，離心獲得上清液；將上清液中按1∶4的比例加入95%乙醇溶液，4 ℃醇沉24 h，離心，真空干燥獲得非淀粉多糖粉末（經(jīng)碘-碘化鉀反應(yīng)檢測(cè)表明粗多糖中不含淀粉）。

1.3.2 鷹嘴豆非淀粉多糖的柱分離純化[10-11]

將非淀粉多糖粉末加入蒸餾水溶解，進(jìn)行DEAE-52纖維素柱純化，分別用蒸餾水和不同濃度的氯化鈉溶液為洗脫液，分步收集，苯酚-硫酸法檢測(cè)，分別獲得鷹嘴豆中性粗多糖和酸性粗多糖；將獲得的中性粗多糖和酸性粗多糖組分用Sephadex G-75凝膠柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，以三蒸水洗脫，凍干后分別獲得中性多糖和酸性多糖粉末。

1.3.3 紫外光譜測(cè)定[12]

取純化后的中性多糖、酸性多糖配成1 mg/mL的溶液，以蒸餾水作空白對(duì)照，通過紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描。

1.3.4 氣相色譜測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的制備[13]

各取2.0 mg巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、山梨糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖8 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品置于安瓿瓶中，各加入30 mg硼氫化鈉（NaBH4），2.0 mL蒸餾水，放置1.5 h，60 ℃減壓蒸發(fā)至干，再加入0.1%鹽酸-甲醇溶液2 mL，振蕩溶解，減壓蒸發(fā)至干，重復(fù)4 次，剩余物質(zhì)置于105 ℃烘箱加熱15 min，加入0.5 mL吡啶和0.5 mL醋酸酐，封管，沸水浴中反應(yīng)1 h。將水相過膜，取3 μL進(jìn)樣。

1.3.4.2 鷹嘴豆非淀粉多糖衍生物的制備

稱取鷹嘴豆中性多糖、酸性多糖樣品各10 mg置于安瓿瓶中，加入1.0 mL的2 mol/L三氟乙酸溶液，封管，置于烘箱120 ℃水解4 h，冷卻收集水解液，過濾，60 ℃減壓濃縮至干，水解后樣品加入30 mg NaBH4和2 mL蒸餾水，按1.3.4.1節(jié)中方法對(duì)非淀粉多糖進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.4.3 氣相色譜條件[14]

毛細(xì)管色譜柱OV-1701（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；氫火焰離子化檢測(cè)器；H2流量40 mL/min，空氣流量450 mL/min，N2流量34 mL/min；程序升溫：初溫150 ℃，保留1 min，以10 ℃/min升溫至200 ℃，保留10 min，繼續(xù)以5 ℃/min升溫至220 ℃，保留5 min，最后以1.5 ℃/min升溫至終溫度240 ℃，并保留20 min。進(jìn)樣口溫度240 ℃；檢測(cè)器溫度280 ℃；進(jìn)樣量3 μL；分流比10∶1。

1.3.5 紅外光譜測(cè)定[15]

各取1 mg的中性多糖與酸性多糖，分別與150 mg溴化鉀粉末在瑪瑙研缽中研磨，研磨至極細(xì)粉末后壓片。在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。分辨率：4 cm-1，掃描次數(shù)：32 次，記錄紅外光譜圖。

1.3.6 掃描電鏡觀察

選取適量干燥的鷹嘴豆中性多糖和鷹嘴豆酸性多糖樣品用導(dǎo)電膠粘于載物臺(tái)上，置于離子濺射儀內(nèi)鍍一層導(dǎo)電金膜后，用掃描電鏡觀察，并于不同倍數(shù)下拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及曲線繪制均使用OriginPro 8處理，氣相色譜檢測(cè)結(jié)果使用儀器自帶軟件處理，紅外數(shù)據(jù)處理使用OMNIC軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-52纖維素柱純化結(jié)果

