下肢缺血型糖尿病潰瘍大鼠模型的建立及評(píng)估＊

李文惠，柳國(guó)斌

全球目前約有 4.2億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2040年，患病人數(shù)將達(dá)到 6.42億［1］。糖尿病患者一生中發(fā)生潰瘍者達(dá)15%～20%［2］。糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）因其難治愈、經(jīng)濟(jì)壓力巨大、嚴(yán)重影響生活質(zhì)量等特點(diǎn)，已成為臨床上亟待解決的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。近20年來(lái)，有關(guān)DFU病理機(jī)制的研究方向逐漸向缺血性和神經(jīng)缺血性潰瘍轉(zhuǎn)變，65%以上DFU患者有下肢缺血癥狀，約是1990年的兩倍［3，4］。 與神經(jīng)性潰瘍相比，缺血性潰瘍復(fù)發(fā)率高，截肢風(fēng)險(xiǎn)翻倍，預(yù)后更差，然而目前尚缺乏缺血型潰瘍的基礎(chǔ)研究。所以，多層次、多領(lǐng)域探索糖尿病足發(fā)生發(fā)展機(jī)制尤為重要。

糖尿病足潰瘍動(dòng)物模型是實(shí)施該領(lǐng)域基礎(chǔ)研究的良好載體，目前有關(guān)糖尿病潰瘍的模型很多，大多是在糖尿病模型基礎(chǔ)上制造潰瘍。隨著疾病病理的變化，缺血型潰瘍模型的研究顯得尤為重要。該課題組在前期研究基礎(chǔ)上，充分結(jié)合糖尿病足的病理變化、臨床表現(xiàn)，建立了糖尿病缺血型下肢潰瘍的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并進(jìn)行了一系列觀察研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和材料 雄性SD大鼠40只，體重（180±10）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，其許可證號(hào)為SYXK（滬）2014-008。按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組各8只，即，糖尿病缺血型潰瘍模型組（DIU）、糖尿病潰瘍模型組（DU）、非糖尿病缺血型潰瘍模型組 （NIU）、非糖尿病潰瘍模型組（NU）及正常對(duì)照組（N）。 鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自Sigma公司，硫酸鋇、檸檬酸、枸櫞酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，血糖儀購(gòu)自羅氏公司，高脂飼料（基礎(chǔ)飼料73%、蔗糖4%、豬油20%、奶粉2%、膽固醇1%）購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SQL-5Q燙傷儀購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司，激光多普勒血流儀來(lái)源于上海中醫(yī)藥大學(xué)穆拉德中心。

1.2 模型構(gòu)建

1.2.1 糖尿病缺血型潰瘍模型制備 大鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周后，用1.5%STZ溶液（鏈脲佐菌素STZ+pH值為4.5的檸檬酸-枸櫞酸鈉緩沖液）按實(shí)驗(yàn)大鼠體重35 mg/kg的劑量腹腔注射。注射24 h后尾端采血隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L，穩(wěn)定3 d后復(fù)測(cè)隨機(jī)血糖仍>16.7 mmol/L，糖尿病模型制備成功。

糖尿病大鼠模型穩(wěn)定2周后，以3%戊巴比妥鈉按2 ml/kg腹腔注射麻醉，結(jié)扎離斷股動(dòng)脈及其主要分支，縫合前以青霉素溶液沖洗傷口。術(shù)畢利用激光多普勒血流儀檢測(cè)下肢血流情況。

血管結(jié)扎實(shí)驗(yàn)24 h后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，使用SQL-5Q燙傷儀面積4 cm2模具燙傷缺血下肢皮膚，參數(shù)設(shè)定壓力9.8 N，溫度90℃，接觸時(shí)間8 s。

1.2.2 其他模型制備 糖尿病潰瘍模型組 （DU）除不結(jié)扎血管外，其他處理過(guò)程與DIU組一致；非糖尿病缺血型潰瘍模型組（NIU）除不制備糖尿病模型外，其他處理過(guò)程與DIU組一致。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 模型相關(guān)指標(biāo) 糖尿病造模過(guò)程中觀察16只大鼠第1、7、14天的體重、血糖的變化；慢性潰瘍?cè)炷：?4 h組織病理學(xué)檢查，取潰瘍與正常皮膚交界處組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下檢查；并通過(guò)超聲多普勒血流儀直觀顯示下肢的血流灌注量變化。

1.3.2 創(chuàng)面宏觀指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物慢性潰瘍?cè)炷：?4 h、第5天、第10天創(chuàng)面的肉眼描述及創(chuàng)面第5天、第10天及第15天愈合率變化。