圖 1 DEAE-52洗脫曲線Fig. 1 DEAE-52 elution curve

從洗脫曲線（圖1）可以看出，在該洗脫條件下得到4 個(gè)尖銳的洗脫峰，分別是以蒸餾水及0.05、0.1、0.2 mol/L NaCl溶液洗脫得到。這是由于鷹嘴豆多糖在以蒸餾水作洗脫溶液時(shí)，有些不帶電或者帶有很弱的負(fù)電荷，不能被DEAE-52纖維素吸附或者吸附很弱，首先隨著蒸餾水洗脫下來，即是圖中的第1個(gè)洗脫峰。而另外帶有負(fù)電荷的部分，被DEAE-52纖維素所吸附，必須用比DEAE-52吸附更強(qiáng)的Cl-、OH-來洗脫，才能將其洗脫下來。由洗脫曲線可以看出，在以不同濃度NaCl洗脫時(shí)均能得到或高或低的洗脫峰，考慮到節(jié)省時(shí)間和節(jié)約成本等因素，選取第1個(gè)峰位置與第4個(gè)峰位置進(jìn)行收集，即分別以蒸餾水和0.2 mol/L NaCl溶液作為洗脫液，洗脫下的多糖分別為鷹嘴豆中性粗多糖和鷹嘴豆酸性粗多糖[16]。

2.2 Sephadex G-75凝膠柱純化結(jié)果

圖 2 中性多糖（a）和酸性多糖（b）Sephadex G-75凝膠柱層析洗脫曲線Fig. 2 Elution curves of neutral polysaccharide (a) and acidic polysaccharide (b) on Sephadex G-75 column

由圖2可知，鷹嘴豆中性多糖經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱純化后得到兩個(gè)組分，由于第2個(gè)峰較小，考慮時(shí)間的問題，選取第1個(gè)大峰的對(duì)稱點(diǎn)收集[17]。鷹嘴豆酸性多糖經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱純化后得到3 個(gè)組分，由于第2、第3個(gè)峰較小，因此選取第1個(gè)峰的對(duì)稱點(diǎn)收集，將曲線上對(duì)稱部分的多糖合并，濃縮，冷凍干燥，備用。

2.3 紫外光譜分析

圖 3 中性多糖（a）和酸性多糖（b）紫外光譜圖Fig. 3 UV spectra of neutral polysaccharide (a) and acidic polysaccharide (b)

由圖3可見，鷹嘴豆中性多糖和鷹嘴豆酸性在195 nm波長處有明顯的吸收峰，此為多糖的特征吸收峰；而在260 nm和280 nm波長處均無吸收峰，這表明兩種多糖均不含核酸、蛋白質(zhì)以及肽類等雜質(zhì)[18]。

2.4 氣相色譜分析結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜見圖4。由圖5可知，鷹嘴中性多糖的單糖組成主要有甘露糖（36.677%）、葡萄糖（31.349%）、半乳糖（20.984%），其次還含有一定量的阿拉伯糖、鼠李糖、及少量的巖藻糖和木糖[19]。以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)，其單糖組成的物質(zhì)的量比為鼠李糖∶巖藻糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖=2.48∶1∶3.92∶0.87∶32.82∶18.79∶28.06。鷹嘴酸性多糖的單糖組成主要有半乳糖（38.585%）、葡萄糖（20.669%）、甘露糖（14.28%），其次還含有一定量的鼠李糖、阿拉伯糖及少量的木糖和巖藻糖。以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)，其單糖組成的物質(zhì)的量比為鼠李糖∶巖藻糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖=2.22∶1.00∶3.92∶2.10∶5.92∶15.99∶8.57。

圖 4 標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜圖Fig. 4 GC chromatogram of standard monosaccharaides

圖 5 鷹嘴豆中性多糖（a）和酸性多糖（b）氣相色譜圖Fig. 5 GC chromatograms of chickpea neutral polysaccharide (a) and acidic polysaccharide (b)