通過(guò)計(jì)算機(jī)利用Image J醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，沿潰瘍邊緣使用描記筆畫(huà)出其輪廓，計(jì)算像素面積；再用描記筆畫(huà)出標(biāo)尺上1 cm的線(xiàn)段，測(cè)出1 cm線(xiàn)段像素值，計(jì)算1 cm2的像素面積；潰瘍表面輪廓的像素面積除以1 cm2的像素面積，即為潰瘍創(chuàng)面表面積［5］。已愈合面積與初始潰瘍面積百分比即潰瘍創(chuàng)面愈合率。

潰瘍創(chuàng)面愈合率（%）=（初始潰瘍創(chuàng)面面積-觀察時(shí)間點(diǎn)潰瘍面積）/初始潰瘍創(chuàng)面面積×100%

1.3.3 模型微觀指標(biāo) 潰瘍組織造模后及第15天模型中終末糖基化產(chǎn)物（AGEs）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等相關(guān)細(xì)胞因子的含量變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料用構(gòu)成比表示，組內(nèi)比較用單因素方差分析；方差不齊者先校正方差；不服從正態(tài)分布者，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。取P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型相關(guān)指標(biāo)

2.1.1 模型穩(wěn)定性指標(biāo) 隨機(jī)分組后，16只糖尿病模型組（DM組）大鼠造模后逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦、毛發(fā)枯燥無(wú)光澤、對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少等癥狀。余只非糖尿病模型組（N組）大鼠精神良好、活動(dòng)靈活、反應(yīng)靈敏、毛發(fā)光潔。觀察時(shí)間以1周為一個(gè)觀察截點(diǎn)，包括糖尿病造模后（記為M1）、造模1周（記為M7）、造模2周（記為M14）。其中，血糖儀顯示血糖為“HI”時(shí)記為33.3 mmol/L。隨著病程發(fā)展，非糖尿病大鼠體重逐漸增長(zhǎng)，由M1時(shí)的（468.5±9.9）g 至 M14 的（493.72±4.6） g，血糖一直在6 mmol/L左右；而糖尿病模型大鼠體重逐漸減輕，由 M1 時(shí)的（367.52±8.5）g至 M14 的（357.72±5.2）g，血糖均＞16.7 mmol/L。糖尿病模型穩(wěn)定，與正常組差異很大。各組大鼠體重、血糖比較見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠血糖、體重變化

2.1.2 皮膚病理切片 大鼠皮膚燙傷后即刻可見(jiàn)皮膚蒼白、增厚或水皰。24 h后，剪取燙傷交界區(qū)皮膚，并行病理切片，經(jīng)HE染色，發(fā)現(xiàn)大鼠皮膚組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴隨毛囊、汗腺等皮膚附件破壞，燙傷為深度Ⅱ級(jí)，如圖2所示。燙傷24 h后麻醉下使用剪刀沿燙傷分界線(xiàn)將皮膚清除即完成潰瘍創(chuàng)面造模。

圖2 大鼠皮膚病理切片

2.1.3 下肢血流灌注量 按照固定測(cè)定區(qū)域，以5圖像/s的頻率，測(cè)定1 min的血流灌注量。取血管結(jié)扎側(cè)（患側(cè)）與非結(jié)扎側(cè)（對(duì)側(cè)）平均血流灌注量（PU），結(jié)果顯示患側(cè)血流灌注量為（55.98±12.63）PU，對(duì)側(cè)為（87.56±19.34）PU，具體如圖 3 所示。

圖3 大鼠下肢血流灌注量

2.2 創(chuàng)面宏觀指標(biāo)

2.2.1 創(chuàng)面肉眼描述 觀察潰瘍?cè)炷：?4 h的創(chuàng)面形態(tài)，非糖尿病潰瘍模型組（NU、NIU）創(chuàng)面顏色紅活干燥，表面分泌物少，創(chuàng)面周?chē)湛s較早，周邊不規(guī)則；糖尿病非缺血型潰瘍模型（DU）創(chuàng)面顏色偏暗，表面伴滲出物，形狀規(guī)則，創(chuàng)緣稍高，皮膚收縮出現(xiàn)較遲；糖尿病缺血型潰瘍模型組（DIU）創(chuàng)面顏色略淡于非缺血型模型組。造模第5天，普通潰瘍模型組 （NU、NIU）大鼠創(chuàng)面肉眼可見(jiàn)創(chuàng)面繼續(xù)收縮，表面干燥，伴新鮮肉芽生長(zhǎng)。DU和DIU組創(chuàng)面顏色、滲出、面積也逐漸改善。

2.2.2 創(chuàng)面愈合率 比較創(chuàng)面愈合過(guò)程中第5天、第 10天及第 15天時(shí) DIU、DU、NIU、NU四組模型潰瘍愈合率，其中正常組未制造潰瘍，故不列入比較。見(jiàn)表1。創(chuàng)面愈合過(guò)程三個(gè)等時(shí)間段內(nèi)創(chuàng)面愈合速度為 V5～10＞V10～15＞V0～5， 非糖尿病潰瘍組（NU、NIU）愈合速度高于糖尿病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 創(chuàng)面愈合率（%）

2.3 模型微觀指標(biāo) 分別在造模后（D0）及創(chuàng)面愈合第15天（D15）采用眼眶采血方式取大鼠靜脈血，離心機(jī)分離血清通過(guò)ELISA檢測(cè)血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）和晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的含量。見(jiàn)表2。

相比正常對(duì)照組（N），各潰瘍組（DIU、DU、NIU、NU）表現(xiàn)為生長(zhǎng)因子表達(dá)偏低，糖代謝產(chǎn)物偏高的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；非糖尿病潰瘍組 （NU、NIU）總體表達(dá)水平較糖尿病潰瘍組（DU、DIU）細(xì)胞因子顯著性偏高，AGEs顯著性偏低 （P<0.05），且DU組較DIU組也表現(xiàn)為同樣趨勢(shì)；隨著模型時(shí)間進(jìn)程，各組的生長(zhǎng)因子表現(xiàn)下降趨勢(shì)，AGEs表現(xiàn)為上升趨勢(shì)。

3 討論

糖尿病足潰瘍的發(fā)生機(jī)制與愈合條件尚不清楚，創(chuàng)建簡(jiǎn)易、可重復(fù)性高及成本低廉的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，可以為明確發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)診斷預(yù)后標(biāo)志物、篩選評(píng)價(jià)藥物提供良好的載體。

3.1 糖尿病模型的建立 目前糖尿病基因敲除及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型發(fā)展迅速，但因其價(jià)格高昂，高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）注射的方式受到大批量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)者的首選，因不同批次品種的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耐受性的問(wèn)題，高脂飼料喂養(yǎng)的時(shí)間及STZ注射劑量的選擇仍存在較多爭(zhēng)議。該課題組經(jīng)過(guò)前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的摸索，通過(guò)對(duì)造模后大鼠飲水量、飲食量、血糖、體重的檢測(cè)，總結(jié)出高脂飼料喂養(yǎng)8周、STZ 35 mg/kg腹腔注射的方式培養(yǎng)出的糖尿病動(dòng)物模型更為穩(wěn)定，因此該次實(shí)驗(yàn)中采取此種造模方式，造模中監(jiān)測(cè)了血糖和體重，符合糖尿病體重逐漸減輕和隨機(jī)血糖超過(guò)16.7 mmol/L的特點(diǎn)。

表2 模型生長(zhǎng)因子及相關(guān)產(chǎn)物變化（μmol/L）

3.2 糖尿病潰瘍模型的建立 糖尿病潰瘍?cè)炷７绞蕉嗖扇≈苯蛹舫?、壓力性模型及燙傷模型［6］，直接剪除部分皮膚的急性創(chuàng)傷不符合慢性潰瘍愈合的機(jī)制，壓力因素造模方式的可控性不強(qiáng)，相比較而言，恒定燙傷條件下的深Ⅱ度燙傷具備操作簡(jiǎn)易、可控性強(qiáng)及可重復(fù)性高的優(yōu)勢(shì)；深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面也屬于慢性創(chuàng)面，更適宜研究糖尿病潰瘍延遲愈合的機(jī)制。此次造模中經(jīng)過(guò)前期不斷摸索，最終參數(shù)設(shè)定為壓力9.8 N，溫度90℃，接觸時(shí)間8 s，以便得到深Ⅱ度燙傷的創(chuàng)面，并通過(guò)檢驗(yàn)燒傷深度的金標(biāo)準(zhǔn)-組織學(xué)檢測(cè)［7，8］進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)皮膚組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴隨毛囊、汗腺等附件破壞，符合深Ⅱ度燙傷。

3.3 下肢慢性缺血模型的建立 糖尿病下肢缺血屬于慢性缺血，但慢性缺血的條件、方式尚無(wú)公認(rèn)方式，目前肢體缺血模型仍以急性缺血為主。大鼠肢體血供豐富，存在大量吻合支［9］，后肢缺血模型建立中需要結(jié)扎股動(dòng)脈及其分支，包括腹壁淺動(dòng)脈、旋髂淺動(dòng)脈及陰部外動(dòng)脈，術(shù)后血流灌注量明顯下降，激光多普勒（LDPI）是評(píng)估模型缺血狀態(tài)的一種相對(duì)客觀準(zhǔn)確的方式［10］，能通過(guò)直觀指標(biāo)判斷模型質(zhì)量。該實(shí)驗(yàn)中結(jié)扎血管側(cè)的血流灌注量明顯低于對(duì)側(cè)，表明缺血模型建立成功。