2.5 紅外光譜分析結(jié)果

圖 6 中性多糖（a）和酸性多糖（b）的紅外光譜圖Fig. 6 FTIR spectra of neutral polysaccharide (a) and acidic polysaccharide (b)

如圖6所示，3 500～3 200 cm-1有一吸收較強(qiáng)的寬峰，此峰是O—H和C—H的伸縮振動(dòng)，為糖類物質(zhì)的特征吸收峰[20-22]，3 414 cm-1處的峰說明鷹嘴豆中性多糖存在明顯的分子間氫鍵。在3 000～2 800 cm-1和1 400～1 200 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰是糖類C—H伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)，可初步判斷該化合物為糖類化合物[23-25]。1 643 cm-1處出現(xiàn)吸收峰說明鷹嘴豆多糖有一定量的結(jié)晶水存在。1 200～1 000 cm-1出現(xiàn)的是吡喃糖環(huán)的醚鍵（C—O）和羥基吸收峰[26]。836 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，說明鷹嘴豆中性多糖含有α-型糖苷鍵[27]；從鷹嘴豆非淀粉酸性多糖的紅外光譜圖中可以分析出：在3 600～3 200 cm-1和3 000～2 800 cm-1處出現(xiàn)的兩組吸收峰是糖的特征吸收峰。1 647 cm-1為羰基（—CHO）的C＝O伸縮振動(dòng)，1 418 cm-1出現(xiàn)的明顯峰為羧基（—COOH）的C—O伸縮振動(dòng)。1 200～1 000 cm-1之間的吸收峰是由兩種C—O鍵伸縮振動(dòng)所形成[28]。鷹嘴豆酸性多糖在1 075 cm-1處有一明顯的吸收峰，說明含有硫酸根。紅外光譜不存在1 616 cm-1的—NH2和—NH3+的特征吸收峰，說明不存在蛋白多糖，895 cm-1處出現(xiàn)一弱峰為吡喃環(huán)的β-端差向異構(gòu)的C—H變角振動(dòng)[29-30]。

2.6 掃描電鏡分析結(jié)果

圖 7 中性多糖掃描電鏡圖Fig. 7 SEM images of neutral polysaccharide

圖 8 酸性多糖掃描電鏡圖Fig. 8 SEM images of acidic polysaccharide

如圖7、8所示，通過掃描電鏡觀察鷹嘴豆中性多糖與鷹嘴豆酸性多糖的形貌，分別放大100 倍和500 倍，其掃描電鏡結(jié)果表明，鷹嘴豆中性多糖呈樹枝狀，鷹嘴豆酸性多糖呈現(xiàn)卷曲的片狀。

3 結(jié) 論

鷹嘴豆粗多糖經(jīng)除淀粉、除蛋白之后通過DEAE-52纖維素和Sephadex G-75凝膠柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化獲得鷹嘴豆非淀粉中性和酸性多糖。其在紫外波長195 nm處有明顯的峰而在260 nm和280 nm波長處均無吸收峰，這表明兩種多糖均不含核酸、蛋白質(zhì)以及肽類等雜質(zhì)；氣相色譜顯示兩種多糖的單糖組成相同，主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，主要區(qū)別在于木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖的物質(zhì)的量比的大小。中性多糖中葡萄糖含量是酸性多糖的3.27 倍；甘露糖含量是酸性多糖的5.54 倍，但是酸性多糖中木糖含量是鷹嘴豆中性多糖含量的2.41 倍。紅外光譜分析表明兩種多糖均含有糖類化合物的特征吸收峰且中性多糖中含有α-型糖苷鍵，酸性多糖中含有硫酸根。掃描電鏡分析知鷹嘴豆中性多糖呈現(xiàn)線性結(jié)構(gòu)，鷹嘴豆酸性多糖呈現(xiàn)卷曲的片狀結(jié)構(gòu)。