3.4 細(xì)胞因子與創(chuàng)面愈合 創(chuàng)面愈合是一個(gè)涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及生長(zhǎng)因子的復(fù)雜過(guò)程，其中纖維細(xì)胞組織、新生血管是肉芽組織重要組成部分。糖尿病足潰瘍屬于慢性潰瘍，愈合周期超過(guò)3個(gè)月，處于一種缺乏炎癥反應(yīng)、修復(fù)細(xì)胞“失活”或“休眠”的狀態(tài)。造模后觀察了不同模型組血管及上皮化相關(guān)的細(xì)胞因子，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （bFGF）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF），以反應(yīng)創(chuàng)傷愈合相關(guān)細(xì)胞的狀態(tài)；另外晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的積累能反應(yīng)糖尿病過(guò)程的進(jìn)展。VEGF能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮增殖、遷移、加速新生血管形成［11］，愈合過(guò)程中VEGF表達(dá)下調(diào)直接影響慢性創(chuàng)面的愈合進(jìn)程。PDGF能夠刺激組織修復(fù)過(guò)程的多種細(xì)胞遷移和增殖，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成、分泌。創(chuàng)面肉芽組織產(chǎn)生及上皮化過(guò)程是創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵階段，也需要大量bFGF、EGF的參與。代謝組學(xué)研究表明［12］糖尿病大鼠在潰瘍組織愈合過(guò)程中的成纖維細(xì)胞增殖和毛細(xì)血管增生都明顯弱于非糖尿病組，并直接影響潰瘍愈合。研究表明，糖尿病大鼠創(chuàng)面VEGF的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組大鼠，且表達(dá)明顯滯后。由于缺血肢體內(nèi)VEGF基因表達(dá)減少，引起糖尿病足閉塞血管周?chē)鷤?cè)支血管明顯減少，側(cè)支代償不足，缺血性潰瘍持續(xù)進(jìn)展且難以愈合，這可能是引起糖尿病足潰瘍的重要原因。該實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)糖尿病模型中的血管、上皮化相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)明顯低于非糖尿病創(chuàng)面，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)為修復(fù)細(xì)胞“失活”的狀態(tài)，并且隨著創(chuàng)面愈合進(jìn)程的發(fā)展仍表現(xiàn)出生長(zhǎng)因子不足的狀態(tài)，符合糖尿病潰瘍的變化規(guī)律。糖尿病模型中，缺血型較非缺血型表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明缺血因素影響生長(zhǎng)因子表達(dá)；糖尿病缺血型潰瘍組織中促進(jìn)血管生成的正向調(diào)節(jié)因子-血管生成抑制素結(jié)合蛋白降低，提示缺血環(huán)境影響血管生成［13］，而動(dòng)脈結(jié)扎模型前3 d以缺血型損傷為主要特征，3～5 d 出現(xiàn)代償［14］，創(chuàng)面周?chē)难鞴嘧⒉蛔?，可能?dǎo)致與缺血肢體內(nèi)相關(guān)生長(zhǎng)因子基因表達(dá)降低；此部分?jǐn)?shù)據(jù)與其他研究數(shù)據(jù)存在一定分歧，今后會(huì)進(jìn)一步探討。糖尿病模型中AGEs的蓄積明顯高于非糖尿病組，表示糖過(guò)量積累；具有細(xì)胞毒性的AGEs大量累積，會(huì)誘導(dǎo)血管損傷、組織功能紊亂，引起成纖維細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致生長(zhǎng)因子的減少，阻礙內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

綜上所述，該次實(shí)驗(yàn)摸索的糖尿病大鼠下肢缺血型潰瘍模型，高脂飼料聯(lián)合STZ注射符合2型糖尿病發(fā)病過(guò)程，深Ⅱ度燙傷模擬了糖尿病慢性潰瘍難愈的過(guò)程，但結(jié)扎血管創(chuàng)造的后肢缺血模型不太符合慢性缺血的過(guò)程，希望能進(jìn)一步摸索條件?？偟膩?lái)說(shuō)，此次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂芍貜?fù)性高，操作簡(jiǎn)單，值得臨床進(jìn)一步驗(yàn)證與推廣。